棉花立枯病拮抗細菌的分離鑒定及抑菌活性

關鍵詞：棉花立枯病；分離鑒定；枯草芽孢桿菌；抑菌活性

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.0628

中圖分類號：S562 文獻標志碼：A 文章編號：10080864（2023）12013807

棉花立枯病是由半知菌亞門的立枯絲核菌（Rhizoctonia solani） 引起的一種土傳真菌病害，是危害棉花苗期的主要病害之一[1]。立枯絲核菌侵染幼苗后，引起爛種、病苗和死苗，導致大面積補種、毀種和重播，嚴重影響棉花產量和品質[2]。該菌耐酸堿能力強，生長溫度范圍較寬，在土壤中有很強的腐生能力，可侵染稻、麥、棉和多種蔬菜瓜果等，目前尚缺乏有效的防治藥劑[1，3]。現有的防治方法有培育抗病品種、使用化學農藥和農藝輪作等，但抗病品種培育成本高，抗性易退化，長期施用化學農藥不僅使病原菌產生抗藥性，也會造成嚴重的土壤和環境污染[45]。基于微生物制劑的防治具有無毒、無污染、無殘留、可保持作物產量和質量等優點，成為現代新興的、有效的防治植物病害的方法[3-6]。目前，防治植物病害的微生物主要有細菌、放線菌和真菌[5]。芽孢桿菌屬（Bacillus）細菌在植物體內或根際土壤中分布廣泛，抗逆性強，具有廣譜抑菌活性和促生作用，是理想的生防益菌研究材料之一[7-9]。例如從牛油果根部分離出的枯草芽孢桿菌，不僅對立枯絲核菌具有抑制作用，還能定殖于植物根際[7]；從水稻葉片分離出的芽孢桿菌在實驗室抑菌率達95%～97%，田間試驗防治效果達64.0%～85.6%，并具有促生作用[9]。本研究利用傳統微生物培養方法分離出1株對棉花立枯病菌具有抑制作用的細菌W1，采用形態學和16S rDNA序列分析進行鑒定，研究了其抑菌效果和抑菌活性物質的穩定性，以期為棉花立枯病的防治提供候選微生物資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 棉花立枯病菌 （Rhizoctoniasolani）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum Lib）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、稻瘟病菌（Magnaportheoryzae）共7種病原菌均由贛南師范大學生命科學學院袁小勇老師實驗室提供。

1.1.2 供試培養基 培養基包括馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基[10]、LB培養基[8]、BPA液體培養基、營養肉湯（NA）培養基和牛肉膏蛋白胨液體（BPM）培養基[10]。

1.2 拮抗細菌的分離篩選和鑒定

土壤樣品采自江西省九江市石山村棉花田，取10 g土樣加入90 mL無菌水中，振蕩30 min，取上清制備成土壤懸液，梯度稀釋至10?5倍，每個梯度吸取100 μL均勻涂布于LB培養平板，置于28 ℃培養2 d，挑取不同形態的單菌落進行純培養，利用平板對峙法篩選對棉花立枯病菌有抑制作用的菌株，將其分離純化得到初篩菌株，根據公式（1）計算其抑菌率[11]，選取抑菌率最高的拮抗菌株編號為W1。

抑菌率=對照菌落直徑?處理菌落直徑/對照菌落直徑×100% （1）

將菌株W1接種于LB固體培養基上，培養3 d后觀察形態特征。用CTAB法[12]提取細菌總基因組，利用通用引物27F 和1492R[13]擴增16S rDNA基因，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送至長沙擎科生物公司測序。將獲得的16S rDNA 序列與GenBank 數據庫中的核苷酸序列進行同源性分析，利用軟件Mega 7.0構建NJ系統發育樹[14]。

1.3 拮抗細菌抑菌譜測定

采用平板對峙法測定拮抗細菌的抑菌譜[11]。將靶標植物病原菌菌餅（d = 5 mm）接種于PDA平板中央，在菌餅兩側約3 cm處劃線接種菌株W1，以僅接種病原菌的PDA培養基為對照，置培養箱中28 ℃培養5 d。觀察菌株W1抑菌效果并計算抑菌率，試驗重復3次。

1.4 拮抗細菌對棉花立枯病菌的抑菌活性測定

參考呂捷等[15]混菌法，取在LB液體培養基中培養24 h 的菌株W1 發酵原液及其10 倍稀釋液（10×）、100 倍稀釋液（100×）、1 000 倍稀釋液（1 000×），按1∶9的體積比與PDA培養基混合，待凝固后在PDA平板中央接種棉花立枯病菌，以添加等體積無菌水的PDA培養基作對照，每個處理重復3次，28 ℃恒溫培養5 d后計算抑菌率。

