茶葉中的微生物多樣性及有害微生物污染的檢測

陳思琪

[福建省產品質量檢驗研究院 國家加工食品質量監督檢驗中心（福州），福建 福州 350002]

茶被譽為世界三大飲料之一，當前，我國茶產業的發展基礎雄厚，品牌效應顯著，逐漸成為多個省份經濟的支柱性產業。隨著茶文化的普及和物質生活水平的提高，人們對市場中的茶葉及其制品安全的要求也逐漸提高，同時，國家對茶葉安全的監管力度也在不斷加大，針對不同茶葉制定了對應的行業標準。如何進一步提升對茶產品質量管控力度問題，逐漸引起大眾的熱議。

從茶樹的培育、病蟲害的防治、茶葉加工的生物發酵、到茶葉的儲存和功能成分制備，茶葉的微生物的應用覆蓋面極廣，在茶產業的發展中發揮著具有顯著的作用。但是，茶葉中有害微生物的存在會對人體健康造成一定的風險，也影響著茶葉出口貿易的發展。

1 茶葉中的微生物應用

1.1 茶樹培育與病蟲害防治中的微生物應用

茶園土壤的生態系統能夠直接影響茶樹的生長，繼而影響茶葉的品質，微生物作為生態系統中物質轉化的重要媒介，在茶樹的生長發育過程中發揮著巨大的作用。長期以來，隨著專業人員對茶園土壤微生物系統中的不斷研究，茶樹根際微生物的作用也為人所熟知。茶園土壤微生物群落種類繁多、數量龐大，能夠通過新陳代謝分解土壤中的物質增加土壤的養分，從而提高茶葉品質，特定的微生物還具有固氮、促進氮磷鉀等微量元素的吸收、促進發芽、提高生長速度等作用。有效利用微生物菌劑作為培育茶樹的綠色肥料，不僅能夠增強茶樹耐受力、提高茶葉產量，對于改善濫用化肥導致的農藥殘留重金屬超標問題也具有促進作用[1,2]。

茶樹的病蟲害防治一直以來是茶葉產業發展中的關鍵問題。生物農藥在茶樹病蟲害綜合治理當中的應用被逐漸推廣，研究表明多種細菌、真菌及病毒對特定的病蟲害具有針對性的防治作用[1-3]。例如：應用廣泛的蘇云金芽孢桿菌生物制劑可以在昆蟲腸道中產生伴孢晶體蛋白毒素從而殺滅害蟲，主要用于防治鱗翅目昆蟲；分離的芽孢桿菌能有效抑制多種茶樹葉斑病；白僵菌等真菌生物農藥可以通過制劑噴灑孢子侵染昆蟲，從而抑制其生長代謝達到防治害蟲的目的；病毒生物農藥在防控茶毛蟲、茶尺蠖上也具有相關制劑，可有效防控對應的病蟲害[1-3]。

1.2 茶葉加工中的微生物應用

1.2.1 茶產品的微生物發酵

品種繁多的茶樹是茶產品多樣化的重要原因，產品制作工藝的不同大大豐富了茶葉產品的種類。微生物發酵長期應用于黑茶、紅茶、茶飲料等產品的生產制作過程，大量微生物隨著渥堆環境溫、濕度等條件的變化與茶葉產生化學反應，形成茶葉特有的色、香、味[4]。茯磚茶的“發花”工藝則是茶葉生產中典型的微生物應用，在冠突散囊菌、黑曲霉、毛霉等微生物等作用下形成其特殊的風味[5]。在紅茶及茶飲料的生產加工中，乳酸菌、酵母菌、真菌的應用也極為廣泛。

微生物發酵極大程度豐富了茶葉的食品功能，在調節腸道菌群平衡、消食、解膩等多種保健功能上也取得一定成效。此外，茶產品生產過程中產生的茶渣廢料通過微生物發酵作用可以制備成營養元素豐富的肥料、飼料等副產品，或通過提取其木質素纖維酶、葡萄糖、果膠酶等有效成分進一步擴大其經濟價值[3]。

