白藜蘆醇和環糊精包合物合成及再礦化作用評價

黃路梅,陳 晨

牙本質是由膠原基質和分級排列的磷灰石納米晶體組成的膠原礦化組織。礦化物質支撐牙本質膠原,共同實現牙本質的機械性能和維持生物學特性。當前牙本質粘接技術條件仍無法做到使樹脂單體在混合層底部實現膠原纖維的完全包裹,這就造成了混合層中膠原纖維被降解、進而出現納米滲漏[1-2],也是當前牙本質粘接耐久性問題的根源所在。這種情況下,通過牙本質仿生再礦化以改善膠原基質生物力學性能和有效抑制膠原纖維的生物降解則被認為是提高樹脂-牙本質粘結耐久性的替代解決辦法[3-5]。天然多酚陸續被嘗試用于牙本質再礦化[6-10],其中白藜蘆醇被證實具有較好的再礦化促進作用[6],這種活性作用具有濃度依賴性[11],然而另有研究發現,白藜蘆醇在局部高濃度(10～40 μg/mL)時會表現出細胞毒性。因此,尋找方法使白藜蘆醇適當富集而又避免局部高濃度產生的細胞毒性無疑對增強其再礦化促進效果及潛在的臨床應用是有益的。當前研究的目的即通過環糊精包嵌白藜蘆醇以使在不具細胞毒性的基礎上提升其再礦化活性并實現一定的緩釋。

1 材料與方法

1.1 白藜蘆醇-環糊精包合物的合成及表征

稱取白藜蘆醇(MO,美國),加入乙醇(沃凱,中國上海),使其充分溶解;稱取環糊精,加入水攪拌使其溶解成為飽和溶液,置于恒溫磁力攪拌器(國華,中國上海)上攪拌;再將白藜蘆醇的乙醇溶液逐滴加入到環糊精溶液中,繼續攪拌24 h,冷卻,靜置60 min,抽濾,-80 ℃過夜,結冰后真空冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器,中國北京)制成蓬松的塊狀物質,研碎,獲得白藜蘆醇-環糊精包合物。

分別取微量包合物粉末,以純白藜蘆醇粉末對照,采用KBr壓片法,測試紅外光譜(Nicolet 6700,Thermo Scientific公司,美國),衰減全反射設置為4 cm-1分辨率和32次掃描。測試范圍:4 000～400 cm-1。

稱取少量的白藜蘆醇和包合物,放入綜合熱重分析儀內(TGA-4000,PerkinElmer公司,美國)對其進行熱重測定,測定條件:溫度范圍為0～800 ℃,升溫速度為10 ℃/min,N2流速為40 mL/min。

1.2 細胞毒性評價

以單純乙醇溶劑作為對照組,測試1、5、10 μg/mL 4種濃度的白藜蘆醇組/包合物的細胞毒性。測試方法如下:人牙髓干細胞(北納生物,BNCC354453,中國蘇州)在37 ℃下,在DMEM培養基(Gibco,中國北京)中加入10%胎牛血清(麥克林,A801320,中國上海)和雙抗后培養。96孔板每孔加入約5 000個細胞,每組設置3個復孔,然后將細胞置于37 ℃ 5% CO2細胞培養箱中培養24 h。24 h后按組別加藥,加藥后分別孵育1、3、5、7 d。加入配制好的CCK8液(新賽美,C6005,中國蘇州)觀察OD值。

1.3 體外釋放度的測定

將相當于3 mg的白藜蘆醇、包合物分別置于(37±0.5)℃、體積為900 mL的水中,分別在預定的時間點取樣1 mL(同時補充1 mL水),使用紫外-可見8 452A二極管陣列分光光度計(美國加州帕洛阿爾托惠普公司)在307 nm波長處測定白藜蘆醇吸光度,計算累積釋放度(Q)。釋放度=溶液中釋放的白藜蘆醇容量/投入白藜蘆醇總質量×100%。

1.4 白藜蘆醇-環糊精包合物對牙本質表面再礦化的作用

經南京醫科大學倫理委員會批準(倫理號(2019)277),于2023年4月—5月在口腔頜面外科門診收集新鮮拔除、無齲壞的第三磨牙,去除牙周軟組織,使用低速切割機切割出0.5 mm×2.0 mm×2.0 mm牙頸部的牙本質片,使用前浸泡在4 ℃ 0.1%的麝香草酚溶液中。

