初產(chǎn)母豬囊腫卵巢與發(fā)情卵巢轉(zhuǎn)錄組比較分析

摘要： 旨在系統(tǒng)比較初產(chǎn)母豬囊腫卵巢與發(fā)情卵巢的轉(zhuǎn)錄組水平表達(dá)的變化，探索母豬卵巢囊腫發(fā)生的遺傳機(jī)制。以初產(chǎn)母豬的囊腫卵巢和發(fā)情卵巢為研究對(duì)像，用Illumina NovaSeq 6000測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，構(gòu)建的6個(gè)cDNA文庫中共得到46.68 Gb原始序列（Raw reads），質(zhì)控處理后獲得42.02 Gb純凈序列（Clean reads），各樣品的Clean reads大小均達(dá)到6.74 Gb以上，與參考基因組（Sus scrofa 11.1）的比對(duì)率為97.33%～97.79%。與發(fā)情卵巢相比，從囊腫卵巢中共篩選到335個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)的基因有121個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因有214個(gè)。另外，有4 559個(gè)新轉(zhuǎn)錄本被發(fā)掘，與發(fā)情卵巢相比，有53個(gè)新轉(zhuǎn)錄本在相對(duì)表達(dá)量上存在顯著差異，其中上調(diào)表達(dá)的有18個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有35個(gè)。GO及KEGG通路分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因在多個(gè)與發(fā)生卵巢囊腫相關(guān)的通路中富集，如膽固醇代謝通路、Ⅰ型糖尿病通路、Ⅱ型糖尿病通路、糖尿病并發(fā)癥中晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體（AGE-RAGE）信號(hào)通路等。利用CytoHubba插件從差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)中篩選到10個(gè)核心節(jié)點(diǎn)基因，這些基因主要參與癌癥通路、細(xì)胞凋亡通路、趨化因子活性通路、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號(hào)通路，并在腫瘤發(fā)生、多囊卵巢綜合征（PCOS）并發(fā)癥、卵泡閉鎖、卵巢老化等方面發(fā)揮作用。通路及核心基因的功能分析結(jié)果表明，糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號(hào)通路、CXCL12基因與卵巢囊腫高度相關(guān)，機(jī)體炎癥和胰島素功能異常可能是導(dǎo)致初產(chǎn)母豬卵巢囊腫病變的主要因素。研究結(jié)果可為揭示母豬卵巢囊腫的分子遺傳機(jī)制提供重要理論依據(jù)，同時(shí)可為解析人類卵巢囊腫的遺傳機(jī)制提供參考。

關(guān)鍵詞： 初產(chǎn)母豬；囊腫；發(fā)情；卵巢；轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號(hào)： S828.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2023）03-0741-11

Comparison and analysis of transcriptomes in cystic ovary and estrous ovary of primiparous sows

REN Qiao-ling1， ZHANG Jia-qing1， MA Qiang1， CHEN Jun-feng1， WANG Jing1， WANG Xian-wei2， GAO Bin-wen1， GUO Hong-xia1， LIU Fu-jiu1， XING Bao-song1

（1.Henan Key Laboratory of Farm Animal Breeding and Nutritional Regulation， Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， China；2.Henan Provincial Animal Husbandry General Station， Zhengzhou 450008， China）

