薰衣草LaGGPPS5基因在大腸桿菌中催化萜類物質合成

關鍵詞：薰衣草；萜類；異戊烯基焦磷酸合酶；發酵

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0759

中圖分類號：Q78 文獻標志碼：A 文章編號：10080864（2023）12008508

狹葉薰衣草 （Lavandula angustifolia）因具有高品質精油和高觀賞價值被廣泛種植，其精油中含多種萜類化合物[1]。植物體內萜類物質骨架主要通過甲羥戊酸 （mevalonate， MVA） 和磷酸甲基赤蘚醇 （2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate， MEP）途徑合成，進而在萜類合成酶 （terpenoid synthase，TPS） 的作用下生成多樣化萜類物質[2]，異戊烯基焦磷酸合成酶 （isoprenyl diphosphate synthase，IDS） 位于萜類化合物途徑的分支點，對萜烯的多樣性起關鍵作用。萜類共同前體異戊烯基焦磷酸 （isopentenyl diphosphate， IPP） 和二甲基烯丙基焦磷酸 （dimethylallyl diphosphate， DMAPP） 在不同IDS催化下縮合產生不同萜類前體[23]，IDS可分為反式-IDS（trans-IDS）或順式-IDS（cis-IDS）。已知來自植物的trans-IDS 主要包括香葉基焦磷酸合酶 （geranyl diphosphate synthase，GPPS）和法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，FPPS），分別合成揮發性萜類的前體單萜和倍半萜；還包括香葉基香葉基焦磷酸合酶（geranyl geranyldiphosphate synthase，GGPPS）、茄尼基二磷酸合酶（solanesyl diphosphate synthase，SPPS）和聚異戊二烯基焦磷酸合酶 （polyprenyl diphosphate synthase，PPPS）[4]，GGPPS主要合成植物二萜、葉綠素、類胡蘿卜素和衍生物等，SPPS、PPPS 可以合成長鏈萜類[5]。

擬南芥 （Arabidopsis thaliana）、辣椒 （Capsicumannuum） 等多種植物的GGPPS 可以催化合成GGPP （香葉基香葉基焦磷酸）[56]，而番茄 （Solanumlycopersicum）、雜交薰衣草 （Lavandula ×intermedia） GGPPS能與GPPS.SSU （小亞基）相互作用催化合成GPP （香葉基焦磷酸）[78]。長春花（Catharanthus roseus） 的CrGPPS.LSU （大亞基） 是一種雙功能酶，可產生GPP 和GGPP[9]。集胞藻PCC 6803GGPPS 成員SyCrtE 可以同時催化合成GPP、FPP和GGPP[10]。這些結果表明，trans-IDS具有產生多種產物的雜泛性，可能在植物萜類多樣性中起主要作用。

GPP是單萜合成的前體，其在大腸桿菌體內可以依賴其內源去磷酸化酶的作用合成香葉醇[11-13]。為研究薰衣草中GPPS的活性，本研究根據前期測得的薰衣草轉錄組數據 （GenBank No.PRJNA892961），篩選并克隆了1個trans-IDS基因，命名為LaGGPPS5。為研究該基因是否具有合成揮發性單萜前體GPP的活性，將其連接到原核表達載體pRSFDuet-1，與攜帶MVA途徑上游基因的載體pTrc-low即pYJM14[14]和pACY-mvaE-mvaS 即（pYJM16）[15]共轉化，構建大腸桿菌重組菌株，以甘油為碳源經發酵培養后利用GC-MS檢測揮發性代謝產物，為植物IDS基因功能研究以及揮發性萜類物質發酵合成提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

