牛LATS2基因啟動(dòng)子克隆及轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析

摘要： 本研究旨在探究牛LATS2基因組織表達(dá)規(guī)律，利用相對(duì)熒光素酶活性數(shù)值確定其啟動(dòng)子核心區(qū)域并初步鑒定其核心區(qū)域關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，以闡明牛LATS2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。利用RT-qPCR檢測(cè)牛LATS2基因在心、脾、肝、腎、肺、背最長(zhǎng)肌、皮下脂肪、皺胃、大腸及睪丸等中的相對(duì)表達(dá)量，構(gòu)建LATS2蛋白進(jìn)化樹(shù)。克隆LATS2基因5′端非翻譯區(qū)上游1.7 kb序列，利用逐段缺失引物，巢式擴(kuò)增其7個(gè)啟動(dòng)子區(qū)不同截?cái)囿w缺失片段（-1 792～+179、-1 475～+179、-1 098～+179、-727～+179、-515～+179、-248～+179和-56～+179），并將不同截?cái)囿w構(gòu)建至雙熒光素酶報(bào)告載體pGL3-Basic上。重組的LATS2基因啟動(dòng)子雙熒光素載體分別轉(zhuǎn)染小鼠成肌細(xì)胞（C2C12）和小鼠脂肪細(xì)胞（3T3-L1）細(xì)胞系，鑒定其啟動(dòng)子核心區(qū)域。進(jìn)一步借助在線(xiàn)軟件JASPAR（http：//jaspar.genereg.net/）和Genomatix（http：//www.genomatix.de/cgi-bin//mat-inspector）分析啟動(dòng)子核心區(qū)域序列特征，并預(yù)測(cè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果顯示，LATS2基因在肝和背最長(zhǎng)肌中表達(dá)量極顯著高于脾（Plt;0.01）；LATS2蛋白構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)顯示反芻動(dòng)物單獨(dú)聚為1支，表明LATS2基因在反芻動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中保守性較高；蛋白質(zhì)互作分析篩選出的與LATS2蛋白互作緊密的前10種蛋白質(zhì)均為Hippo信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。LATS2基因啟動(dòng)子核心區(qū)域位于-248～-56，預(yù)測(cè)其啟動(dòng)子核心區(qū)域有與肌肉發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子TEAD1、MEF2A、FOSL1、MyoG和Myod1的結(jié)合位點(diǎn)，表明LATS2基因在牛肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中扮演重要角色。以上結(jié)果為探究牛LATS2基因在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 牛；LATS2基因；組織表達(dá)；啟動(dòng)子；轉(zhuǎn)錄調(diào)控

中圖分類(lèi)號(hào)： S823.8+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2023）03-0753-09

Promoter cloning and transcriptional regulation of bovine LATS2 gene

ZHANG Jiu-pan1， SONG Ya-ping2， JIANG Chao2， WANG Jin1， WEI Da-wei2

（1.Institute of Animal Science， Ningxia Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Yinchuan 750002， China;2.School of Agriculture， Ningxia University， Yinchuan 750021， China）

Abstract： The purpose of this study was to explore the tissue expression of bovine LATS2 gene， and identify its core promoter region and key transcription factors， so as to clarify the transcriptional regulation mechanism of bovine LATS2 gene. The relative expression levels of bovine LATS2 were detected in heart， spleen， liver， kidney， lung， longissimus dorsi muscle， subcutaneous fat， abomasum， large intestine and testis by RT-qPCR， and the evolutionary tree of LATS2 protein was constructed. The 1.7 kb sequence upstream of the 5′-untranslated region of LATS2 gene was cloned， and the promoter sequence regions of seven segments with -1 792-+179， -1 475-+179， -1 098-+179， -727-+179， -515-+179， -248-+179 and -56-+179 missing segments were amplified， and the dual-luciferase reporter vector pGL3-Basic was constructed respectively. The recombinant LATS2 gene promoter vectors were transfected into C2C12 and 3T3-L1 cell lines， respectively， and the core promoter regions were identified. With the help of online software Genomatix and JASPAR， the sequence characteristics of core promoter were analyzed to predict the binding sites of key transcription factors. The results showed that the expression of bovine LATS2 gene in liver and longissimus dorsi muscle was significantly higher than that in spleen （Plt;0.01）. Ruminants were clustered into one branch in the evolutionary tree constructed according to LATS2 protein， which indicated that LATS2 gene was highly conserved in the evolutionary process of ruminants. The top ten proteins closely interacting with LATS2 protein screened by protein interaction analysis were the key proteins in Hippo signaling pathway. The core region of the LATS2 gene promoter was located at -248--56. It was predicted that the core promoter region of bovine LATS2 gene had binding sites of transcription factors TEAD1， MEF2A， FOSL1， MyoG and Myod1 related to muscle development. It showed that LATS2 gene played an important role in the growth and development of bovine muscle. The above results lay a foundation for exploring the transcriptional regulation mechanism of bovine LATS2 gene in muscle growth and development.

