?；悄懰徕c誘導的急性壞死性胰腺炎小鼠腸屏障功能的變化

陳逸飛 孫思慎 張堯 周春華 鄒多武

上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院消化內科,上海 200025

SAP是一種伴有胰腺或胰周組織壞死及多器官功能衰竭的疾病,常合并腸屏障功能損傷,從而導致疾病加重,死亡率升高[1]。動物模型是研究SAP病理生理機制及治療靶點的重要工具,其中胰膽管逆行注射?；悄懰徕c是建立急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)動物模型的方法之一,該方法模擬了臨床上膽源性胰腺炎的發病過程,具有建模方便、成功率高且模型穩定性好的特點[2]。但該方法所用動物多為Sprague-Dawley大鼠[3-6],而大鼠在飼養條件、生長發育及基因編輯方面劣于小鼠[7],有一定的局限性。小鼠由于體積小、胰膽管細,手術逆行插入操作難度大,造模技術要求高,目前研究中缺乏小鼠ANP模型的腸屏障功能損傷病理變化的描述。本研究使用C57BL/6小鼠進行胰膽管逆行注射?；悄懰徕c建立ANP模型,選取造模后24 h及48 h兩個ANP發展的關鍵時間節點,觀察ANP相關腸屏障功能損傷的動態變化,為利用該動物模型研究ANP合并腸屏障功能障礙的病理生理機制及治療方法奠定基礎。

材料和方法

一、實驗動物與分組

18只SPF級雄性8～12周齡、體重22～27 g的C57BL/6小鼠購于上海南方模式生物科技股份有限公司。給小鼠喂食標準飲食,并在無病原體的條件下飼養,晝夜循環12 h。實驗操作前禁食12 h,自由飲水。按數字表法將小鼠隨機分為假手術組和ANP組,其中ANP組根據造模時間進一步分為造模后ANP 24 h組和ANP 48 h組,每組6只。ANP造模按照Perides等[8]報道的方法進行:三溴乙醇腹腔注射麻醉小鼠后,行剖腹手術暴露胰膽管,膽總管上段使用血管夾夾閉,將導管穿入十二指腸后再經十二指腸乳頭逆行插入小鼠胰膽管,在3 min內勻速泵入5%?；悄懰徕c(2 μl/g)誘導ANP,藥物成功泵入后將胰膽管、十二指腸歸位,關腹。假手術組僅行手術操作,穿刺胰膽管,未注射藥物。手術完成后,記錄術后48 h小鼠的存活情況并進行生存率分析。分別在造模后24、48 h使用三溴乙醇注射麻醉小鼠,眼球取血后頸椎脫臼法處死,剖腹取胰腺、小腸、結腸組織,將小腸從中間橫切分為上下段再分別縱向對半分開。將血清、對半的小腸上下段組織-80℃凍存;將胰腺組織、另一半小腸上下段組織及結腸置4%多聚甲醛溶液中固定。

二、觀察指標

1．胰腺和腸道組織病理學檢查:取多聚甲醛溶液固定的胰腺、腸道組織標本,常規石蠟包埋、切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,光學顯微鏡下觀察組織病理學改變。胰腺組織按照改良Schmidt評分標準[9]對胰腺水腫、炎癥細胞浸潤、出血和腺泡細胞壞死進行評分。小腸組織按照Chiu等[10]提出的病理分級進行評分:0分,正常腸黏膜;1分,絨毛頂部出現上皮下間隙;2分,上皮下間隙繼續擴展;3分,上皮層大塊分離伴部分絨毛頂部缺失;4分,絨毛消失伴固有層、擴張的毛細血管裸露;5分,固有層潰瘍、解體。結腸組織學評分參照文獻[11]。所有數據均由隨機選擇各組小鼠6張切片,每張切片隨機選擇3個視野觀察、計算得到。

2．血清淀粉酶和脂肪酶檢測:應用全自動生化儀(Chemray 240,深圳雷杜生命科技公司)測定小鼠血清淀粉酶和脂肪酶的活性。

3．血清D-乳酸檢測:使用ELISA試劑盒(美國AAT Bioquest公司)測定血清D-乳酸水平,嚴格按說明書操作。使用Synergy LX酶標儀檢測575 nm和605 nm處吸光度比值,繪制D-乳酸標準曲線,計算得到血清D-乳酸濃度。