Abstract： The aim of the study was to systematically compare transcriptome expression changes of cystic ovary and estrous ovary of primiparous sows， and to explore the genetic mechanism of sow ovarian cyst. In this study， cystic ovary and estrous ovary of primiparous sows were used as the research objects， and transcriptome sequencing and bioinformatics analysis were performed using Illumina NovaSeq 6000 platform. The results showed that a total of 46.68 Gb raw" reads were obtained from the six sequencing libraries， and 42.02 Gb clean reads were obtained after quality control processing. The clean reads of each sample reached more than 6.74 Gb， and their comparison rate with the reference genome （Sus scrofa 11.1） was between 97.33% and 97.79%. Compared with estrous ovaries， there were 335 differentially expressed genes in cystic ovaries， including 121 up-regulated genes and 214 down-regulated genes. In addition， a total of 4 559 new transcripts were explored in this study. Compared with estrous ovaries， 53 new transcripts were significantly different in cystic ovaries， of which 18 were up-regulated and 35 were down-regulated. The final analysis of GO and KEGG pathway indicated that the differentially expressed genes were significantly enriched in some signaling pathways associated with ovarian cyst， such as cholesterol metabolism pathway， type Ⅰ diabetes mellitus pathway， typeⅡ diabetes mellitus pathway， advanced glycation end products and their receptors （AGE-RAGE） signaling pathway in diabetic complications， etc. Ten hub genes were screened out from differentially expressed gene protein-protein interaction （PPI） network using CytoHubba plugin. These genes were mainly involved in cancer pathway， apoptosis pathway， chemokine activity pathway， and AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications， and played roles in tumorigenesis， polycystic ovary syndrome （PCOS） complications， follicular atresia， ovary aging， etc. Pathway and hub gene function analysis showed that AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications and CXCL12 gene were highly correlated with ovarian cysts， and body inflammation and abnormal insulin function were likely to be the main factors leading to ovarian cyst in primiparous sows. The results of this study provided an important theoretical basis for revealing the molecular genetic mechanism of sow ovarian cysts， and also provided a reference for the analysis of the genetic mechanism of human ovarian cysts.

Key words： primiparous sow；cyst；estrus；ovary；transcriptome

卵巢囊腫是常見的豬生殖系統(tǒng)疾病之一，分為卵泡囊腫、黃體囊腫2種，在生產(chǎn)中以卵泡囊腫最為常見[1]。卵巢囊腫屬于多基因遺傳病，具有病因復(fù)雜、分子機(jī)制不明、受到遺傳和環(huán)境因素共同作用、治療后易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)[2]。據(jù)報(bào)道，2.4%～40.0%的母豬存在卵巢囊腫，由此造成的淘汰比例可達(dá)2.0%～10.0%，嚴(yán)重影響了母豬的繁殖性能[3]。雖然初產(chǎn)母豬具有較高的生產(chǎn)價(jià)值，但是生殖障礙性疾病造成的母豬淘汰率普遍較高，卵巢囊腫是其中一個(gè)重要原因。目前生產(chǎn)上多用生殖激素誘導(dǎo)的方法治療卵巢囊腫，治療周期較長且愈后母豬的受胎率、產(chǎn)仔數(shù)均受影響[4]。因此，研究豬卵巢囊腫病變的分子調(diào)控機(jī)制，探索分子育種的新方法，開發(fā)提高繁殖力的新技術(shù)，對(duì)于改善母豬的繁殖效率具有重要意義。