將W1 接種于LB 液體培養基中，28 ℃ 、200 r·min^?1 培養2 d，離心收集發酵液和細菌菌體，將發酵液經0.45 μm無機系過濾器除菌制備成無菌發酵液，分別按1∶4（5×）和1∶9（10×）的比例與PDA 培養基混合制成平板[16]。同樣，取W1菌體加入和初始發酵液等體積的PBS 溶液懸浮沉淀后超聲波破碎30 min，10 000 r·min^?1 離心10 min，收集上清經過濾除菌制備成混合PDA平板，測定抑菌率，每個處理重復3次。

1.5 培養基成分對抑菌活性的影響分析

將W1接種于BPA、BPM、LB、NA液體培養基中，28 ℃振蕩培養2 d，按上述方法制備無菌發酵中液。將獲得發酵液分別按1∶4的比例與PDA培養基混合制平板培養基，接種棉花立枯病菌菌餅，以添加等體積無菌水的PDA培養基作對照，28 ℃培養5 d后計算抑菌率，每個處理重復3次。

1.6 抑菌活性物質穩定性鑒定

1.6.1 溫度 將無菌發酵液分別置于25、40、60、80 和100 ℃處理30 min，分別按1∶4 的比例與PDA 制成混合平板，接種棉花立枯病菌菌餅，28 ℃培養5 d，以常溫無菌發酵液和無菌水為對照，測定溫度對抑菌活性成分的影響，每個處理3次重復。

1.6.2 pH 將發酵液pH 分別調整為2.0、4.0、6.0、8.0和10.0，室溫靜置2 h后調回pH 7.0，過濾除菌，按照上述方法制成混合培養平板，以未處理的無菌發酵液為對照，測定pH對抑菌活性成分的影響，每個處理3次重復。

1.6.3 蛋白酶K 取無菌發酵液30 mL，加入30 μL蛋白酶K（20 mg·mL^?1）后，37 ℃溫浴2 h，按照上述方法制成混合培養平板，以未加蛋白酶K無菌發酵液為對照，測定蛋白酶K對抑菌活性成分的影響，每個處理3次重復。

1.7 拮抗細菌對菌絲抑制作用測定

取1.3中平板對峙法培養的棉花立枯病菌，采集靠近平皿中央孔口的病原真菌菌絲，光學顯微鏡下觀察菌絲形態，并拍照記錄，以正常生長的真菌菌絲為對照。

2 結果與分析

2.1 拮抗細菌的分離篩選和鑒定結果分析

從棉田土壤中篩選出1株對棉花立枯病菌具有高抑制活性的細菌，編號為W1，在LB固體培養基上，菌落呈類圓形，乳白色不透明，表面光滑，中間隆起，邊緣整齊（圖1A）；顯微鏡下菌體呈短桿狀，芽孢中生，芽孢呈圓形或橢圓形（圖1B）。

利用16S rDNA通用引物，經PCR擴增得到約1 500 bp的DNA片段，測序后上傳GenBank，登記號為ON778566.1。系統發育分析結果（圖2）表明，菌株W1與Bacillus subtilis （KJ524512.1）同源性高達99.93%，結合形態學特征，將菌株W1鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.2 拮抗細菌W1 抑菌譜測定結果分析

菌株W1對所有測試的病原真菌均具有不同程度的拮抗作用，表現出廣譜抗病原真菌特性，其中，對棉花立枯病菌的抑制作用最強，抑菌率為47.62%，對黃瓜灰霉病菌、棉花枯萎病菌、番茄灰霉病菌、蘋果輪紋病菌、油菜菌核病菌和稻瘟病菌也具有一定的抑制作用，抑菌率分別為35.29%、28.57%、23.53%、15.63%、11.32%和10.86%。

2.3 拮抗細菌W1 對棉花立枯病菌的抑菌活性分析

由圖3可知，不同稀釋水平的菌株W1發酵液對棉花立枯病原菌均具有良好的抑菌效果。發酵原液及其10×、100×、1 000×稀釋液對棉花立枯病原菌抑菌率分別為82.12%、69.23%、65.38% 和45.58%，與發酵液原液相比，隨著稀釋倍數的增加，病原菌直徑逐漸增大，相對抑菌率逐漸下降。菌株W1無菌發酵液和菌體破碎液均有較強的拮抗作用，稀釋5倍和10倍的無菌發酵液對棉花立枯病菌抑菌率分別為42.54%、29.23%，而稀釋5倍和10倍的菌體破碎液抑菌率分別為46.15%、26.15%，可見發酵液和菌體都參與了抑菌作用。

2.4 培養基成分對抑菌活性的影響分析

培養基成分對菌株W1抑菌活性影響較大。由圖4可知，BPA培養基培養的無菌發酵液對棉花立枯病菌的抑制性最強，抑菌率達到98.34%；牛肉膏蛋白胨（BPM）和LB培養基培養的無菌發酵液對棉花立枯病菌的抑菌率分別為59.23%和43.28%；NA 培養基培養的無菌發酵液的抑菌率僅為17.12%。可見，BPA培養基可更有效地誘導抑菌活性物質的產生。

