中空蛋黃殼結構Co/NC@SiO2的可控合成及應用于GSH檢測

關鍵詞： ZIF-67 中空蛋黃殼結構納米酶 谷胱甘肽 傳感器

谷胱甘肽（GSH）是生物體內存在的抗氧化酶，具有調節細胞中體內氧化還原狀態的功能[1]。目前，檢測GSH 的方法較多，如熒光光譜法、電化學法、高效液相色譜法和比色法等，其中，比色法具有方便快捷、操作簡單、可視化等優點，受到眾多科研工作者的青睞[3]。

金屬有機骨架化合物（MOFs）是新型的多孔結晶材料，由金屬離子連接有機配體自組裝構建而成，可作為前驅體在一定的條件下合成碳基納米材料[4-5]。得益于前驅體中配體在高溫熱解過程中形成的高度多孔的碳材料，使納米材料具有尺寸小、分散性好、穩定性高和生物相容性高等優點[6]。目前，碳基納米材料作為一種具有類酶活性材料，即碳基納米酶，受到越來越多的關注。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

所用試劑均為分析純。TEOS（美國Sigma-Aldrich公司），硝酸鈷（Co（NO3）2·6H2O）、2-甲基咪唑，谷胱甘肽（GSH）。醋酸、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鋅、無水乙醇、醋酸鈉，H2O2，3， 3’， 5， 5’- 四甲基聯苯胺（TMB）、抗壞血酸（AA）、葡萄糖（Glu）、尿素（Urea）、亮氨酸（Leu）、天冬氨酸（Asp）、半胱氨酸（Cys）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）和色氨酸（Trp）。

所用儀器為XRD-6000 型X 射線衍射儀，JSM-6700 型SEM 和JEM-2100 型TEM，UV-2600 型紫外分光光度計。

1.2 Co/NC@SiO2和Co/NC 的合成

5.4 g 2-甲基咪唑溶于50 mL水中，0.35 g 硝酸鈷和0.75 mL TEOS 溶于25 mL 水中，將兩種溶液混合室溫下攪拌3 h，真空過濾，經水洗和乙醇洗后，放置于60 ℃烘箱中烘干12 h，得到ZIF-67@SiO2。將200 mgZIF-67@SiO2 粉末置于石英舟底部，放入管式爐中于250 ℃保溫4 h，繼續升溫至600 ℃保溫3 h，升溫速率為5 ℃/min，整個過程密封通入高純氮氣，黑色樣品命名為Co/NC@SiO2。

1.3 Co/NC@SiO2的類過氧化物酶活性研究

將TMB（20 μL，15 mmol/L）和H2O2 （20 μL，3 %）加入到了0.2 mol/L 的HAc-NaAc（3 mL）緩沖溶液中，然后將Co/NC@SiO2分散液（20 μL，3 mg/mL）加入至上述溶液中，將混合溶液在30 ℃金屬浴中孵育30 min，通過UV-vis 測定A652 處吸光度變化。分別調節pH 值、溫度、反應時間等因素優化檢測條件。

1.4 比色法測定GSH 的研究

將TMB（20 μL，15 mmol/L）、H2O2（20 μL，3 %）和GSH（40 μL，1～120 μmol/L）加入到了0.2 mol/L 的HAc-NaAc（3 mL，pH值4.00）緩沖溶液中，然后將Co/NC@SiO2分散液（20 μL，3 mg/mL）加入至上述溶液中，在30 ℃金屬浴中孵育30 min后測定500～800 nm的光譜曲線。

2 結果與討論

2.1 Co/NC@SiO2的表征

SEM 圖像顯示ZIF-67@SiO2 具有多邊體結構，大小均勻，尺寸約為500 nm。如圖1 箭頭所示，有些破碎的ZIF-67@SiO2 顆粒顯示存在中空結構，殼里含有一個ZIF-67 內核。從圖2 的TEM 圖片上可以更清晰地看出，ZIF-67@SiO2是ZIF-67 多邊體為核、SiO2為殼的中空蛋黃殼結構前驅體。前驅體在高純氮氣氛圍中進行熱解，2-甲基咪唑配體碳化為氮摻雜的多孔碳基質，Co2+將被碳還原為金屬Co 納米顆粒，Co 納米顆粒均勻分散在氮摻雜的多孔碳基質上[5]，具體如圖3 所示。在碳化過程中，Co 納米顆粒溢出進入到空穴，有利于增加其催化性能。

