影響紅鰭東方鲀生長性狀的候選基因及其SNP的研究進(jìn)展

薛 雨,王秀利

(大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧 大連 116023)

紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)是暖水性海洋底棲魚類,分布在北太平洋西部,在我國各大海區(qū)都有捕獲。紅鰭東方鲀?nèi)怩r味美、營養(yǎng)豐富,脂肪含量低,含有豐富的維生素B1、B2以及硒、鋅等多種微量元素,因此被譽(yù)為“魚中之王”。在中國養(yǎng)殖的眾多河鲀種類中,紅鰭東方鲀是個體最大、經(jīng)濟(jì)價值較高的品種之一,但仍面臨著種質(zhì)退化的問題,部分企業(yè)河鲀親魚長期使用,加上水質(zhì)下降、品種雜交等問題使種質(zhì)資源退化,直接使河鲀養(yǎng)殖周期變長,導(dǎo)致養(yǎng)殖成本增加[1]。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)是由單個核苷酸發(fā)生變異而引起在基因組水平上的DNA序列多態(tài)性,包括單個堿基的顛換、轉(zhuǎn)換、插入和缺失[2]。根據(jù)在基因組上的分布位置不同,SNP可以分為基因編碼區(qū)SNPs (cSNPs)、基因間SNP (iSNPs)、基因周邊SNP (pSNPs),其中cSNPs和pSNPs會對基因表達(dá)產(chǎn)生影響[3]。根據(jù)對生物遺傳性狀的不同影響,cSNPs包括兩種方式:同義突變(編碼序列變化不影響翻譯后氨基酸的序列)和非同義突變(編碼序列變化會影響翻譯后氨基酸的序列變化,改變蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能)[4-6]。SNP具有遺傳穩(wěn)定性高、位點豐富且分布廣泛、富有代表性、二態(tài)性和等位基因性以及檢測快速(易實現(xiàn)自動化)等特點[7]。

作為第三代分子標(biāo)記技術(shù),SNP已被廣泛應(yīng)用于其他物種。生長性狀包括體長、體重和體高等,為紅鰭東方鲀最為重要的經(jīng)濟(jì)性狀,直接影響到經(jīng)濟(jì)效益的高低[8]。調(diào)控紅鰭東方鲀生長的特定基因,主要由三部分組成:編碼氨基酸的外顯子、非編碼內(nèi)含子以及驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的啟動子,當(dāng)任意一部分核酸序列發(fā)生插入、缺失、替換等變化時,都可能影響(上調(diào)/下調(diào))基因或上下游基因的表達(dá)水平甚至改變基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和活性[9],使紅鰭東方鲀的生長發(fā)育受到影響。部分研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在一些與紅鰭東方鲀生長相關(guān)的候選基因中存在著與生長發(fā)育具有顯著相關(guān)性的單核苷酸多態(tài)性位點(SNP),如生長激素釋放激素GHRH基因、肌細(xì)胞生成素MyoG基因等。

1 生長軸GHRH/GH/IGF-1相關(guān)基因

對于生長而言,主要的內(nèi)分泌途徑是垂體在生長激素釋放激素(growth hormone-releasing hormone,GHRH)的誘導(dǎo)下分泌的生長激素 (Growth Hormone,GH)與靶器官表面的生長激素受體 ( Growth Hormone Receptor,GHR)結(jié)合后激發(fā)肝臟分泌類胰島素生長因子1 (Insulin -like growth factor 1,IGF-1),即GHRH-GH-IGE-1軸[10]。

1.1 生長激素釋放激素基因(ghrh)

GHRH是胰高血糖素超家族的成員之一,其主要功能是通過與垂體前葉的GHRHR結(jié)合來刺激GH的合成和分泌[11]。除此之外,GHRH還具有促進(jìn)動物生長發(fā)育,參與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖分化等生物學(xué)過程的功能[12-14]。

在斑馬魚 (Daniorerio)等魚類研究中發(fā)現(xiàn),與大多數(shù)脊椎動物相同,ghrh基因由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成[15]。在紅鰭東方鲀的研究中,王梓祎等[16]用直接測序法在紅鰭東方鲀的ghrh基因上篩選到了7個SNP位點,分別為C18T、G315C、C1083T、A1524G、G2017A、T2125C、G2256A,并在其中篩選出3個與大多數(shù)生長形狀具有顯著關(guān)聯(lián)性的三個位點。在其他水產(chǎn)動物的研究中,Tao等[17]在北極紅點鮭(Salvelinusalpinus)含有g(shù)hrh的基因位點上篩選到1個與早期生長之間存在顯著相關(guān)性的SNP位點。張世勇等[18]利用DNA混池測序法在斑點叉尾鮰 (Ictalurespunctatus)的ghrh基因內(nèi)含子上檢測到4個SNP位點,經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn)其中3個位點與生長形狀存在顯著的相關(guān)性。Guo等[19]通過高通量測序技術(shù)在半滑舌鰨 (Cynoglossussemilaevis)的ghrh的關(guān)聯(lián)圖譜上發(fā)現(xiàn)了2個與生長相關(guān)的SNP位點。