制備10 mg/mL白藜蘆醇-乙醇溶液,10 mg/mL包合物/乙醇溶液,并在使用前在4 ℃下儲存。將牙本質切片浸入37%磷酸中以進行完全脫礦(使用口腔內牙科X射線設備(Focus 50540-IMG,KAVO,美國)進行檢查),用雙蒸餾水完全沖洗,并吸干。然后,將切片分為4組,并進行預處理30 min(n=1):純酸蝕作為空白對照組;純再礦化溶液處理組;白藜蘆醇組;環糊精-白藜蘆醇包合物組。

室溫下,將所有樣品在pH=7.2的0.1 mol/L PBS中的3%GD中固定4 h,并用0.1 mol/L PBS沖洗。在上升乙醇系列(25%、50%、75%、90%、95%和100%)中脫水后干燥。用金(E-1045日立,日本)濺射涂覆處理過的樣品,并用場發射掃描電子顯微鏡(FESEM,日立S-4800,日本)檢查脫鈣膠原基質的形態。

2 結 果

2.1 FTIR分析

包合物、白藜蘆醇及環糊精的FTIR譜圖如圖1所示,在環糊精和環糊精-白藜蘆醇包合物的FTIR光譜中,羥基O—H的價鍵振蕩呈寬頻帶形式,環糊精和環糊精-白藜蘆醇包合物最大值分別在3 405.92 cm-1和3 363.59 cm-1處。環糊精的特征峰為3 405.92-1,2 927.54-1,1 028.55-1,這些值反映了O—H和CH2的對稱和非對稱伸縮振動以及O—H的彎曲振動。在1 700～450 cm-1范圍內,白藜蘆醇的紅外吸收在1 610.29、1 587.24和1 385.06 cm-1處顯示出3個特征強波段,分別對應于芳香C—C雙鍵的吸收、烯烴C—C鍵的吸收和C—O的吸收。典型的反式烯烴帶為962.88 cm-1。包合物的FTIR光譜顯示“客體”分子的光譜特征發生了變化,1 385.06 cm-1和962.88 cm-1處的譜帶強度下降,而1 610.29 cm-1、1 587.24 cm-1處的譜帶消失。這些變化驗證了包合物的形成。

圖1 白藜蘆醇、環糊精及包合物紅外圖Fig.1 FTIR spectra of cyclodextrin, resveratrol and inclusion complex

2.2 熱重分析(thermogravimetry analysis)

包合物、白藜蘆醇、環糊精的熱重譜圖如圖2所示。白藜蘆醇在345 ℃時迅速發生質量損失,環糊精-白藜蘆醇包合物組在342 ℃時迅速發生質量損失。并且圖中顯示環糊精與包合物的3個區域的質量損失。第1個區域在140 ℃左右,質量損失約15%,可能是由于與環糊精相關的表層水蒸發所致。第2階段約為200 ℃,質量損失為2%,可能是由于內部水分蒸發所致。第3個階段約為350 ℃時,質量損失為80%,可能與化合物降解有關。樣品之間差別較明顯階段在第1和第3階段,包合物顯示出更高的熱穩定性。

a:環糊精、白藜蘆醇、包合物TG曲線;b:白藜蘆醇TG-DTG圖;c:環糊精TG-DTG圖;d:包合物TG-DTG圖;dw/dt是W對t的微分,代表樣本質量對溫度的變化速率

2.3 細胞毒性評價

將制得的包合物與白藜蘆醇進行CCK8實驗分析,如圖3所示。白藜蘆醇組在濃度為5 μg/mL時已經表現出明顯細胞毒性,環糊精-白藜蘆醇復合物組在10 μg/mL時才表現出明顯細胞毒性。白藜蘆醇經環糊精包合后,細胞毒性顯著降低。

***:P<0.001,****:P<0.000 1

2.4 白藜蘆醇釋放標準曲線及釋放度

用無水乙醇溶液為空白,在307 nm處測定吸光度值,以白藜蘆醇濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制標準曲線,得到回歸方程為:y=0.131x-0.004 7,R2=0.999 6,結果表明白藜蘆醇在0～6 μg/mL的質量濃度范圍內與吸光度呈良好的線性關系,標準曲線見圖4。白藜蘆醇7 d內總釋放度為25.85%。