盡管卵巢囊腫的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前人們尚未完全了解，但是遺傳因素依然被認(rèn)為是其主要發(fā)病機(jī)制之一。Kahsar-Miller等[5]對(duì)93例患多囊卵巢綜合征（Polycystic ovarian syndrome，PCOS）的婦女進(jìn)行追蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其母親及姐妹的PCOS患病率分別為24%、32%，顯著高于一般人群。對(duì)55位PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞中CYP19A1基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，與健康女性相比，PCOS患者CYP19A1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P≤0.005），POCS患者卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)育出現(xiàn)紊亂，不能對(duì)促卵泡素（FSH）的刺激作出反應(yīng)，因此造成芳香化酶活性在芳香化過程中降低，相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量降低[6]。Dakshinamoorthy等[7]研究了胰島素受體（Insulin recptor，INSR）單核苷酸多態(tài)性（SNPs）位點(diǎn)rs2059807和rs1799817與印度婦女PCOS發(fā)生的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)rs2059807純合突變（CC）個(gè)體更易患PCOS （P≤0.001），rs1799817通過顯性方式使個(gè)體易患PCOS，當(dāng)該位點(diǎn)的1個(gè)等位基因出現(xiàn)顯性突變時(shí)，個(gè)體患PCOS的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高（P≤0.001），且rs2059807、rs1799817處于連鎖平衡狀態(tài)，獨(dú)立對(duì)PCOS的發(fā)生起作用。基因多態(tài)性與豬卵泡囊腫發(fā)生的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，抑制素-α（Inhibin-α）基因多態(tài)性與大白豬卵泡囊腫的形成和持續(xù)存在密切相關(guān)，該基因c.- 42Ggt;A[表示與參考序列相比，5′端非編碼區(qū)（UTR）第42位的G被A取代，其他表述依此類推]和c.3222Ggt;A多態(tài)性與豬卵泡囊腫的發(fā)生高度相關(guān)，且攜帶c.-42GG和c.3222GG基因型的大白豬患卵泡囊腫的風(fēng)險(xiǎn)較小[8]。隨后又有研究發(fā)現(xiàn)，視黃醇結(jié)合蛋白-4（Retinol-binding protein 4， RBP-4）編碼基因和雌激素受體（Estrogen receptor， ESR）基因多態(tài)性也可導(dǎo)致豬卵泡囊腫的發(fā)生，ESR/PvuⅡ基因型的母豬患卵泡囊腫的概率較低（概率為0.021），RBP-4基因的+249-63Ggt;C多態(tài)性與豬卵泡囊腫的形成顯著相關(guān)，且CC基因型患卵泡囊腫的風(fēng)險(xiǎn)較高，另外還發(fā)現(xiàn)，患卵泡囊腫的母豬卵泡液中RBP-4的表達(dá)量與健康卵泡相比顯著升高[9-10]。綜上可知，基因表達(dá)及基因形態(tài)的改變均與卵巢囊腫病變的發(fā)生密切相關(guān)，具體遺傳機(jī)制有待進(jìn)一步挖掘。

卵巢囊腫的發(fā)病率在成年淘汰母豬中占10%，該病的發(fā)生大大降低了母豬的繁殖性能，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。在中國育齡婦女中，PCOS的發(fā)病率為5%～10%，占不排卵不孕人數(shù)的75%，占不孕患者人數(shù)的30%～40%[11]。由于臨床上人類PCOS的發(fā)病率較高，因此迫切需要對(duì)該病進(jìn)行系統(tǒng)研究，從而有效控制其發(fā)生，但是在對(duì)人類卵巢囊腫自身遺傳變化的研究中，受到取樣困難（尤其是獲取正常發(fā)情卵巢組織較困難）和倫理道德的約束而難以進(jìn)行。由于豬和人在遺傳學(xué)、生理學(xué)和解剖學(xué)等方面具有一定的相似性，因此豬可以作為研究人類卵巢囊腫等相關(guān)疾病的生物模型。本研究擬利用RNA-seq技術(shù)對(duì)初產(chǎn)母豬的囊腫卵巢和發(fā)情卵巢進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)2種生理狀態(tài)下豬卵巢組織的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)變化進(jìn)行系統(tǒng)比較分析，篩選差異表達(dá)基因，并對(duì)其進(jìn)行基因本體論（GO）、京都基因和基因組百科全書（KEGG）、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作（PPI）分析，綜合探究豬卵巢基因表達(dá)情況對(duì)其生理狀態(tài)調(diào)控的影響，以期為揭示母豬卵巢囊腫分子遺傳機(jī)制提供理論依據(jù)，同時(shí)為解析人類卵巢囊腫的遺傳機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和樣品的采集