Key words： cattle;LATS2 gene;tissue expression;promoter;transcriptional regulation

骨骼肌是動(dòng)物軀體最重要的組成部分，其生長(zhǎng)發(fā)育直接影響甚至決定家畜的產(chǎn)肉量，骨骼肌的生物學(xué)特性是衡量家畜潛在經(jīng)濟(jì)性能的標(biāo)準(zhǔn)[1]，另外，骨骼肌是動(dòng)物體動(dòng)作和能量代謝的主要參與者，在機(jī)體的代謝平衡維持中起十分重要的作用[2]。骨骼肌發(fā)生發(fā)育過(guò)程極其復(fù)雜精細(xì)，從靜息肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活、成肌細(xì)胞的增殖分化，到肌纖維形成的終末階段[3-4]，全過(guò)程除了受遺傳、環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)水平調(diào)控外，更多取決于基因的控制[5]，且細(xì)胞信號(hào)分子、轉(zhuǎn)錄因子、非編碼RNA等諸多調(diào)節(jié)因子精準(zhǔn)地參與其中復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控[6-11]。目前，為促進(jìn)骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育以改善肉質(zhì)從而實(shí)現(xiàn)肉牛的遺傳改良，基因的功能鑒定和篩選已成為一種熱門(mén)且有效的手段。

哺乳動(dòng)物中調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的Hippo信號(hào)通路十分保守，通過(guò)關(guān)鍵因子Salvador1（Sav1）、MST1/MST2、Yep等相關(guān)基因及大腫瘤抑制基因1/2（LATS1/LATS2）調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及干細(xì)胞的自我更新，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)器官體積大小的控制[12-13]。LATS2基因作為Hippo信號(hào)通路的核心成員之一，與通路中的其他關(guān)鍵因子共同調(diào)控動(dòng)物體器官的生長(zhǎng)發(fā)育，主要表現(xiàn)在影響心臟肌肉的發(fā)育[14-15]。目前，關(guān)于LATS2基因功能研究主要集中在其參與腫瘤細(xì)胞發(fā)生及調(diào)控細(xì)胞增殖的機(jī)理方面[16-18]，但LATS2基因?qū)?dòng)物體骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控有重要作用且研究較少。王利宏等[19]、鮑建軍等［20］發(fā)現(xiàn)LATS2基因多態(tài)性與湖羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育有顯著關(guān)聯(lián)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)YAP1基因在正常表型羊和雙肌臀羊中的表達(dá)存在差異，且LATS1/LATS2基因可與YAP1基因互作抑制肌肉生長(zhǎng)發(fā)育［21］。

此外，我們前期研究發(fā)現(xiàn)LATS1基因在牛背最長(zhǎng)肌等多個(gè)組織中高表達(dá)，且其核心啟動(dòng)區(qū)結(jié)合了肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的Myod1和MEF2A轉(zhuǎn)錄因子并調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性，初步闡明了LATS1基因參與牛的肌肉生長(zhǎng)發(fā)育轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制[22]。LATS2基因與LATS1基因同屬LATS基因家族，其分子序列及結(jié)構(gòu)相似，因此我們推測(cè)LATS2在牛肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中扮演重要角色，但其轉(zhuǎn)錄機(jī)制不清。鑒于此，本研究擬構(gòu)建LATS2基因在牛不同肌肉組織或器官中的表達(dá)譜，克隆并鑒定其啟動(dòng)子核心區(qū)域，預(yù)測(cè)LATS2基因啟動(dòng)子核心區(qū)域的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，以期為探究牛LATS2基因在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