4．小腸組織腸道緊密連接蛋白檢測:取凍存的各組小鼠小腸上段組織,裂解后取上清,采用蛋白質免疫印跡法檢測腸道緊密連接蛋白ZO-1、occludin表達,以GAPDH為內參對照?？筞O-1、occludin抗體購自武漢塞維爾生物科技有限公司,工作濃度分別為1∶1 500、1∶1 000?？笹APDH抗體、HRP標記山羊抗兔IgG二抗購自美國Cell Signaling Technology公司,工作濃度分別為1∶2 000、1∶3 000。ECL(美國Millipore公司)發光,X片曝光、顯影、定影,用Image J 軟件掃描條帶灰度值,以目標條帶與內參條帶的灰度值比表示目的蛋白表達量。

三、統計學處理

結 果

一、各組小鼠造模后生存率、胰腺病理學及血生物化學指標變化

術后觀察各組小鼠生存情況,假手術組48 h總生存率為100%,造模組小鼠術后出現萎靡、嗜睡、體溫降低,并在術后6 h開始出現死亡,24、48 h兩個時間節點總生存率分別為36.4%、25.0%,提示造模后24 h內為ANP小鼠的死亡高峰期。

胰腺組織HE染色結果顯示,假手術組小鼠胰腺組織結構完整,腺泡排列緊密;ANP 24 h組、48 h組胰腺組織均出現了水腫、出血、炎癥細胞浸潤、腺泡細胞壞死(圖1)。假手術組、ANP 24 h組、ANP 48 h組胰腺Schmidt病理評分分別為(0.67±0.82)、(10.58±0.64)、(8.81±1.55)分,ANP 24 h組和ANP 48 h組均較假手術組顯著升高,差異均有統計學意義(t值分別為23.43、11.36,P值均<0.05)。

圖1 假手術組(1A)、ANP 24 h組(1B)、ANP 48 h組(1C)小鼠胰腺組織病理學變化(蘇木精-伊紅染色, ×200)

假手術組、ANP 24 h組、ANP 48 h組血清淀粉酶水平分別為(479.14±86.42)、(5998.72±2096.31)、(3055.43±2336.5)U/L,脂肪酶水平分別為(18.56±3.84)、(558.20±559.65)、(112.58±94.91)U/L,ANP組血清淀粉酶、脂肪酶水平均高于假手術組,其中ANP 24 h組較假手術組升高顯著,差異有統計學意義(t值分別為6.44、2.36,P值均<0.05)。

以上結果表明成功建立ANP小鼠模型。

二、?；悄懰徕c誘導的ANP小鼠腸道病理改變

HE染色結果顯示,假手術組小腸組織排列緊密、結構完整。ANP 24 h組小腸組織出現上皮細胞部分脫落,絨毛排列紊亂、大片倒伏,頂端上皮下間隙擴大,并有腫脹壞死脫落;ANP 48 h組小腸絨毛完整性部分恢復,絨毛排列稍紊亂,腫脹壞死程度減輕(圖2)。假手術組、ANP 24 h組、ANP 48 h組小腸上段Chiu腸黏膜損傷病理評分分別為(0.17±0.41)、(2.11±1.41)、(1.61±0.80)分,小腸下段Chiu病理評分分別為(0.17±0.41)、(1.00±0.76)、(1.06±0.25)分,ANP 24 h、48 h組小腸病理評分均高于假手術組,其中小腸上段病理損傷更加明顯,差異有統計學意義(t值分別為3.25、3.94,P值均<0.05)。假手術組、ANP 24 h組和ANP 48 h組結腸結構完整,無明顯損傷(圖2),病理評分分別為(0.33±0.52)、(0.67±0.82)、(0.67±0.52)分,3組間差異無統計學意義。提示牛磺膽酸鈉誘導的ANP相關腸道病理損傷主要發生在小腸上段。

圖2 假手術組(2A～2C)、ANP 24 h組(2D～2F)、ANP 48 h(2G～2I)組小鼠小腸上段(左)、小腸下段(中)、結腸(右)組織病理學變化(蘇木精-伊紅染色, ×200)

三、?；悄懰徕c誘導的ANP小鼠腸屏障功能變化

假手術組、ANP 24 h組和ANP 48 h組血清D-乳酸水平分別為(337.76±125.90)、(1690.52±1072.13)、(288.36±134.86)μmol/L,ANP 24 h組血清D-乳酸水平較假手術組顯著增加,差異有統計學意義(t=3.07,P<0.05),ANP 48 h組和假手術組血清D-乳酸水平大致相當,差異無統計學意義。蛋白質免疫印跡結果顯示,假手術組、ANP 24 h組、ANP 48 h組小腸上段組織ZO-1表達量分別為0.87±0.08、0.19±0.18、0.50±0.19,occludin表達量分別為0.98±0.04、0.13±0.08、0.69±0.04,ANP 24、48 h組ZO-1、occludin表達量較假手術組均顯著降低,差異有統計學意義(t值分別為5.93、3.19,16.43、8.90,P值均<0.05,圖3)。其中ANP 48 h組ZO-1表達量較ANP 24 h組升高,但差異無統計學差異,occludin表達量較ANP 24 h組顯著升高,差異有統計學意義(t=10.64,P值<0.05)。提示ANP小鼠腸屏障功能在早期嚴重受損,隨后可逐漸自我恢復。