圖4 為ZIF-67@SiO2前驅體和Co/NC@SiO2納米酶的PXRD 譜圖。ZIF-67@SiO2的衍射峰位置、強度與模擬的ZIF-67 可一一匹配。圖4（b）中，Co/NC@SiO2 在44.2°和51.5°出現的衍射峰可以與標準的立方體心結構的Co（111）和Co（200）晶面對應（PDF#15-0806）[7]。除此之外，位于36.2°、42.2°、61.3°衍射峰分別對應標準立方體心結構的CoN（111）、CoN（200）、CoN（220）晶面（PDF#16-0116）。在25°附近的衍射峰是TEOS 水解產生的SiO2殼。PXRD 結果表明：ZIF-67@SiO2前驅體在高溫下成功熱解為Co/NC@SiO2納米酶。

2.2 Co/NC@SiO2的類過氧化物酶催化活性

根據圖5（a）所示，在Co/NC@SiO2 為催化劑時，TMB+H2O2反應體系中，體系中產生氧化態TMB，溶液在652 nm 處有較強的吸收，說明Co/NC@SiO2具有類過氧化物酶活性。無催化劑時，H2O2 或者TMB+H2O2 體系不能產生oxTMB，在652 nm 處無吸收峰。

與天然酶類似，Co/NC@SiO2的催化活性也會受到pH 和溫度的影響。如圖5（b）所示，當緩沖溶液pH 值為4.0 時，Co/NC@SiO2 的催化活性最高，這是因為pH值能夠影響催化底物TMB 中氨基基團的質子反應。TMB 具有兩個-NH2基團，酸度增大時可以加快質子化反應速度，促進TMB的氧化；酸度減小時會抑制TMB與納米酶之間的結合，以及TMB的解離速率，從而減低納米酶的催化活性。圖6（a）為當孵育溫度為30 ℃時，Co/NC@SiO2表現出最佳的催化活性。如圖6（b）考察了孵育時間對Co/NC@SiO2的催化活性的影響，孵化時間為30 min 時，Co/NC@SiO2的催化活性最高。綜上，在后續工作中，主要研究Co/NC@SiO2的類過氧化物酶活性，設置的最優pH值、溫度和時間分別為4.0、30 ℃和30 min。

2.3 GSH 的檢測

Co/NC@SiO2+TMB+H2O2 體系中，Co/NC@SiO2納米酶催化底物TMB 為氧化態TMB，呈現類過氧化物酶活性。當GSH 濃度從1 μmol/L 增加到120 μmol/L，Co/NC@SiO2+TMB+H2O2體系的UV-vis 譜圖如圖7 所示，波長652 nm 處的吸光度逐漸降低。如圖8 所示，GSH 濃度在1～80 μmol/L 范圍內，ΔA 與GSH 濃度呈現良好的線性關系（ΔA =A 0-A 652，A0和A 652 分別為不添加GSH 和添加GSH 時，Co/NC@SiO2+TMB+H2O2體系的吸光度數值）。線性方程為ΔA=0.0055CGSH+0.068，R2為0.98。檢測限（LOD，3σ）為39.8 nm。與flowerlikeNiV2O6[3]、Single-layer MnO2 nanosheets[7]、Fe3O4/NHCS[8] 等納米酶對比，該實驗構建的Co/NC@SiO2+TMB+H2O2體系檢測GSH 的比色法具較高的靈敏度。

2.4 檢測GSH 的選擇性

通過添加氨基酸、糖和生物體內常見的金屬離子等干擾物，研究了Co/NC@SiO2+TMB+H2O2 體系檢測GSH 的選擇性。如圖9 所示，干擾物質對GSH 的檢測幾乎沒有影響，表明Co/NC@SiO2納米酶具有應用于生物樣品GSH 測定的可行性。

3 結語

通過自組裝和高溫熱解兩步法成功制備中空蛋黃殼結構Co/NC@SiO2納米酶，SiO2殼均勻包裹在碳基負載Co 納米顆粒外層。Co/NC@SiO2 納米酶在pH 值為4.0、孵育溫度30 °C 和孵育時間30 min 時表現最佳的類過氧化物酶活性。將其用于GSH 比色檢測時，具有良好的靈敏度和選擇性。當GSH 濃度在1～80 μmol/L范圍時，ΔA 和GSH 的濃度呈現良好的線性關系（R2=0.98），檢測限為39.8 nmol/L（n=8）。