采集3頭20月齡秦川牛公牛的肝（右葉）、背最長(zhǎng)肌、睪丸、肺（中葉）、腎（皮質(zhì)）、皮下脂肪、心（心房）、皺胃（胃壁）、大腸（盲腸段）、脾（實(shí)質(zhì)）和頸部靜脈血樣，迅速置于液氮帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 主要試劑

pMD-19T（Simple）載體、PrimeSTAR GXL Premix、基因組DNA提取試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DNA凝膠回收試劑盒、限制性?xún)?nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ、T4 DNA連接酶、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量試劑均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；去內(nèi)毒質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega Bio-Tek公司；Dual-Luciferase雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)購(gòu)自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、OPTI-MEM、Lipofectamine 3000 Reagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒及胎牛血清（FBS）購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；雙熒光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；pGL3-Basic及pRL-TK載體、小鼠成肌細(xì)胞（C2C12）和小鼠脂肪細(xì)胞（3T3-L1）為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 RT-qPCR檢測(cè)

首先提取不同組織或器官總RNA，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將各個(gè)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，檢測(cè)cDNA質(zhì)量。利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)RT-qPCR引物，以GAPDH作為內(nèi)參基因（引物見(jiàn)表1），使用7500 Fast Real Time儀器（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品）進(jìn)行定量PCR。反應(yīng)總體系為20.0 μl，其中上/下游引物各0.8 μl（引物濃度為10 μmol/L）、cDNA模板2.0 μl（模板質(zhì)量濃度為50 ng/μl）、Primix Ex TaqⅡ 10.0 μl、ROX Reference DyeⅡ 0.4 μl，剩余用ddH2O補(bǔ)齊。RT-qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，循環(huán)40次，生物學(xué)重復(fù)3次，采用2-△△Ct法處理分析相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)[23]，數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素差異性分析。

1.4 生物信息學(xué)分析

結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）及UCSC（https：//genome.ucsc.edu/）網(wǎng)站參考牛基因組信息，確定LATS2基因啟動(dòng)子區(qū)域。利用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）和MEGA 5.0（https：//www.megasoftware.net/index.php）構(gòu)建出LATS2蛋白進(jìn)化樹(shù)，使用ExcertSy ProtParm（https：//web.expasy.org/protparam/）在線(xiàn)程序進(jìn)行蛋白質(zhì)序列分析，使用String（http：//string-db.org/）預(yù)測(cè)與LATS2蛋白互作的蛋白質(zhì)。

1.5 啟動(dòng)子克隆及逐段缺失片段擴(kuò)增

根據(jù)牛LATS2基因啟動(dòng)子序列信息，設(shè)計(jì)其啟動(dòng)子全長(zhǎng)擴(kuò)增引物L(fēng)ATS2-PF/PR（表1），引物長(zhǎng)度為1 972 bp，包括-1 792～+179序列。以基因組DNA為模板，參考PrimeSTAR GXL Premix操作手冊(cè)進(jìn)行PCR，總體系20.0 μl，其中，4.0 μl dNTP Mixture，10.0 μl 2×PrimeSTAR GXL Buffer，上/下游引物各0.8 μl（濃度為10 μmol/L），1.0 μl PrimeSTAR GXL DNA聚合酶，底物1.0 μl（質(zhì)量濃度為50 ng/μl），2.4 μl ddH2O。PCR擴(kuò)增程序使用3步法：98 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，68 ℃ 15 s，循環(huán)35次。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，預(yù)期片段純化回收后與pMD-19T（Simple）載體連接，轉(zhuǎn)化后篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)5′端逐段缺失片段的上游引物（F1～F7）和1條固定的下游引物（R），在引物5′端添加KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切位點(diǎn)（表1），以L(fǎng)ATS2基因-1 792～+179序列為模板進(jìn)行缺失片段的PCR擴(kuò)增反應(yīng)（擴(kuò)增體系、程序同上），將擴(kuò)增片段分別連接pMD-19T（Simple）載體進(jìn)行測(cè)序鑒定。得到的逐段缺失片段分別命名為：LATS2-P1、LATS2-P2、LATS2-P3、LATS2-P4、LATS2-P5、LATS2-P6和LATS2-P7。

1.6 雙熒光素報(bào)告載體構(gòu)建

使用內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ將LATS2-P1～LATS2-P7片段和pGL3-Basic載體在37 ℃條件下酶切1 h，酶切完成后進(jìn)行目的片段純化回收。進(jìn)一步將LATS2-P1～LATS2-P7片段分別和pGL3-Basic載體用T4 DNA連接酶（16 ℃條件下）連接1 h。將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)后篩選陽(yáng)性克隆并鑒定，進(jìn)一步使用去內(nèi)毒質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，備用。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及測(cè)定酶活性