研究所用的狹葉薰衣草‘解憂6 號’材料為2020年自新疆霍城縣利用分株繁殖移栽的5年生成株，在新疆師范大學校園桃山腳下連片種植面積約2 000 m²，移栽時施有大量有機肥，滴灌灌溉，株距60 cm，行距80 cm，2021年起每年夏季正常開花。于開花期分別收集莖、葉、花蕾及開花時的花萼和花冠，每3株薰衣草同樣部位的樣品混合作為1個生物學重復，3個重復，取樣后迅速放置于液氮中速凍，于-80 ℃保存備用。

1.2 總RNA 提取和cDNA 合成

利用Plant RNA Kit （Omega Bio-Tek）提取薰衣草不同組織的總RNA，使用PrimeScript ? RTreagent Kit with gDNA Eraser （TaKaRa） 進行反轉錄。

1.3 基因克隆及原核表達載體構建

根據薰衣草基因組序列信息[16]和pRSFDuet-1載體 （武漢淼靈生物）的Nco Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位點設計PCR引物（表1），由南京擎科生物科技股份有限公司合成。以所取各組織cDNA等量混合為模板，使用天根生化科技（北京）有限公司2×TaqPCR Mix 擴增目的基因，反應體系25 μL：TaqPCR Mix 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR 反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸1.5 min，共35 個循環；72 ℃延伸5 min。將pRSFDuet-1 載體質粒用Nco Ⅰ 和BamH Ⅰ（TaKaRa）雙酶切后，利用無縫克隆試劑盒 （生工生物）進行同源重組。連接產物轉化E.coli DH5α 感受態，挑取單克隆利用pRSFDuet-1載體檢測引物（表1）進行菌落PCR鑒定，陽性克隆送至南京擎科生物公司測序，經檢測正確的重組載體命名為pRSF-LaGGPPS5。

1.4 LaGGPPS5 的進化分析

以LaGGPPS5 CDS 序列翻譯出的氨基酸序列，通過在線BLAST 軟件（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）分析，下載與LaGGPPS5氨基酸序列相似性較高的物種序列，利用MEGA11軟件[17]構建系統進化樹，每科選擇1個物種的LaGGPPS5 同源序列進行氨基酸序列多序列比對，分析保守結構域。以進化關系相近的不同植物目中至少包含1個物種的原則，選擇了包括唇形目、茄目、龍膽目、菊目、杜鵑花目、傘形目、無患子目、薔薇目中18個物種和禾本目1 個物種：雜交薰衣草（Lavandula × intermedia， QHN60321）、夏枯草（Prunella vulgaris， QEV81832）、丹參 （Salviamiltiorrhiza， ACR19637）、芝麻 （Sesamum indicum，XP_011083737）、松蒿 （Phtheirospermum japonicum，GFP99862）、煙草 （Nicotiana tabacum， NP_001312106）、枸杞 （Lycium chinense， AIY34697）、長春花（Catharanthus roseus， AGL91648）、小?？Х龋–offea arabica， XP_027089978）、野生萵苣 （Lactucasaligna， CAI9284215）、甜葉菊 （Stevia rebaudiana，QPI15786）、狹葉油茶 （Camellia lanceoleosa，KAI8005463）、常綠越橘 （Vaccinium darrowii，KAH7850545）、阿育魏 （Trachyspermum ammi，AUZ98417）、短毛獨活（Heracleum moellendorffii，UQV25519）、梣葉槭 （Acer negundo， KAI9165527）、蘋果 （Malus domestica， AHA61556）、月季 （Rosachinensis， XP_024182306）、水稻 （Oryza sativa， XP_015647986）。

1.5 LaGGPPS5 基因表達分析

利用Roche LightCycler 96 熒光定量PCR儀，使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ （TaKaRa） ，分別以LaGGPPS5 熒光定量引物、內參基因LaActin 引物 （表1）對薰衣草葉、莖、花蕾、花萼、花冠進行qRT-PCR。每個反應設置3個孔，每個組織3個重復。相對表達量以2^-ΔΔCT法[18]進行計算。