1.2.2 茶葉的儲存及功能成分制備

良好的茶葉貯藏關鍵在于做好密封、防潮、防異味，貯藏環境宜遠離污染源且無異味，有一定的防潮、防塵措施，避免日光照射以及合適的環境溫度。目前，微生物在茶葉貯藏上已經得到應用，有研究發現將嫌氣性蠟樣芽孢桿菌經過低溫處理成菌粉，按比例添加于茶葉中密封，存放在陰涼干燥處能夠對茶葉起到隔氧保鮮的作用[3]。

茶葉中含有茶氨酸、茶多糖、茶多酚、氨基酸等對人體有益的功能成分，利用微生物發酵可產生用于合成茶氨酸的三種主要催化酶，即谷氨酰胺酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酰胺轉肽酶。有研究發現一種含有谷氨酰胺酶的細菌香茅醇假單胞菌，在特定堿性條件下能夠快速催化合成茶葉功能成分茶氨酸[3]。

2 茶葉中微生物污染及檢測方法

在茶葉的制作、儲存、運輸過程中有可能產生茶葉污染問題，不僅影響茶葉品質，嚴重會引起健康問題。污染問題除了出現在農藥殘留、重金屬超標等領域，有害微生物污染也普遍存在。研究發現茶葉中的細菌污染主要包括一些腸道細菌如大腸桿菌、沙門氏菌，真菌污染主要是霉菌及其代謝出現的真菌毒素。

2.1 細菌污染

2.1.1 大腸菌群污染

大腸菌群與腸道致病菌有著密切的聯系，一些特殊血清型的大腸桿菌已被列為典型的病原菌，能夠導致腹瀉、炎癥、敗血癥等癥狀，對人體健康產生一定的危害。在食品微生物檢測中的常規項目主要包括大腸菌群、總大腸菌群、耐熱大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌等。由于大腸菌群廣泛存在于環境和人體腸道中，具有較高的傳播率及環境耐受力，因此容易在茶葉加工或儲存過程中造成污染。近年來，研究人員在茉莉花茶、普洱茶、綠茶等多種茶葉中都檢測到大腸菌群的存在[4-8]。

當前大腸菌群檢測方法主要有平板法、乳糖管發酵法、LST肉湯發酵法、疏水柵格濾膜法、熒光實時PCR法、PCR試紙條快速檢測法、環介導恒溫擴增法（LAMP）、MPCR-DHPLC色譜法、酶聯免疫吸附分析法（ELISA）等。雖然可用的檢測方法種類較多，但考慮到技術難度以及檢測成本問題，現有的食品檢測還是以傳統的平板法以及多管發酵法較為普及[9]。

2.1.2 沙門氏菌污染

沙門氏菌作為食源性疾病的主要誘發病原菌之一，能夠引起腸胃炎型、敗血癥型、類傷寒型、類感冒型以及霍亂型等五種疾病，已經成為眾多食品安全檢測中的常規項目。研究表明，沙門氏菌在對抗惡劣環境下能夠維持VBNC狀態，這種狀態為活態具有一定代謝活力但不可在常規培養基中培養，極可能逃避傳統的檢測方法[10]。因此，由于沙門氏菌可生長溫度范圍廣，營養需求不高，具有較強的耐干、耐熱性的特性，在茶葉生產過程中具有易污染、易存活的特點，且研究發現熱水沖泡不能完全殺死茶葉中存活的沙門氏菌，存在較大的污染風險[10]。

目前沙門氏菌的檢測方法有常規增菌法、聚合酶鏈式反應法、酶聯免疫法、實時熒光PCR檢測法、垂直膜過濾法、環介導恒溫擴增法（LAMP）、免疫色譜反應法等。

2.2 霉菌污染

霉菌由于其孢子繁殖特性能夠在環境中大面積傳播，具有較強的污染性，不僅能夠誘發茶樹的病蟲害，在茶葉加工、存放過程中也極易存活。數據表明，不論是包裝成品茶還是散裝茶都存在霉菌污染的情況，茶葉霉菌污染的優勢屬有曲霉屬、青霉屬、雜霉屬等[11]。霉菌毒素是霉菌的次生代謝物，種類繁多難以分類，當被攝入吸收時可以導致動植物患病或死亡。研究發現，霉菌的這些有毒次生代謝物可以在茶葉生產的任一階段開始積累，存在較大的健康危害。