復(fù)蘇C2C12和3T3-L1，培養(yǎng)基為10%胎牛血清（FBS）+90% DMEM培養(yǎng)基，待其生長(zhǎng)狀態(tài)良好且密度達(dá)到70%～80%后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代生長(zhǎng)后選擇形態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行24孔板鋪板，按照Lipofectamine 3000 Reagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別將構(gòu)建好的雙熒光素報(bào)告載體LATS2-pGL3-P1～LATS2-pGL3-P7 800 ng重組質(zhì)粒和20 ng內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染至C2C12和3T3-L1，進(jìn)行3次重復(fù)，陰性對(duì)照為pGL3-Basic質(zhì)粒。在轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行細(xì)胞收集，利用雙熒光檢測(cè)試劑盒進(jìn)行熒光素酶和海腎熒光素酶活性測(cè)定，計(jì)算二者的比值，確定LATS2基因的啟動(dòng)子核心區(qū)域。

1.8 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)

通過(guò)JASPAR（http：//jaspar.genereg.net/）和Genomatix（http：//www.genomatix.de/cgi-bin//mat-inspector）在線(xiàn)軟件分析啟動(dòng)子核心區(qū)域序列，預(yù)測(cè)閾值設(shè)置為90%以上，選取2個(gè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果的共同部分，篩選LATS2基因的啟動(dòng)子核心區(qū)域關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)顯著性檢驗(yàn)使用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（Plt;0.01為差異極顯著； Plt;0.05為差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 LATS2基因組織表達(dá)規(guī)律

RT-qPCR結(jié)果（圖1）顯示，LATS2基因在肝、背最長(zhǎng)肌、睪丸、肺、腎、皮下脂肪、心、皺胃、大腸和脾中均檢測(cè)出表達(dá)信號(hào)，以脾中的表達(dá)量作為對(duì)照，該基因在肝和背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)極顯著地高于脾（Plt;0.01），其次在睪丸中高表達(dá)（Plt;0.05），在肺、腎、皮下脂肪、心、皺胃、大腸和脾中表達(dá)量較低。

2.2 牛LATS2基因的結(jié)構(gòu)特征及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

LATS2基因位于第12號(hào)染色體，全長(zhǎng)51 096 bp，包括9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，共轉(zhuǎn)錄3 048 bp的mRNA序列，可編碼1 015個(gè)氨基酸（圖2），LATS2蛋白分子式為C4 882H7 628N1 418O1 425S35，其相對(duì)分子質(zhì)量為110 110，等電點(diǎn)（pI）為8.84。

以L(fǎng)ATS2蛋白序列為對(duì)象，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建牛、綿羊、山羊、馬、豬、小鼠等物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）。構(gòu)建出的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明LATS2蛋白在牛、綿羊、山羊、馬、豬、小鼠等物種中進(jìn)化較為保守，反芻動(dòng)物在進(jìn)化過(guò)程中單獨(dú)聚為1支，上述結(jié)果表明LATS2具有重要功能且在反芻動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中極度保守。

2.3 牛LATS2蛋白互作分析

使用String（http：//string-db.org/）預(yù)測(cè)與LATS2蛋白互作的蛋白質(zhì)，得到圖4所示的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中與LATS2蛋白互作緊密的前10種蛋白質(zhì)分別為YAP1、MOB1A、MOB1B、SAV1、AMOTL2、WWC1、WWTR1、AMOT、AMOTL1、NF2，分析其信息，與KEGG收錄的Hippo信號(hào)通路成員及Biogrid收錄的與YAP1互作的蛋白質(zhì)進(jìn)行比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)篩選出的上述蛋白質(zhì)均為Hippo信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。