1.6 重組菌株構建

攜帶了萜類合成MVA途徑上游基因的載體pACY-mvaE-mvaS （pYJM16） 和pTrc-low （pYJM14）由中國科學院青島生物能源與過程研究所和青島農業大學惠贈，pYJM16 所攜帶基因為糞球菌mvaS （HMG-CoA合酶，GenBank No. AAG02439）和mavE （HMG-CoA 還原酶， GenBank No.AAG02438）；pYJM14 所攜帶基因為釀酒酵母ERG8 （ 甲羥戊酸-5- 磷酸激酶，GenBank No.NM_001182727.1）、ERG12 （甲羥戊酸激酶，GenBankNo. NM_001182715.1）、ERG19 （甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶，GenBank No. X97557.1）、IDI （異戊烯焦磷酸異構酶，GenBank No. NM_001183931.1） 等[1415]。將pYJM16、pYJM14 和pRSF-LaGGPPS5 共轉化[19]入BL21（DE3） 大腸桿菌感受態細胞，通過同時含有氨芐青霉素、氯霉素和卡那霉素3種抗生素的培養基篩選出重組了3 個質粒的單克隆，利用pRSFDuet-1 載體、pYJM16 載體、pYJM14 載體檢測引物 （表1）進行菌落PCR，將鑒定的陽性重組菌株命名為sMGPP5；同時將pYJM16 和pYJM14共轉化BL21 （DE3） 菌株，重組菌種命名為sMVA6；pYJM16、pYJM14 和pRSF-LaGGPPS5 分別單獨轉化，重組菌株命名為sMUP2、sMLOW4和sGPP5。

1.7 LaGGPPS5 蛋白誘導表達及產物測定

將重組了不同質粒的BL21（DE3） 菌株，取5 μL接種到5 mL LB液體培養基中 （根據攜帶質粒的抗性，加入100 μg·mL-1氨芐青霉素、50 μg·mL-1卡那霉素、25 μg·mL-1氯霉素），于37 ℃培養，將過夜培養的種子菌按1：100的比例轉接到20 mL相同培養基中，180 r·min-1培養3～4 h，待菌液OD600達到0.6～0.8，加入1 mmol·L-1的IPTG誘導6 h，提取總蛋白進行SDS-PAGE檢測。

將sMGPP5 和sMVA6 重組菌株經IPTG 誘導于30 ℃培養4 d后，由中國科學院新疆理化技術研究所分析測試中心對菌液釋放氣體利用SUPELCO 50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭于60 ℃萃取45 min后上樣，利用氣相色譜-質譜聯用 （GC-MS， Agilent 8890-5977B）檢測揮發性組分相對含量，通過檢索質譜庫確定物質種類。

2 結果與分析

2.1 LaGGPPS5 基因序列及進化分析

以狹葉薰衣草莖、葉、花蕾、花萼和花冠cDNA等量混合為模板進行PCR擴增，克隆得到薰衣草LaGGPPS5 基因，測序結果表明LaGGPPS5片段大小1 038 bp，編碼345個氨基酸。通過CDS序列BLAST 分析發現，其與NCBI數據庫中雜交薰衣草LiGGPPS （MN064858.1） 和 LiGGPPS. LSU（MN064857.1）序列相似性最高，分別為96.98%和86.98%，其次為丹參GGPPS （FJ643617.1），相似性為86.57%。通過保守結構域分析顯示，其為反式異戊烯基二磷酸合成酶 （trans-IDS），所分析物種的GGPPS和GPPS都存在1個‘CxxxC’基序以及2個催化保守基序FARM （DDxxxxD） 和SARM（DDxxD）。通過與不同植物目中的9個物種同源序列進行多序列比對，序列相似性在67.33%～80.11% 之間，LaGGPPS5與同為唇形目的芝麻相似性最高，與禾本目的水稻相似性最低。為了確定薰衣草LaGGPPS5蛋白在不同物種間的進化關系，分析了其與9目19個物種的同源蛋白系統發育樹（圖1），薰衣草LaGGPPS5 與雜交薰衣草遺傳距離最近，在各物種中該基因同源基因的相似性與物種進化關系基本一致，表現出同科、同目物種具有更近的遺傳距離。

