苦參皮軟膏的制備及其對足癬致病菌的抑制作用研究

許玲玲 曹穎堃 楊曉東 易文

中醫稱足癬為臭田螺、爛腳丫、腳氣等, 是一種常見的感染性皮膚病, 世界上大部分地區發病率為18%～39%［1］, 主要是由紅色毛癬菌、絮狀表皮癬菌、須癬毛癬菌等淺部真菌引起［2-6］, 臨床中常見真菌的混合感染。足癬患者足部還容易被金黃色葡萄球菌等細菌感染［7］。患者足部常出現干燥、脫屑、皸裂、水皰、糜爛等, 伴有瘙癢、疼痛等癥狀, 臨床上常分為水皰鱗屑型、角化過度型和浸漬糜爛型［8-10］。西醫治療主要采取抗真菌藥物, 雖有療效, 但易產生耐藥性, 停藥后易復發。中醫藥治療足癬以外治為主, 療效較好, 不良反應小且價格低廉［11］。姜鑒航等［12］通過對近40 年發表的中藥外用治療淺部真菌病的相關文獻分析, 發現出現頻次最多的中藥是苦參, 最常見的藥物組合有苦參和白鮮皮?？鄥⒁蚱渚哂星鍩嵩餄瘛⒖咕鷼⑾x功效, 多外用于治療濕疹、濕瘡、足癬等皮膚病。苦參堿、氧化苦參堿是苦參中最主要的成分［13］。白鮮皮在臨床上常用于足癬、疥癬、蕁麻疹等慢性頑固性皮膚病的治療, 研究表明其具有抗炎、抗真菌等作用［14］。中醫藥治療足癬多用中藥泡洗劑, 作用時間短, 如果將中藥泡洗劑和中藥藥膏聯合應用于治療足癬, 作用時間長,效果更好。臨床上, 治療足癬的中藥軟膏劑不是很多,本實驗對苦參皮軟膏的制備工藝及其對足癬的致病菌抑制作用進行了研究, 為開發和應用苦參皮軟膏奠定基礎。

1 材料與菌種

1.1 實驗儀器 DHP-9052 型電熱恒溫培養箱(上海和呈儀器制造有限公司)、LDZX-75KBS 型號高壓滅菌鍋(上海楚柏實驗室設備有限公司)、SCIENTZ-192 高通量組織研磨器(寧波新芝ENTZ 生物科技股份有限公司)、賽默飛世爾U3000 高效液相色譜、數顯恒溫水浴鍋(常州恒溫儀器制造有限公司)等。

1.2 受試菌種 須癬毛癬菌(Trichophyton mentagrophytes)、石膏樣小孢子菌(Microsporum gypseum)、絮狀表皮癬菌(Epidermophyton floccosum)、犬小孢子菌(Microsporum canis)和紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)標準株, 購于中國醫學科學院皮膚病研究所；金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、綠膿桿菌(P.Aeruginosa)和大腸桿菌(Escherichia coli)標準株由金華職業技術學院基礎醫學實驗中心提供。

1.3 藥材和試劑 經金華職業技術學院吳遠文副教授鑒定, 在藥店購買的苦參、白鮮皮分別為豆科植物苦參(Sophora flavescens Ait.)的干燥根、蕓香科植物白鮮(Dictamnus dasycarpus Turcz.)的干燥根皮?？鄥A標準品、氧化苦參堿購于中國藥品生物制品鑒定所(批號分別為110805-202109、110780-202108)。色譜純乙腈(北京京科瑞達科技有限公司)、乙醇、液體石蠟、三乙醇胺和硬脂酸等為分析純等。

2 方法與結果

2.1 苦參皮軟膏的制備 稱取苦參和白鮮皮粗粉各50.00 g, 加入95%乙醇800 ml, 浸泡30 min 后, 超聲提取30 min, 抽濾, 濾液減壓回收溶劑, 濃縮成膏狀, 制成每克浸膏相當于含生藥3.2 g, 得到白鮮皮和苦參的提取物稠膏。