選取年齡和身體狀況基本相同的初產(chǎn)大長二元母豬作為試驗(yàn)豬，斷奶后在大致相同的條件下飼養(yǎng)，用同1頭公豬每天早晚各試情1次，以斷奶后7 d有明顯發(fā)情特征的3頭母豬作為正常發(fā)情母豬（編號(hào)為E_O_1、E_O_2、E_O_3，記作發(fā)情組），屠宰后取卵巢，用生理鹽水沖洗后置于液氮中凍存[12]。至斷奶后21 d，選取同一批次無任何發(fā)情表現(xiàn)的若干頭母豬，用Aloka500 B超儀（Aloka公司產(chǎn)品）測(cè)定并初步篩選出有卵巢囊腫的5頭母豬，屠宰后選擇卵巢明顯腫大的3頭母豬作為卵巢囊腫母豬（編號(hào)為C_O_1、C_O_2、C_O_3，記作囊腫組），囊腫卵巢組織的處理方法與正常發(fā)情母豬相同。本研究采集的囊腫卵巢均為卵泡囊腫（圖1）。將卵巢凍存于液氮中時(shí)均未戳破卵泡。提取RNA時(shí)，發(fā)情組所用卵巢組織為帶有正常發(fā)情卵泡的卵巢組織，囊腫組所用卵巢組織為卵泡明顯腫大的卵巢組織。

1.2 總RNA的提取與質(zhì)檢

卵巢組織總RNA的提取用TRIzol試劑盒（購自Thermo Fisher公司）完成，分別用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nano-Drop ND-2000紫外分光光度計(jì)（購自Thermo Scientific公司）檢測(cè)RNA樣品的完整性和質(zhì)量濃度，用Agilent BioAnalyzer 2100儀器（購自Agilent Technologies公司）進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，6個(gè)卵巢組織的總RNA樣品均要求達(dá)到如下條件：OD260/OD280gt;2.1，RNA完整值（RIN）gt;8.0。

1.3 cDNA文庫的構(gòu)建與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

文庫構(gòu)建和RNA測(cè)序由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。每個(gè)樣品取3 μg總RNA構(gòu)建cDNA文庫。按照Illumina NovaSeq 6000測(cè)序系統(tǒng)的要求，對(duì)6個(gè)cDNA文庫進(jìn)行末端修復(fù)、3′末端加A、接頭連接后純化、PCR擴(kuò)增富集、質(zhì)檢、定量等操作，符合Illumina NovaSeq 6000測(cè)序系統(tǒng)的要求后，進(jìn)行測(cè)序，讀長為PE150（表示高通量雙端測(cè)序，每端各測(cè)150 bp）。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制及比對(duì)分析

對(duì)得到的原始序列（Raw reads）進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)控處理，得到純凈序列（Clean reads）后計(jì)算Clean reads的堿基質(zhì)量Q30值、GC含量及序列重復(fù)情況，Clean reads轉(zhuǎn)錄本的組裝用String Tie軟件完成，并用Gff Compare軟件與已知豬參考基因組（Susscrofa 11.1）序列進(jìn)行比對(duì)后注釋[13]。

1.5 可變剪切事件分析及新轉(zhuǎn)錄本的預(yù)測(cè)

基于Clean reads的組裝結(jié)果，用ASprofile軟件對(duì)6個(gè)文庫中存在的可變剪切事件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析；在比對(duì)組裝轉(zhuǎn)錄本與豬參考基因組注釋信息時(shí)，將未被豬參考基因組注釋的、基因間隔區(qū)長度在180 bp以上的、距離已有注釋基因200 bp以上的轉(zhuǎn)錄本看作新轉(zhuǎn)錄本。

1.6 差異表達(dá)基因分析

用FPKM法計(jì)算基因的表達(dá)水平。各樣品基因比對(duì)到該基因的總數(shù)目（Counts）用DESeq R軟件包進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算差異表達(dá)倍數(shù)，用NB軟件對(duì)測(cè)序讀數(shù)（Reads）進(jìn)行差異顯著性分析，根據(jù)差異顯著性分析結(jié)果和差異表達(dá)倍數(shù)雙重指標(biāo)篩選差異表達(dá)基因，條件為Plt;0.05且｜log2FoldChange｜≥1。