2.2 LaGGPPS5 組織表達分析

LaGGPPS5 在薰衣草不同組織中的表達存在較大差異，在葉和莖中表達量最高，花蕾、花萼和花冠中表達量極低，表達最低的為花冠 （圖2），可見葉和莖是LaGGPPS5 發揮作用的主要場所。

2.3 LaGGPPS5 重組菌株構建及誘導產物鑒定

將pRSF-LaGGPPS5 和pYJM16、pYJM14共轉化入BL21（DE3） 感受態細胞中，經抗生素篩選后，獲得了兼具卡那霉素（pRSFDuet-1抗性）、氯霉素（pYJM16載體抗性）、氨芐青霉素（pYJM14抗性）3種抗生素抗性的單克隆，經菌落PCR檢測，成功獲得了3質粒重組的目標菌株sMGPP5 （圖3）。

將sMGPP5、sGPP5、sMUP2 和sMLOW4 重組菌株經IPTG誘導后提取總蛋白進行SDS-PAGE。結果（圖4） 顯示，sMGPP5與sGPP5菌株在預期大小范圍（37.20 kD） 都出現了特異條帶，與LaGGPPS5 目標蛋白大小一致。而sMUP2 和sMLOW4因不攜帶LaGGPPS5，則沒有相應目的條帶，證明成功獲得了包含MVA途徑的LaGGPPS5重組菌株sMGPP5。

2.4 sMGPP5 重組菌株發酵產物分析

將sMGPP5重組菌株進行發酵培養4 d后，利用固相微萃取菌液表面氣體，GC-MS檢測結果（圖5） 顯示，在發酵組分中至少包含25 種萜類化合物。檢測到的萜類揮發性物質占峰面積的88.2%，其中單萜及其衍生物占萜類物質的65.38%，倍半萜及其衍生物占萜類物質的34.62%，各組分保留時間和峰面積占比見表2。香葉醇乙酯 （Geranyl acetate） 峰面積占比最高，超過40%，其次為反，反-金合歡乙酯 （trans， transfarnesylacetate）和香茅醇乙酯 （Citronellol acetate），峰面積占比都在5%以上。峰面積占比在1%～5%之間的萜類化合物有8種，其中香葉醇 （geraniol）、橙花醇乙酯 （nerol acetate）、反式-金合歡醇 （transfarnesol）、2， 3- 二氫金合歡醇乙酯 （2， 3-dihydrofarnesyl acetate）占比高于2%；此外，還檢測到少量的β-月桂烯 （β-myrcene）、L-β-蒎烯 （L-β-pinene）、D-檸檬烯 （D-limonene）、α-羅勒烯 （α-ocimene）、β-順式-羅勒烯 （β-cis-ocimene）和芳樟醇 （linalool）等14種萜烯類物質相對含量都少于1%。以上結果表明，在MVA上游基因存在下，LaGGPPS5在大腸桿菌中可催化IPP和DMAPP縮合產生多種萜類，單萜及其衍生物和倍半萜及其衍生物的比例大約為2∶1，可見LaGGPPS5具有催化合成香葉基焦磷酸和法尼基焦磷酸的雙重功能。

3 討論

在植物中包含一系列次生代謝物，迄今在各種生物體內發現了不少于8萬種萜類化合物[20]。豐富的萜類物質在植物體內都是由共同前體轉化而來，trans-IDS是介導萜烯生物合成多樣化的重要節點，已在多種植物中被證實[2122]。本研究克隆了編碼薰衣草trans-IDS 的基因LaGGPPS5，發現LaGGPPS5與許多物種的GGPPS和GPPS都存在1個‘CxxxC’基序，以及2個重要的催化保守基序FARM （DDxxxxD） 和SARM （DDxxD），它們對底物結合和催化功能是必需的[23]。在LiGPPS.SSU1和LiGPPS.SSU2 中同樣檢測到2 個‘CxxxC’保守基序，其主要作用于2個亞基間以形成異聚體復合物，這個基序在LiGPPS.LSU和LiGGPPS中同樣存在[8]。這些結果說明，克隆到的LaGGPPS5 基因可能在催化GPP/GGPP的產生中發揮功能。