當前針對食品微生物霉菌的計數檢測方法主要參照國家推薦標準GB/T 4789.15—2016，也可采用實時熒光定量PCR針對特定種的霉菌進行分子檢測，如黃曲霉、煙曲霉、環曲霉等，而液相色譜-串聯質譜法能夠對多種霉菌毒素進行測定。

3 茶葉微生物檢測標準

我國食品安全檢測技術已經形成較為完整的檢測體系，與微生物相關檢測項目覆蓋了多種食品類別中，并設定了對應的定量或定性指標。國家食品安全監管部門針對茶產品質量安全問題出臺了許多監管措施，包括一系列的檢測標準。這些茶產品標準涵蓋了多方面，其中，感官品質包括外形、湯色、香氣、滋味、葉底，理化成分包括茶多酚、游離氨基酸總量、咖啡堿、兒茶素等，農藥殘留包括六六六、滴滴涕、三氯殺螨醇、氰戊菊酯等，營養元素包括鉀、鈣、鈉、鎂、鋁等，污染物包括鉛、銅、鉻、鎘、錫等。

相比之下，我國在茶葉微生物檢測要求上尚未制定國家強制性標準，主要參照食品的相關檢驗方法。通過對檢驗標準的查詢發現，現行的與茶有關檢測推薦性國家標準中，有明確注明致病菌檢測指標的標準有GB/T 21733—2008《茶飲料》、GB/T 22111—2008 《地理標志產品 普洱茶》，檢測項目包括沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌，其中茶飲料的微生物檢測指標還包括菌落總數、大腸菌群、霉菌、酵母以及商業無菌檢測。涉及大腸菌群檢測指標的國家推薦性標準有GB/T 18745—2006《地理標志產品 武夷巖茶》、GB/T 20354—2006《地理標志產品 安吉白茶》、GB/T 20360—2006《地理標志產品 烏牛早茶》。GB/T 9833.3—2013《緊壓茶 第3部分：茯磚茶》中明確了茯磚茶的冠突散囊菌檢測考核指標。此外，GB/Z 21722—2008《出口茶葉質量安全控制規范》中將出口茶葉微生物污染列為其他檢驗項目。

4 茶葉微生物檢測展望

茶葉顯然已經成為我國重要的發展產業，當前我國從茶園開墾、道路水利系統、施肥管理、茶葉生產、再到后期的茶葉儲存都已出臺較詳細的茶葉生產技術規范，對于茶葉產品的農殘、重金屬等檢測標準也較為完整，這些逐年完善的檢測標準不僅加大了對茶企的監管力度，更為茶葉質量提升發揮了積極的作用，但我國對于茶葉有害微生物卻尚未出臺強制檢測指標。

美國、日本及部分歐盟發達國家已經將茶葉有害微生物列為試驗項目，有害微生物污染問題便成為我國茶葉出口的限制原因之一。數據顯示，在我國出口茶葉中曾檢出大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌及黃曲霉等有害微生物，在一定程度上限制了我國茶出口產業的發展[12]。基于綠色茶葉的標準在未來有逐漸提升的趨勢，而茶葉的有害微生物污染危及人體健康，這一方面要求國家應該嚴格把控茶產業的每一環節，另一方面顯示我國應該加快完善茶產業的微生物檢測標準。而且茶葉微生物的檢測能夠在一定程度上反映茶葉生產加工過程中的規范程度。茶葉微生物檢測標準的推行存在一定的必要性，應對具有典型污染的微生物設定檢測指標，以推動茶產業的健康發展。