1.7 差異表達(dá)基因的GO、KEGG分析

為了進(jìn)一步分析初產(chǎn)母豬囊腫卵巢和發(fā)情卵巢差異表達(dá)基因的功能，用DAVID在線數(shù)據(jù)庫對(duì)篩選到的所有差異表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋分析、KEGG通路分析，用超幾何分布檢驗(yàn)法計(jì)算GO條目和KEGG通路的富集顯著性，以顯著性閾值0.05對(duì)表現(xiàn)出顯著差異的GO條目、KEGG通路進(jìn)行篩選。

1.8 差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵基因的篩選

將差異表達(dá)基因上傳到STRING數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org/）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，置信評(píng)分gt;0.4。用Cytoscape軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理，用Cytoscape內(nèi)置的CytoHubba插件篩選排名前10的基因。

1.9 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

選取10個(gè)差異表達(dá)基因，以豬GAPDH為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）試驗(yàn)。根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站上10個(gè)差異表達(dá)基因?qū)?yīng)的cDNA序列，用軟件Primer 6.0設(shè)計(jì)引物，引物序列信息見表1，引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。用RevertAid Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自Thermo Scientific公司）將測(cè)序時(shí)預(yù)留的6個(gè)樣品的總RNA（每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)）合成cDNA，根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（購自TaKaRa公司）的說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)[13]。用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，并將每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量以2為底數(shù)取對(duì)數(shù)進(jìn)行展示[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控及初步分析

在Illumina NovaSeq 6000測(cè)序系統(tǒng)對(duì)構(gòu)建的6個(gè)cDNA文庫進(jìn)行測(cè)序，共獲得46.68 Gb的Raw reads，經(jīng)一系列質(zhì)控處理后，共獲得42.02 Gb Clean reads，各樣品的Clean reads大小均在6.74 Gb以上。測(cè)序數(shù)據(jù)的堿基質(zhì)量值達(dá)Q30水平（表示測(cè)序時(shí)堿基識(shí)別的錯(cuò)誤率為0.1%或正確率為99.9%）的比例為93.41%～94.28%，GC含量為50.59%～51.54%，各Clean reads的堿基質(zhì)量穩(wěn)定在Q20～Q30水平（其中Q20代表測(cè)序時(shí)堿基識(shí)別的錯(cuò)誤率為1%或正確率為99%），堿基測(cè)序錯(cuò)誤率低，表明6個(gè)樣品的文庫構(gòu)建和測(cè)序工作質(zhì)量較高，測(cè)序數(shù)據(jù)的可信度較高[15]。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的比對(duì)分析

將Clean reads與豬的參考基因組（Sus scrofa 11.1）進(jìn)行注釋比對(duì)，各樣品Clean reads的比對(duì)率為97.33%～97.79%，比對(duì)到唯一位置的比例為95.24%～95.52%，比對(duì)到多處位置的比例為2.09%～2.50%，表明6個(gè)樣品的總RNA質(zhì)量高，不存在污染。比對(duì)到正鏈和負(fù)鏈的比例為47.61%～47.77%，整段比對(duì)到外顯子上的序列占比為38.39%～56.41%，分段比對(duì)到2個(gè)外顯子上的序列占比為35.41%～60.81%，詳見表2。

2.3 囊腫卵巢和發(fā)情卵巢基因的可變剪切情況

本試驗(yàn)所測(cè)的6個(gè)樣本中均存在大量可變剪切事件，涉及的類型、數(shù)量等詳細(xì)信息見表3，可以看出，豬卵巢基因組中的可變剪切事件以最后1個(gè)外顯子可變剪切（TTS）、第1個(gè)外顯子可變剪切（TSS）、單外顯子跳躍（SKIP）和單內(nèi)含子滯留（IR）4種類型為主，在囊腫組上述4種剪切事件的平均占比分別為28.89%、34.19%、10.83%和10.06%，在發(fā)情組上述4種剪切事件的平均占比分別為28.60%、33.61%、10.84%和10.64%。