圖4 白藜蘆醇標準曲線Fig.4 Standard curve of resveratrol

2.5 SEM分析

圖5A顯示了脫礦牙本質表面的典型SEM圖像,牙本質小管保持完全開放,管壁和牙本質小管之間的膠原纖維形態可見。純再礦化液組(B)的牙本質小管保持開放,但在膠原纖維之間和牙本質小管內形成少量晶體,膠原形態模糊。白藜蘆醇組(C)和包合物組(D)的晶體形成顯著增加,膠原形態被其完全覆蓋。

A:無預處理組;B:無預處理+再礦化液組;C:白藜蘆醇預處理組;D:包合物預處理組

3 討 論

白藜蘆醇是多種植物受到刺激時產生的一種抗毒素,近年來被發現有多種藥理活性,在臨床上有廣泛的應用前景。白藜蘆醇為天然多酚類化合物,具有抗氧化和抗炎的特性,目前已有少量研究證明白藜蘆醇與膠原有交聯作用,能夠維持甚至增強膠原纖維的強度,從而保護混合層的完整性[2]。這些作用主要來源于多酚中的酚羥基。白藜蘆醇分子中含有3個酚羥基,因此白藜蘆醇能夠通過氫鍵對膠原纖維進行生物修飾[9]。白藜蘆醇還被證實能通過抑制混合層底部基質金屬蛋白酶活性,促進混合層底部仿生再礦化,提高樹脂-牙本質的結合耐久性,且不會造成牙本質的染色[12]。仿生再礦化作為一種富水、樹脂稀疏的膠原基質的遞進脫水機制[13-15],使樹脂-牙本質粘接界面能夠長時間抵抗降解[6,16]。白藜蘆醇的疏水性有助于在長期的水環境中排斥水分子對混合層的侵入[10]。白藜蘆醇發揮作用的關鍵在于劑量依賴性,低劑量(0.5 μg)時呈現有益生物活性,而在高劑量時則導致細胞凋亡增加[11]。本實驗運用分子包合技術,使用環糊精包合白藜蘆醇,根據CCK8實驗測試結果,經環糊精包合后,白藜蘆醇毒性顯著下降,這對于應用時可以通過增加局部濃度進一步提升白藜蘆醇的生物活性是有意義的。

環糊精是在主客體化學中應用較多的主體分子,其具有疏水性空腔,并且其對藥物的緩釋能力已被證實[15]。包合作用可以看成是客分子取代已被包合的水分子的過程,白藜蘆醇等疏水性藥物容易被主體分子包合。本研究采用冷凍干燥法,按照包合比1∶1制備得到白藜蘆醇-環糊精包合物,將該包合物使用傅里葉紅外光譜(FTIR)、熱重實驗(TG)來驗證包合物的形成。傅里葉紅外光譜圖顯示,包合物的各譜峰強度明顯降低或消失,物質特征峰的變化證明了包合物的形成。熱重圖各物質不同的溫度下降區間也表明了包合物的形成。

環糊精包合白藜蘆醇的目的是解決局部白藜蘆醇溶解度低,生物活性不穩定[17-19]的問題,最終是期望用于牙本質再礦化的促進。通過環糊精的包裹,使得白藜蘆醇能夠被緩慢釋放,長時間作用于脫礦牙本質,在不引起細胞毒性的情況下促進牙本質再礦化。為直觀評價包合對牙本質再礦化的價值,本實驗采用掃描電鏡觀察包合物預處理后脫礦膠原再礦化的情況,根據觀察結果,對比酸蝕組及單純再礦化組,白藜蘆醇組和包合物組晶體形成顯著增加,膠原形態被其完全覆蓋。環糊精包合白藜蘆醇后,包合物在牙本質表層緩慢釋放白藜蘆醇,白藜蘆醇得以進入脫礦膠原的深部,促進深部膠原的再礦化。白藜蘆醇是單分子、低分子量、高滲透性的化合物,可以順利到達牙本質更深層,并利用—OH基團有效地結合到膠原纖維表面,發揮自下而上的再礦物質化作用[20-22]。