2.5 抑菌活性物質穩定性分析

由圖5可知，菌株W1抑菌活性物質熱穩定性較好，在25～80 ℃處理下，抑菌率小幅度升高，在80 ℃時抑菌效果最好，達到52%，當溫度達到100 ℃時，抑菌率稍有下降。在pH 2.0～4.0時，抑菌率顯著下降，僅有原活性的60%，隨著pH升高，抑菌活性呈上升趨勢，在pH為10.0時抑菌活性最強，抑菌率達41.67%，和對照組相當。無菌發酵液在蛋白酶K處理前后抑菌率無明顯變化，且處理后抑菌率由41.53% 升至50.76%，說明發酵液中可能不含蛋白類的抑菌活性物質。

2.6 拮抗細菌W1 對棉花立枯病菌菌絲生長的影響

取抑菌帶邊緣的棉花立枯病菌菌絲，于光學顯微鏡下觀察。結果顯示，正常狀態下，棉花立枯病菌菌絲體平滑、均勻、細長，菌絲內部無色素累積（圖6A）；受抑制的菌絲均表現出明顯的變形，菌絲消融，菌絲嚴重扭曲、畸形、纏繞，末端出現膨大，菌絲內部原生質碎裂成塊，菌絲生長受到明顯抑制（圖6B～D）。

3 討論

在現代農業生產中，生物防治已成為防控植物病害的重要手段，微生物菌劑對植物病害的防治效果明顯，被認為是代替化學藥劑的有效方法之一[4-6，17]。芽孢桿菌屬細菌不僅生長速度快、易于在植物體表面定殖、抑菌譜廣、制劑生產成本低、施用方便，且對病原菌作用具有多效性、不易產生抗藥性，是目前商品化生產和應用最廣泛的對環境無污染、對人畜無害的生物防治菌株資源之一[7-9，13，16]。本研究從土壤中分離篩選得到菌株W1，經形態學及16S rDNA序列分析，鑒定其為枯草芽孢桿菌，該菌株對棉花立枯病菌等多種病原菌有較高抑制活性。進一步研究發現，菌株W1發酵原液、菌體破碎液和無菌發酵液在不同稀釋倍數下均對棉花立枯病菌有較強的抑制作用，其中，稀釋100倍的發酵液仍可達到原液的抑制效果，因此稀釋100 倍有望實現菌株W1 發酵液應用增值保效的目的[10]。培養基成分可顯著影響抑菌活性物質的合成，蛋白胨和牛肉膏含量直接影響W1無菌發酵液的抑菌活性，而添加葡萄糖可降低抑菌活性物質的產量，其他無機營養成分的影響及最優發酵培養基配比有待進一步研究。

枯草芽孢桿菌主要用來防治由絲狀真菌引起的植物病害如番茄葉霉病、稻瘟病、棉花立枯病和枯萎病等，該菌可定殖于植物根際、體表或體內，分泌抗菌物質抑制病原菌生長，同時與病原菌競爭生態位并誘導植物防御系統抵抗病原菌入侵，可有效防治土傳病害，緩解土地連作障礙[3，6-10，14-22]。羅同陽等[21]發現，產幾丁質酶枯草芽孢桿菌發酵液對棉花立枯病菌絲生長抑制率高達88.1%，盆栽試驗防效達70.0%。王愛玉等[22]研究表明，枯草芽孢桿菌拌種可減少棉苗死亡率，降低棉花立枯病和黃萎病發生率。目前發現，枯草芽孢桿菌能夠產生多種抗菌物質，主要包括由核糖體合成的抗菌蛋白、細菌素；由非核糖體合成的結構穩定的多肽或脂肽類物質，其中脂肽類抗生素不僅是重要的胞外抗菌活性物質，還能促進芽孢桿菌在根部定殖，誘導植物系統抗性，具有極大的生防潛力[8，18]。菌株W1無菌發酵液對棉花立枯病菌有較強的抑制作用，能耐80 ℃高溫，在中性和偏堿性條件下穩定性好，對蛋白酶K處理不敏感，與目前發現的芽孢桿菌分泌的脂肽抗生素理化性質類似。光學顯微鏡下進一步觀察發現，該胞外代謝活性物質能夠造成棉花立枯病菌菌絲溶解、斷裂、扭曲，原生質體凝集滲漏、菌絲體扭曲纏繞變形等，該現象與鄧建良等[23]發現解淀粉芽孢桿菌YN-1產生的9種脂肽抗生素可使棉花枯萎病菌菌絲消融變細，菌絲體扭曲變形、形成泡囊結構的研究結果類似。因此，推測菌株W1產生的抗菌物質為脂肽類代謝產物，具有較高的開發應用潛力，其具體的抑菌機理及抑菌活性物質種類有待后續開展深入的研究。

（責任編輯：胡立霞）