1.2 生長激素基因(gh)

GH是一種由腦垂體合成分泌的多肽蛋白,是垂體前葉的激素之一。魚類GH是由魚類腦垂體合成和分泌的一種多肽蛋白,對魚類的生長發(fā)育起著促進(jìn)作用,參與并影響著魚類的多種代謝。黃軍[20]參照GenBank數(shù)據(jù)庫中紅鰭東方鲀和其他近緣物種的生長激素序列,構(gòu)建了東方鲀生長激素基因的進(jìn)化樹,運用PCR電泳檢測和克隆測序技術(shù)在暗紋東方鲀、紅鰭東方鲀和星點東方鲀的gh基因的intron2、intron5以及3’非翻譯區(qū)發(fā)現(xiàn)了多處包括堿基缺失、插入和一些單核苷酸突變。王沈同等[21]利用直接測序法從草魚的GH基因的3’部分序列中篩選到了9個SNPs,其中G2914T、T2966G位點的多態(tài)性對草魚的早期生長存在顯著的影響。譚新等[22]通過直接測序等方法在鳙gh基因的第二個內(nèi)含子上發(fā)現(xiàn)了5個變異位點,最終篩選到C982T位點與鳙的生長性狀相關(guān)性顯著。魯雙慶等[23]采用長段PCR及T-A克隆技術(shù)在對三種鱖魚的gh基因進(jìn)行比較時發(fā)現(xiàn)了大量SNP位點。

1.3 類胰島素生長因子-1基因(igf-1)

IGF-1是一種單鏈多肽,其進(jìn)化上高度保守,結(jié)構(gòu)上與胰島素原同源,在脊椎動物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[24]。魚類IGF-1的mRNA主要表達(dá)在肝外組織如鰓、腦、生殖腺等中,由成體魚類肝臟合成[25]。于海龍等[26]通過序列的多重比較在紅鰭東方鲀的igf-1基因中發(fā)現(xiàn)了2個SNPs(T756A、G1116C),且兩個突變均發(fā)生在非編碼區(qū),又通過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)該基因的T756A突變位點基因型與紅鰭東方鲀的部分生長性狀具有極顯著的相關(guān)性。阮瑞霞等[27]分析了不同基因型與生長性狀的相關(guān)性,在吉富羅非魚igf-1基因中發(fā)現(xiàn)了2個SNPs,其中位于內(nèi)含子1上的A1307G突變位點僅與雌魚的生長性狀具有相關(guān)性,而位于內(nèi)含子3上的C6T突變位點除了在增重方面對雄魚和雌魚具有不同程度的顯著相關(guān)性外,在其他生長性狀中此位點僅與雌魚存在顯著相關(guān)性。

2 調(diào)節(jié)肌肉生長

2.1 生肌調(diào)節(jié)因子家族

肌肉調(diào)節(jié)因子 (myogenic regulatory factors,MRFs)基因家族編碼4種肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子,分別是MyoD、MyoG、Myf5和Myf6,它們是生成骨骼肌的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,相互協(xié)作,調(diào)控肌肉的生成[28]。

其中,肌細(xì)胞生成素(myogenin,MyoG)基因?qū)∪獾幕蜣D(zhuǎn)錄、肌細(xì)胞生長周期以及肌細(xì)胞的分化起調(diào)節(jié)作用。生肌決定因子(Myogenic determinant,Myf6)基因的編碼產(chǎn)物可誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化融合成肌管[29]、促進(jìn)肌纖維的形成并且維持肌肉的表型[30]。于海龍等[26]通過序列的多重比較在紅鰭東方鲀的myog基因中發(fā)現(xiàn)了2個與生長顯著相關(guān)的SNP突變位點 (C434T、T617A),其中C434T發(fā)生在外顯子上,且為同義突變,而T617A處在非編碼區(qū)。同樣的,在紅鰭東方鲀的myf6基因中也發(fā)現(xiàn)了1個與生長相關(guān)的SNP位點(G113T)為同義突變。

2.2 肌肉生長抑制素基因(mstn)

肌肉生長抑制素(Myostatin,MSTN)基因能抑制MyoD家族成員轉(zhuǎn)錄活性負(fù)調(diào)控肌細(xì)胞的生長發(fā)育,其表達(dá)量與肌肉重量的變化呈反向變化[31]。Ying Wang等[32]通過DNA測序在mstn基因中發(fā)現(xiàn)2個SNP(A748G、C119T),分別位于第二外顯子和第二內(nèi)含子。