稱取液體石蠟8 g、羊毛脂5 g、單硬脂酸甘油酯4 g、白凡士林3 g 和硬脂酸12 g 置于一個燒杯中, 置于恒溫80℃的水浴鍋中, 加熱融化, 攪拌均勻, 作為油相；另稱取三乙醇胺0.4 g、甘油7.5 g 和56 g 蒸餾水放入另一個燒杯中, 保持恒溫80℃, 混合均勻, 作為水相。將油相邊攪拌邊加入水相中, 邊攪拌邊加入提取物稠膏3 g 和用少許95%乙醇溶解的防腐劑羥苯乙酯0.3 g, 繼續攪拌, 待溫度降至室溫, 加入佛手油2 滴,攪拌均勻, 分裝, 研制成有香味的黃色質地細膩的苦參皮軟膏。

2.2 苦參皮軟膏含量測定

2.2.1 供試品溶液的制備 取苦參皮軟膏5 g, 精密稱重, 精密加入濃氨1 ml、氯仿25 ml, 密塞, 于80℃水浴中超聲提取15 min, 放至室溫, 然后放入冰箱冷凍20 min, 取出抽濾, 濾液濃縮至干, 殘渣加乙醇溶解, 轉移至5 ml 容量瓶中, 定容至刻度。進樣前用0.45 μm的微孔濾膜過濾。

2.2.2 對照品的制備 精密稱取苦參堿13.5 mg、氧化苦參堿標準品7 mg、加乙醇溶解, 轉移至25 ml 容量瓶中, 用乙醇定容至刻度。制成每1 毫升含苦參堿540 μg 和氧化苦參堿280 μg 對照品混合溶液。

2.2.3 高效液相色譜法(HPLC)色譜條件 賽默飛Syncronis 色譜柱C18(4.6 mm×250 mm, 25 μm), 流動相為乙腈-無水乙醇-2%磷酸溶液(81∶10∶9), 檢測波長為220 nm, 柱溫25℃；進樣量20 μl。

2.2.4 線性關系考察 分別精密吸取對照品混合溶液1.00、2.00、4.00、5.00、10.00 ml 放入5 個10 ml容量瓶中, 用乙醇定容至刻度。進樣, 測峰面積, 以標準品的濃度(X 軸)、對峰面積(Y 軸)作標準曲線, 苦參堿的線性回歸方程：Y=0.3567X-0.0872, r2=0.9997,線性范圍54～540 μg/ml；氧化苦參堿的回歸方程：Y=0.2753X-0.0148, r2=0.9998, 線性范圍28～280 μg/ml。標準品和供試品溶液的HPLC 圖分別見圖1, 圖2。

圖1 苦參堿和氧化苦參堿的HPLC 圖

圖2 供試品溶液的HPLC 圖

2.2.5 穩定性試驗 分別于第0、2、4、8、12 h, 精密吸取供試品溶液20 μl, 進樣, 測得5 次苦參堿和氧化苦參堿峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為1.33%、0.56%, 說明樣品溶液在12 h 內穩定。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取供試品溶液20 μl, 連續6 次進樣, 測得6 次的苦參堿、氧化苦參堿峰面積的RSD 分別為1.12%、0.83%, 說明精密度良好。

2.2.7 重復性試驗 稱取苦參皮軟膏5 份, 平行制備供試液, 測得5 份樣品中苦參堿、氧化苦參堿含量的RSD 分別為4.76%、4.05%, 說明該方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 稱取已知含量的苦參皮軟膏5 份, 每份約5 g, 精密稱定, 每份分別精密加入2.00 ml對照品混合溶液, 按照供試液的制備方法制備, 測定含量。結果表明, 苦參堿的平均回收率為94.23%, RSD為4.81%(n=5)；氧化苦參堿的平均回收率為103.44%,RSD 為4.51%(n=5)。說明該方法準確率高。