圖3 假手術組(1)、ANP 24 h組(2)、ANP 48 h組(3)小鼠小腸上段緊密連接蛋白ZO-1、occludin的表達(免疫印跡法)

討 論

動物ANP模型能夠一定程度上模擬人類SAP的病程,有助于該疾病的病理生理機制研究以及藥物治療探索[12]。近年來ANP動物模型被廣泛使用以探究ANP的發病機制,而小鼠因其成本低、可進行基因敲除等優勢逐漸成為研究AP最常用的實驗動物。目前AP小鼠模型常用的方式為腹腔注射雨蛙素刺激胰腺分泌造成AP,但雨蛙素誘導的AP多為輕癥,病理上主要表現為胰腺水腫、腺泡細胞空泡形成,難以模擬人類SAP的病理表現[2]。本研究通過十二指腸插入胰膽管逆行注射5%?；悄懰徕c誘導ANP小鼠模型,與假手術組相比,造模組死亡率為60%～70%,與文獻報道的ANP模型死亡率大致相當[3,13];在病理學上可見到胰腺水腫出血、炎癥細胞浸潤及腺泡細胞壞死,提示胰腺病理損傷嚴重;血清淀粉酶、脂肪酶升高,提示小鼠ANP模型制備成功。

腸道是SAP期間容易受損的靶器官之一,一項薈萃分析顯示60%的SAP患者存在腸屏障功能障礙[14]。腸屏障由機械、生物、化學屏障組成,其中腸道緊密連接蛋白在維持腸道屏障完整性方面發揮了重要作用[15]。此外,D-乳酸作為腸道細菌代謝產物,當腸屏障受到破壞時,D-乳酸可入血,因此血清D-乳酸水平可反映腸道黏膜通透性的變化[16]。近年來研究發現,腸道不僅是SAP的“受害者”,反過來也能夠成為“加害者”,促進全身炎癥反應綜合征和感染性胰腺壞死的發生[17]。SAP合并腸屏障功能障礙主要以腸道上皮細胞和腸道緊密連接受損為特征,導致腸道通透性增加,菌群和腸道有毒產物的移位加重了SAP并發癥的發生,增加死亡風險。Van den Berg等[18]研究發現引起壞死性胰腺炎繼發感染的微生物來源于胃腸道。ANP發病后腸道通透性增加與腸道微生物群改變及感染性并發癥密切相關,在ANP小鼠上進行糞便微生物群移植會增加細菌移位和死亡率。相反,補充丁酸鹽可明顯增強腸黏膜屏障功能,減輕小鼠的疾病進展。Li等[19]發現AP的嚴重程度受腸屏障、腸道菌群、NLRP3炎癥小體互相作用的影響?？梢娔c道屏障功能已成為當前研究SAP病理生理機制及治療靶點的熱點。

胰膽管逆行注射?；悄懰徕c誘導的ANP小鼠模型相對穩定,可重復性好,適用于研究ANP的局部和全身并發癥,且可用于治療相關研究。?；悄懰徕c溶液可誘發急性出血性胰腺炎,死亡率在24%～100%之間[20],且可表現出腸屏障功能障礙的特征,但目前對該小鼠模型中腸道的病理學動態變化、腸屏障功能的損傷仍缺乏系統性評價與監測。本研究選取ANP造模后24、48 h兩個時間節點,對腸屏障結構及功能進行動態觀察與檢測,通過腸道組織病理變化、腸道緊密連接蛋白表達、血清D-乳酸水平等指標發現ANP相關腸道病理損傷主要位于小腸部位,尤其是小腸上段,且同胰腺損傷一樣呈現出自我恢復的趨勢,24 h內腸屏障障礙逐漸加重,形成一個死亡高峰,而48 h后腸屏障功能逐漸恢復。

綜上所述,本研究利用C57BL/6小鼠逆行胰膽管注射5%?；悄懰徕c建立ANP模型,并初步探究了ANP腸屏障的動態變化,為后續深入研究ANP腸屏障功能障礙機制及治療藥物的開發提供有效的模型。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明陳逸飛:實驗操作、數據分析、論文撰寫;孫思慎:數據整理、統計學分析;張堯:研究設計、研究指導、論文修改;周春華:研究設計、研究指導、論文修改、工作支持;鄒多武:研究指導、論文修改、經費支持