2.4 LATS2基因啟動(dòng)子核心區(qū)域鑒定

通過(guò)PCR擴(kuò)增到牛LATS2基因啟動(dòng)子1.7 kb序列，根據(jù)逐段缺失引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得7個(gè)逐段缺失的LATS2基因啟動(dòng)子片段（逐段缺失片段擴(kuò)增電泳見(jiàn)圖5）。進(jìn)一步連接pGL3-Basic載體，構(gòu)建得到了逐段缺失重組質(zhì)粒，將其命名為：pLATS2-1 792～+179、pLATS2-1 475～+179、pLATS2-1 098～+179、pLATS2-727～+179、pLATS2-515～+179、pLATS2-248～+179和pLATS2-56～+179。測(cè)序鑒定后，使用Lipofectamine 3000 Reagent脂質(zhì)體分別將pGL3-Basic質(zhì)粒和7個(gè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至3T3-L1和C2C12細(xì)胞系，檢測(cè)啟動(dòng)子的活性。相對(duì)熒光素酶活性數(shù)值（圖6）顯示，LATS2基因啟動(dòng)子區(qū)域的1.7 kb序列在C2C12和3T3-L1細(xì)胞系中均有較高的轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)缺失-1 098～-727片段后，pLATS2-727～+179較pLATS2-1 098～+179酶活性在C2C12細(xì)胞系中顯著下降（Plt;0.05）；進(jìn)一步缺失啟動(dòng)子片段-248～-56，發(fā)現(xiàn)pLATS2-56～+179較pLATS2-248～+179酶活性在C2C12和3T3-L1細(xì)胞系中均極顯著下降（Plt;0.01），分別下降了79.4%和75.6%。上述研究結(jié)果表明，LATS2基因啟動(dòng)子區(qū)域的1.7 kb序列活性較高，具備調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄活性的功能；-248～-56為L(zhǎng)ATS2基因啟動(dòng)子核心區(qū)域；LATS2基因在C2C12細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄活性高于3T3-L1。

2.5 啟動(dòng)子核心區(qū)域的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子鑒定

利用Genomatix和JASPAR軟件對(duì)LATS2基因啟動(dòng)子區(qū)和核心區(qū)域（-248～-56）進(jìn)行分析并對(duì)潛在的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖7）顯示，LATS2基因啟動(dòng)子核心區(qū)域包含轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子TEF1（TEAD1）、肌肉細(xì)胞特異性增強(qiáng)因子2A（MEF2A）、FOS樣抗原1（FOSL1）、肌細(xì)胞生成素（Myog）和生肌決定因子（Myod1），初步推測(cè)轉(zhuǎn)錄因子TEAD1、MEF2A、FOSL1、Myog和Myod1可能對(duì)LATS2基因的轉(zhuǎn)錄活性有重要的調(diào)控作用。

下劃線(xiàn)為引物序列，方框表示相對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，箭頭指示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。FEAD1：轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子TEF1;MEF2A：肌肉細(xì)胞特異性增強(qiáng)因子2A；FOSL1：FOS樣抗原1；Myog：肌細(xì)胞生成素；Myod1：生肌決定因子。

3 討論

骨骼肌是動(dòng)物軀體最重要的組成部分，占胴體質(zhì)量的40%左右，其發(fā)育程度直接影響甚至決定家畜的產(chǎn)肉量，LATS2基因?qū)?xì)胞的增殖、凋亡以及骨骼肌的形成有重要的調(diào)控作用，而調(diào)控機(jī)制并不清楚。已有文獻(xiàn)報(bào)道，LATS1基因[21]、LATS2基因[19]與湖羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育顯著相關(guān)。因此，本試驗(yàn)開(kāi)展了牛LATS2基因有關(guān)研究，成功克隆了牛LATS2基因啟動(dòng)子，檢測(cè)了啟動(dòng)子活性并鑒定到啟動(dòng)子核心區(qū)域，預(yù)測(cè)到該基因啟動(dòng)子核心區(qū)域中的重要轉(zhuǎn)錄因子，為探究牛LATS2基因在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

本研究中，牛LATS2基因在肝、背最長(zhǎng)肌、睪丸、肺、腎、皮下脂肪、心、皺胃、大腸和脾等不同組織或器官中均有表達(dá)，在肝中的表達(dá)量最高，背最長(zhǎng)肌其次，在心、肺、皮下脂肪、腎、皺胃、大腸和脾等組織或器官中相對(duì)表達(dá)量較低。上述研究結(jié)果表明LATS2基因在牛不同組織或器官中的相對(duì)表達(dá)量有差異，該基因的高表達(dá)可能影響肝以及肌肉組織的正常發(fā)育，這同LATS2基因表達(dá)量與湖羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育顯著相關(guān)[19]的結(jié)果一致。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，LATS2基因在反芻動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中保守性較高；預(yù)測(cè)出的前10種互作蛋白質(zhì)均為Hippo信號(hào)通路中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。Hippo通路的核心是一個(gè)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中，SAV1和MOB1形成一種復(fù)合體并在細(xì)胞質(zhì)中被磷酸化來(lái)調(diào)控LATS1/2表達(dá)，待LATS1/2被激活后，其激酶反過(guò)來(lái)去磷酸化并抑制轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP和TAZ。去磷酸化的YAP/TAZ進(jìn)入細(xì)胞核后與TEAD1-4等多種轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生互作，從而抑制凋亡的基因表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞增殖[24-25]。研究發(fā)現(xiàn)LATS1/2和Mst1/2可通過(guò)KIBRA、NF2、RASSF等多種上游信號(hào)分子調(diào)控Hippo信號(hào)通路的活性，如AMOT等因子通過(guò)結(jié)合LATS1/2將YAP/TAZ等因子緊密連接在細(xì)胞質(zhì)中，YAP/TAZ的磷酸化可進(jìn)行細(xì)胞信號(hào)調(diào)控。YAP/TAZ和LATS1/2的穩(wěn)定性可通過(guò)蛋白質(zhì)泛素化進(jìn)行調(diào)控[26]。綜上，LATS2基因在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞增殖分化中起重要作用。