2.2.9 苦參堿的含量測定 精密吸取供試品溶液20 μl, 測定苦參皮軟膏中苦參堿和氧化苦參堿的含量,實驗重復3 次, 計算平均含量。見表1。

表1 苦參皮軟膏中苦參堿、氧化苦參堿的含量(n=3, %)

2.3 苦參皮軟膏的穩定性實驗 將苦參皮軟膏放在溫度35±2℃、相對濕度70%±5%的環境下, 分別于第1、2、3、6 月末時取樣觀察檢測。結果表明, 在這6 個月內, 黃色軟膏色澤均一、質地細膩, 無發霉變質, 無油水分離, 有效成分的含量無顯著變化, 說明該軟膏性質非常穩定。

2.4 苦參皮軟膏抑菌活性實驗(抑菌環法)

2.4.1 供試品的制備 稱取4 份復方苦參皮軟膏各5 g, 分別放入4 個無菌小燒杯中, 一份不加水稀釋, 其余3 份分別加蒸餾水稀釋成1∶10、1∶20、1∶30 的軟膏稀釋液。

2.4.2 試驗樣片的制備 取處理好的干燥無菌濾紙片(孔徑5 mm)放入無菌平面皿上, 用無菌棉拭子蘸取供試品均勻涂布在濾紙上, 置于無菌室晾干。

2.4.3 陰性對照樣片的制備 將無菌干燥濾紙片(孔徑5 mm)放入無菌平面皿內, 用無菌棉拭子蘸取空白基質涂布在濾紙上, 晾干后備用。

2.4.4 菌懸液的制備 將紅色毛癬菌、犬小孢子菌、須癬毛癬菌、石膏樣小孢子菌和絮狀表皮癬菌分別接種于瓊脂培養基, 置于26℃恒溫箱培養2 周, 將綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別接種于培養基,置于37℃培養18 h。挑取已轉種活化的菌塊, 置于組織研磨器中加無菌生理鹽水研磨均勻, 在震蕩器上震蕩1 min 后, 將菌懸液濃度調節到(1～6)×106cfu/ml。

2.4.5 抑菌試驗 用無菌棉拭子蘸取制備好的菌懸液, 在培養基平板表面涂沫均勻, 然后干燥5 min。用無菌鑷子將樣片放在每個平板表面上, 蓋好。試驗菌如果是紅色毛癬菌等真菌時, 將培養皿置于26℃培養1 周；如果試驗菌是綠膿桿菌等細菌時, 于37℃培養18 h。然后觀察結果, 見圖3。試驗重復3 次, 結果表明,軟膏的稀釋液對各試驗菌的抑制作用非常弱, 因此只測量軟膏對各試驗菌抑菌環的直徑(包括濾紙片), 計算平均直徑。見表2, 表3。

表2 苦參皮軟膏對試驗真菌的抑菌圈直徑(n=3, mm)

表3 苦參皮軟膏對試驗細菌的抑菌圈直徑(n=3, mm)

圖3 苦參皮軟膏及其稀釋液的抑菌效果

3 討論

因與其他基質相比, O/W 軟膏基質具有膏體細膩、易涂抹、易清洗等優點, 本實驗通過多次實驗, 最終采用乳化法研制成O/W 型苦參皮軟膏。桂蜀華等［15］研究表明苦參堿對絮狀表皮癬菌、石膏樣小孢子菌、紅色毛癬菌有抑制作用。孫磊等［16］研究發現苦參堿對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌具有一定抑菌作用。因此,本實驗以苦參堿和氧化苦參堿為指標, 測定苦參皮軟膏中有效成分的含量, 為苦參皮軟膏的質量控制奠定基礎。通過體外抑菌試驗, 結果表明苦參皮軟膏對絮狀表皮癬菌、紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、石膏樣小孢子菌、犬小孢子菌都有抑制作用, 對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌也有抑制作用。說明苦參皮軟膏對引起足癬的致病菌有抑制作用, 為進一步開發苦參皮軟膏應用于臨床治療足癬提供理論依據。