2.4 囊腫卵巢和發(fā)情卵巢新轉(zhuǎn)錄本發(fā)掘

為了更全面地認(rèn)識(shí)豬轉(zhuǎn)錄組的組成，進(jìn)一步完善豬基因組注釋，將6個(gè)樣本的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)與豬已知參考基因組注釋信息進(jìn)行比較，共發(fā)掘出4 559個(gè)新轉(zhuǎn)錄本，其中554個(gè)在GO數(shù)據(jù)庫中得到注釋，315個(gè)在KO數(shù)據(jù)庫中得到注釋。新轉(zhuǎn)錄本在2組中的相對(duì)表達(dá)量符合Plt;0.05且｜log2FC｜≥1（FC為差異表達(dá)倍數(shù)），表明存在顯著差異。經(jīng)篩選，共有53個(gè)新轉(zhuǎn)錄本在相對(duì)表達(dá)量上存在顯著差異，其中上調(diào)表達(dá)的有18個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有35個(gè)。

2.5 囊腫卵巢和發(fā)情卵巢中差異表達(dá)基因的分析

用FPKM來衡量基因或轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，6個(gè)樣品中共有16 774個(gè)基因得到表達(dá)，囊腫組中特有表達(dá)的基因有520個(gè)，其中表達(dá)量排名前5的分別為FAM183A、ALS2CR12、DYDC2、LOC11025995和TFF3；發(fā)情組特有表達(dá)的基因有346個(gè)，其中表達(dá)量排名前5的分別為LOC110258732、LOC110255823、KCNJ13、IGSF5和LYPD5。由圖2可知，6個(gè)樣品中表達(dá)基因的FPKM絕大多數(shù)大于1，表明有效表達(dá)的基因占比較高。

2.8 差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因的篩選

基于STRING數(shù)據(jù)庫建立了差異表達(dá)基因之間的PPI網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)具有186個(gè)節(jié)點(diǎn)和227個(gè)邊緣。由圖6可知，差異表達(dá)基因之間具有聯(lián)系，用CytoHubba插件從PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選到10個(gè)核心節(jié)點(diǎn)基因，這些核心節(jié)點(diǎn)基因包括CXCL12、EGR1、MMP15、FOS、JUN、GPT2、F3、ETV1、VCAM1、VWF（圖7）。核心節(jié)點(diǎn)基因的表達(dá)情況、參與的通路及功能見表4，可以看出，這10個(gè)核心節(jié)點(diǎn)基因主要存在于癌癥通路、細(xì)胞凋亡通路、趨化因子活性通路、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號(hào)通路等，在腫瘤發(fā)生、PCOS并發(fā)癥、卵泡閉鎖、卵巢老化等方面發(fā)揮作用。

2.9 qRT-PCR方法驗(yàn)證差異表達(dá)基因

共挑選10個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。圖8結(jié)果表明，10個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果一致，說明測(cè)序結(jié)果可靠。

3 討論

卵巢囊腫的病因迄今尚不清楚，目前普遍認(rèn)為該病是一種復(fù)雜的多基因遺傳性疾病，因此相關(guān)遺傳學(xué)研究對(duì)解析該病的發(fā)病機(jī)制十分重要。對(duì)卵巢囊腫發(fā)病機(jī)制的研究涉及生殖和代謝的多個(gè)方面，如內(nèi)分泌生殖紊亂、機(jī)體慢性炎癥、糖脂代謝異常等[23-24]。