通過(guò)啟動(dòng)子逐段缺失載體活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)牛LATS2基因啟動(dòng)子核心區(qū)域位于-248～-56，進(jìn)一步預(yù)測(cè)牛LATS2基因啟動(dòng)子核心區(qū)域有TEAD1、MEF2A、FOSL1、Myog和Myod1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。研究結(jié)果表明，TEAD1可調(diào)控肌肉特異性基因TNNT2、Mhc、α-actin[27]和COL1A1[28]的表達(dá)，在心肌、骨骼肌、平滑肌的發(fā)育方面有至關(guān)重要的調(diào)控作用[27-29]。TEAD1蛋白還可以與Hippo信號(hào)通路中YAP蛋白形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，從而抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[30]。MEF2A作為肌肉發(fā)生的重要核心因子，對(duì)骨骼肌和心肌細(xì)胞的增殖和分化有重要調(diào)控作用[31]，同時(shí)能夠促進(jìn)生長(zhǎng)因子、肌球蛋白重鏈及膠原對(duì)損傷骨骼肌的修復(fù)[32]；該因子能夠特異性識(shí)別并結(jié)合大多數(shù)肌肉基因啟動(dòng)子中的A/T序列，從而增強(qiáng)相關(guān)基因的表達(dá)[33]。FOSL1是轉(zhuǎn)錄因子AP-1復(fù)合體的組分之一，參與細(xì)胞的增殖和分化，抑制細(xì)胞凋亡，可介導(dǎo)Kras通路調(diào)控細(xì)胞周期蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)骨骼的發(fā)育[34]。Myog和Myod1作為調(diào)控肌肉細(xì)胞增殖、分化及肌纖維形成的關(guān)鍵基因[35]，突變會(huì)顯著影響肌肉纖維和肉質(zhì)特性[36]。其中，Myod1對(duì)發(fā)育初級(jí)階段肌肉的可塑性和再生起關(guān)鍵作用[35]，當(dāng)Myod1與PAX7共表達(dá)時(shí)，可激活基底膜靜息的肌肉衛(wèi)星細(xì)胞使其增殖[37]；Myog通過(guò)調(diào)節(jié)肌肉肌酸激酶影響骨骼肌的發(fā)生發(fā)育[38]，研究結(jié)果表明，敲除小鼠Myog基因后骨骼肌發(fā)育受損，出生后肌肉會(huì)出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象[39]。以上研究結(jié)果表明，TEAD1、MEF2A、FOSL1、Myog和Myod1轉(zhuǎn)錄因子在個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育以及肌肉形成過(guò)程中起重要作用，結(jié)合本研究關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)，我們可以推斷出上述5種轉(zhuǎn)錄因子對(duì)LATS2基因的轉(zhuǎn)錄可能起重要調(diào)控作用。但對(duì)于這一推斷將來(lái)還需要結(jié)合定點(diǎn)突變、凝膠遷移（EMSA）、染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）等技術(shù)手段進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

牛LATS2基因啟動(dòng)子核心區(qū)域位于-248～-56，啟動(dòng)子核心區(qū)域預(yù)測(cè)到TEAD1、MEF2A、FOSL1、Myog和Myod1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。LATS2基因的組織表達(dá)規(guī)律、啟動(dòng)子核心區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)及LATS2蛋白互作分析結(jié)果均表明LATS2基因在牛肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中扮演重要角色。以上結(jié)果為探究牛LATS2基因在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2022-06-15

基金項(xiàng)目：寧夏自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2021AAC05007）；寧夏重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2020BEB04011）；寧夏青年科技人才托舉工程項(xiàng)目（TJGC2019076）

作者簡(jiǎn)介：張久盤(pán)（1985-），女，河南商丘人，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種。（E-mail）zhangjiupan@163.com

通訊作者：魏大為，（E-mail）weidaweiwdw@163.com