3 調(diào)節(jié)食欲和能量代謝

3.1 黑素皮質(zhì)素受體4基因(mc4r)

魚類黑素皮質(zhì)素受體4(melanocortin receptor4,MC4R)有其獨有的機(jī)制實現(xiàn)對能量平衡的調(diào)控。當(dāng)黑素皮質(zhì)素系統(tǒng)激活MC4R相關(guān)信號途徑時,對魚類攝食起到抑制作用,Wan等[33]發(fā)現(xiàn)對鯉進(jìn)行饑餓處理可以讓鯉腦中mc4r及其他能量平衡調(diào)控基因表達(dá)量發(fā)生顯著減少, 且恢復(fù)攝食后顯著迅速回復(fù)。張麗等[34]通過對紅鰭東方鲀的mc4r基因的同源性比較發(fā)現(xiàn)了與生長性狀相關(guān)的2個SNP位點(G48A、G264A),且G264A為同義突變。

3.2 腦型脂肪酸結(jié)合蛋白基因(b-fabp)

有研究發(fā)現(xiàn),腦型脂肪酸結(jié)合蛋白的表達(dá)情況與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及神經(jīng)細(xì)胞的分化可能具有相關(guān)性35],利用原位雜交發(fā)現(xiàn),在斑馬魚發(fā)育早期,腦型脂肪酸結(jié)合蛋白(Brain fatty acid- binding protein,B-FABP)基因在其中樞神經(jīng)系統(tǒng)高度表達(dá)[36]。楊曉等[37]利用重測序技術(shù)對紅鰭東方鲀?nèi)后w進(jìn)行SNP篩選,在b-fabp基因上共發(fā)現(xiàn)3個與生長性狀具有相關(guān)性的SNP位點(C442T、G676A、A731C),其中C442T位于第二外顯子上,G676A和A731C位于第三內(nèi)含子上。

4 調(diào)節(jié)骨骼生長

結(jié)締組織生長因子(Connective tissue growth factor,CTGF)可促進(jìn)細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管生成、促進(jìn)傷口愈合、促進(jìn)軟骨發(fā)育和骨骼發(fā)生,在生物的多種組織和器官中能廣泛表達(dá)。周金旭等[38]通過多重比較在紅鰭東方鲀的ctgf基因上篩選到了14個SNP位點,其中與生長具有顯著相關(guān)性的SNP位點分別為C23T、G39T、C270G,且3個SNP位點皆為錯義突變。

5 prkca、pacap、kras、insr、rheb等基因

prkcp為胰高血糖素家族,prkca不但與生長相關(guān),還在細(xì)胞過程中發(fā)揮著一定的調(diào)節(jié)作用。kras在細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)中起重要作用。kras能生成一種蛋白質(zhì),作為信號指令參與細(xì)胞生長、分裂和增殖并承擔(dān)分化等特殊功能。insr除了結(jié)合胰島素、胰島素受體還可以結(jié)合胰島素樣生長因子(IGFI和IGFⅡ)。rheb是一種蛋白質(zhì)編碼基因。與RHEB相關(guān)的疾病包括半巨腦畸形和結(jié)節(jié)性硬化癥。王梓祎[39]運用全基因組測序檢測出的67個與紅鰭東方鲀體質(zhì)量和體長極顯著相關(guān)的SNP位點,并進(jìn)行基因注釋和驗證,最后通過實驗總結(jié)及查閱文獻(xiàn)初步確定,prkca(NC 042291. 1,14965050)、pacap(NC 042306. 1,5049379)、kras(NC 042293.1 7196736)、insr(NC 042304. 1,9589878)、rheb(NC 042306.1 3602613)基因及位點可能與生長相關(guān)。

6 結(jié)束語

隨著生物技術(shù)的發(fā)展,SNP標(biāo)記已受到各國研究者的廣泛關(guān)注,成為分子領(lǐng)域研究的焦點。在關(guān)于篩選與紅鰭東方鲀生長性狀相關(guān)SNPs的研究中,對已被識別的候選基因與生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析并深度挖掘出其中存在的SNP位點,已成為目前篩選分子標(biāo)記應(yīng)用最為廣泛的方法。目前,在影響紅鰭東方鲀生長性狀相關(guān)基因的研究中,大部分基因都與肌肉生長調(diào)控因子家族和生長軸相關(guān),且篩選出的生長顯著相關(guān)的SNPs位點位于外顯子、內(nèi)含子、5′調(diào)控區(qū)、3′調(diào)控區(qū)上。紅鰭東方鲀產(chǎn)業(yè)方興未艾,找到與體長、體重、肌肉生長和骨骼發(fā)育相關(guān)的 SNPs位點和疑似與之相關(guān)的候選基因,為紅鰭東方鲀的分子標(biāo)記輔助選育提供更多的科學(xué)依據(jù)。