卵巢囊腫與機(jī)體的炎性改變密切相關(guān)，慢性低度炎癥很可能是卵巢囊腫發(fā)病的基礎(chǔ)[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，患PCOS的女性機(jī)體長期處于慢性炎癥狀態(tài)，在顆粒細(xì)胞、卵巢組織、卵泡液、子宮內(nèi)膜細(xì)胞、外周血和脂肪細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)炎癥因子表達(dá)量增高或炎癥水平升高[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因富集到多個(gè)與機(jī)體的炎性改變高度相關(guān)的通路中，表明母豬卵巢囊腫病變與自身炎癥水平存在緊密聯(lián)系。趨化因子是一種細(xì)胞因子，可以控制細(xì)胞的定向遷移，已有研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子系統(tǒng)在炎癥反應(yīng)、腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移、病原體的感染和清除等過程中發(fā)揮重要作用[28-29]。在本研究中，表達(dá)量下調(diào)的關(guān)鍵基因CXCL12參與趨化因子活性通路，已有研究發(fā)現(xiàn)，CXCL12是一種炎癥趨化因子，通過與其受體CXCR4或CXCR7相互作用調(diào)節(jié)白細(xì)胞的定向遷移，并且CXCL12與許多疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，如慢性炎癥、多囊卵巢綜合征、癌癥等[30]。劉月華等[31]發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組、空白組相比，CXCL12、IL-8在多囊卵巢綜合征大鼠的顆粒細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞中的表達(dá)量均顯著降低（Plt;0.05），并證實(shí)CXCL12、IL-8參與了多囊卵巢綜合征大鼠排卵障礙的發(fā)生過程。Jin等[21]發(fā)現(xiàn)，在多囊卵巢綜合征大鼠卵巢中，CXCL12、CXCR4、CXCR7基因的相對(duì)表達(dá)量均降低，顆粒細(xì)胞的凋亡數(shù)增加，用人重組CXCL12處理卵巢顆粒細(xì)胞瘤細(xì)胞（KGN細(xì)胞），可以用濃度依賴性方式阻止顆粒細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果均說明，CXCL12表達(dá)水平降低是卵巢囊腫發(fā)生的重要因素。本研究也發(fā)現(xiàn)，在初產(chǎn)母豬囊腫卵巢中CXCL12基因的表達(dá)量低于發(fā)情卵巢，并且CXCL12是關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因，推測(cè)極有可能由于卵巢中CXCL12基因表達(dá)受損，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生炎癥及顆粒細(xì)胞凋亡的可能性增加，進(jìn)而引起母豬卵巢囊腫的發(fā)生，具體機(jī)制有待深入研究。

目前的研究結(jié)果顯示，人類PCOS的主要發(fā)病機(jī)制是由胰島素抵抗或高胰島素血癥引起的高雄激素血癥，其中胰島素抵抗在PCOS的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[43]。本研究發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因在Ⅰ型糖尿病通路、Ⅱ型糖尿病通路、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號(hào)通路富集，這些通路均與體內(nèi)胰島素功能異常相關(guān)，因此推測(cè)胰島素功能異常與豬卵巢囊腫之間存在密切聯(lián)系。更為有趣的是，篩選的10個(gè)核心基因中有3個(gè)（VCAM1、F3、EGR1）參與糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號(hào)通路。晚期糖基化終產(chǎn)物（AGE）與晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合，激活了NF-kB信號(hào)傳導(dǎo)途徑，刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子和生長因子，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激和炎癥，與PCOS、衰老、糖尿病、女性不孕不育及腫瘤等多種疾病相關(guān)[44]。患有PCOS的女性全身處于慢性炎癥狀態(tài)，卵巢中也是如此，表現(xiàn)為血清或卵巢中AGE水平的升高及促炎物質(zhì)RAGE在卵巢組織中表達(dá)量的增加，AGE、RAGE在卵巢中累積不僅可誘發(fā)炎癥，還可導(dǎo)致卵巢類固醇激素合成和卵泡發(fā)育異常，說明AGE-RAGE信號(hào)通路通過炎癥、類固醇激素合成和卵泡發(fā)育等途徑誘發(fā)卵巢囊腫的發(fā)生[45-46]。有研究發(fā)現(xiàn)，AGE-RAGE信號(hào)通路還可通過誘發(fā)形成胰島素抵抗來促使發(fā)生卵巢囊腫，胰島素糖化使胰島素的生物活性及其與胰島受體結(jié)合的親和力下降，但糖化胰島素可作為配體與RAGE結(jié)合，進(jìn)而激活導(dǎo)致發(fā)生胰島素抵抗的氧化應(yīng)激和促炎途徑[47]。在研究藥物治療PCOS的分子機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號(hào)通路是治療藥物關(guān)鍵靶點(diǎn)與PCOS疾病靶點(diǎn)共同涉及的關(guān)鍵通路之一[48-49]。在本研究中，糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號(hào)通路是差異表達(dá)基因顯著富集的主要通路之一，并且篩選的10個(gè)核心基因中有3個(gè)參與了該通路，說明該通路在母豬卵巢囊腫的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，很有可能是導(dǎo)致母豬卵巢囊腫病變的關(guān)鍵通路，后續(xù)研究尤為值得關(guān)注。