將LaGGPPS5 基因和攜帶萜類合成MVA途徑上游基因的載體重組到sMGPP5菌株，其發酵產物中單萜類和倍半萜類相對含量分別為65.38%和34.62%，表明LaGGPPS5在大腸桿菌內兼具GPPS和FPPS 功能，催化合成了GPP 和FPP。與LaGGPPS5 高度相似的LiGGPPS 在體外催化IPP和DMAPP縮合過程中需要與小亞基LiGPPS.SSU共同作用產生GPP[8]。本研究中，LaGGPPS5在大腸桿菌細胞內并未增加小亞基的表達即可催化生成GPP，可見大腸桿菌體內可能存在其他分子與LaGGPPS5 共同作用調節了酶功能，亦或是LaGGPPS5由于序列差異而區別于LiGGPPS的功能，這有待深入研究。但已有研究證明，大腸桿菌內源酶，如堿性磷酸酶PhoA[11]、Nudix 水解酶NudB[12]，可以催化GPP和FPP合成香葉醇和金合歡醇，而dITP/XTP 焦磷酸酶（ RdgB）、周質堿性磷酸酶（PhoA）、無機焦磷酸酶（Ppa）、CDP-二酰基甘油焦磷酸酶（Cdh）等11種水解酶可以不同程度的催化Z， Z-FPP 生成Z， Z- 金合歡醇（Z， Zfarnesol）[13]；大腸桿菌體內源氯霉素乙酰轉移酶（chloramphenicol acetyltransferase， CAT） 具有萜烯醇非特異性酯化活性，可將紫蘇醇酯化成紫蘇醇乙酯或將香葉醇酯化成香葉醇乙酯[24]，這些結果都支持大腸桿菌中存在與LiGGPPS5共同作用并催化不同萜類合成的酶。本研究中，重組菌株sMGPP5未轉入特異的香葉醇合成酶和金合歡醇合成酶，發酵后合成了香葉醇乙酯、香葉醇、反，反-金合歡乙酯、反式金合歡醇等為主的揮發性萜類醇衍生物和醇酯衍生物 （圖8），可能與大腸桿菌內源酶類和pYJM16 所攜帶CAT 共同作用有關。對于特異萜類組分的精準合成還需要對內源酶以及載體攜帶基因進行優化。

大腸桿菌由于遺傳操作容易、成本低和生長快速，成為生產重組蛋白最廣泛使用的微生物物種[4]。通過合成生物學方法，利用增加MEP 和MVA途徑中各種萜類骨架合成酶表達，有望在大腸桿菌中生產重要的萜烯類物質[2526]，在大腸桿菌中已成功表達了P450 調節的紫杉醇前體[27]。本研究中，在重組大腸桿菌中合成的香茅醇乙酯、香葉醇乙酯和反，反-金合歡乙酯3種物質就占了總峰面積的68.83%。香葉醇乙酯作為食品、化妝品和香料生產中的最有價值的調味劑[27]，其峰面積占了總峰面積的43.21%。從植物中提取獲得香葉醇乙酯的方法雖然常見，但受產率低和溶劑成本高的影響很難工業化生產[28]?？梢?，利用大腸桿菌合成生物學生產萜烯類物質，不僅有可研究生物基因功能，還可以為基因產物的發酵生產提供理論依據和技術支持的優點，將具有廣泛的應用前景。

（責任編輯：溫小杰）