另外，膽固醇代謝通路也是差異表達(dá)基因顯著富集的主要通路，該通路與患有卵巢囊腫的人或動(dòng)物出現(xiàn)的肥胖、脂代謝異常高度相關(guān)。在該通路上的差異表達(dá)基因ABCA1作為上游因子調(diào)控膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的發(fā)生，在脂質(zhì)沉積過程中起到重要作用。Huang等[50]研究發(fā)現(xiàn)，抑制小鼠體內(nèi)ABCA1蛋白的降解可有效促進(jìn)高密度脂蛋白（HDL）膽固醇的流出和膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，從而減少動(dòng)脈粥樣硬化的形成。Bart等[51]研究發(fā)現(xiàn)，與野生小鼠相比，ABCA1基因敲除的小鼠不僅在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中有更嚴(yán)重的脂肪蓄積，還存在更多炎癥細(xì)胞浸潤。由此可見，ABCA1不僅影響機(jī)體脂肪代謝，還與機(jī)體炎癥相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，ABCA1在豬囊腫卵巢中的相對(duì)表達(dá)量明顯下調(diào)，可能由于該基因下調(diào)表達(dá)，導(dǎo)致卵巢中發(fā)生脂肪代謝障礙及炎癥，因此該基因與卵巢囊腫病變相關(guān)，但是該基因并不屬于10個(gè)核心基因之一，可能是因?yàn)橹x異常不是母豬卵巢發(fā)生囊腫病變的主導(dǎo)因素。

綜上所述，與初產(chǎn)母豬發(fā)情卵巢相比，初產(chǎn)母豬囊腫卵巢的轉(zhuǎn)錄組譜發(fā)生了一系列變化，篩選到335個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)的基因有121個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因有214個(gè)。同時(shí)，本研究還發(fā)掘出4 559個(gè)新轉(zhuǎn)錄本，其中53個(gè)存在差異表達(dá)，上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本有18個(gè)，下調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本有35個(gè)。GO、KEGG通路分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因富集到多個(gè)與卵巢囊腫發(fā)生相關(guān)的通路中。用CytoHubba插件從差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選到10個(gè)核心節(jié)點(diǎn)基因，這些基因主要存在于癌癥通路、細(xì)胞凋亡通路、趨化因子活性通路、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號(hào)通路，在腫瘤發(fā)生、PCOS并發(fā)癥、卵泡閉鎖、卵巢老化等方面發(fā)揮作用。通路和核心基因功能分析發(fā)現(xiàn)，糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號(hào)通路、CXCL12基因與卵巢囊腫高度相關(guān)，機(jī)體炎癥和胰島素功能異常可能是導(dǎo)致初產(chǎn)母豬發(fā)生卵巢囊腫病變的主要因素。

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（責(zé)任編輯：徐 艷）

收稿日期：2022-06-30

基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（222102110096、222102110467）；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院杰出青年科技基金項(xiàng)目（2021JQ07）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2021YFD1301200）

作者簡介：任巧玲（1976-），女，河南駐馬店人，碩士，副研究員，主要從事豬的育種與營養(yǎng)研究。（E-mail）renql76@163.com

通訊作者：張家慶，（E-mail）zjq8650612@163.com；邢寶松，（E-mail）baosong@126.com