利用WGCNA挖掘種公雞睪丸和附睪中影響精子活力的核心基因

摘要： 種公雞的精子活力對養(yǎng)禽業(yè)的可持續(xù)發(fā)展至關重要，通過加權基因共表達網(wǎng)絡（WGCNA）分析法挖掘種公雞睪丸、附睪中調控精子活力的基因共表達模塊和核心基因，并構建與種公雞精子活力相關的調控網(wǎng)絡。基于團隊前期對不同精子活力種公雞睪丸、附睪組織轉錄組測序數(shù)據(jù)的分析，用WGCNA方法構建基因共表達網(wǎng)絡，識別與表型性狀顯著相關的基因模塊，并對關鍵模塊基因進行GO功能注釋、KEGG通路富集分析。用Cytoscape軟件篩選每個關鍵模塊的核心基因并構建可視化共表達網(wǎng)絡。結果表明，14 227個基因聚類到11個模塊，以決定系數(shù)（R2）≥0.6、P＜0.05為標準挖掘出青綠色（Turquoise）模塊、黃色（Yellow）模塊、紅色（Red）模塊與表型顯著相關。對3個關鍵模塊的基因進行功能分析，發(fā)現(xiàn)這些基因顯著富集在核苷酸切除修復、同源重組、細胞色素P450對異類物質代謝、MAPK信號通路和細胞凋亡等通路上。選出的IFT家族基因與HMOX2、CYP4B1、ANG、ITGB2基因是與種公雞精子活力相關的核心基因，可作為提高精子活力的潛在基因。

關鍵詞： 種公雞；精子活力；加權基因共表達網(wǎng)絡（WGCNA）；核心基因

中圖分類號： S831.2 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）03-0762-08

Mining of hub genes affecting sperm motility in testes and epididymides of breeder cocks by WGCNA method

YUAN Jia-ni， ZHAO Yan-hui， SHI Yu-mei， NI He-min， GUO Yong， SHENG Xi-hui， QI Xiao-long，WANG Xiang-guo， XING Kai

（Animal Science and Technology College， Beijing University of Agriculture， Beijing 102206， China）

Abstract： The sperm motility of breeding roosters is crucial for the sustainable development of the poultry farming. The coexpression modules and core genes regulating sperm motility in testis and epididymis were explored by weighted gene co-expression network analysis （WGCNA）， and the regulatory network related to sperm motility in breeder cocks was constructed. The transcriptome sequencing data of testicular and epididymis tissues of breeder cocks with high and low sperm motility were analyzed. The gene co-expression network was constructed by WGCNA method， and gene modules significantly associated with phenotypic traits were identified. GO functional annotation and KEGG pathway enrichment analysis were performed for the module genes. Cytoscape software was used to screen key genes and visualize the co-expression network. The results showed that 14 227 genes were clustered into 11 modules， Turquoise， Yellow and Red modules were mined with R2≥0.6 and Plt;0.05 as criteria. Functional analysis of the genes in the three key modules showed that these genes were mainly enriched in nucleotide excision repair， homologous recombination， effects of cytochrome P450 on xenobiotic metabolism， MAPK signaling pathway， apoptosis and other signaling pathways. In this study， the selected IFT family genes HMOX2， CYP4B1， ANG and ITGB2 were core genes related to sperm motility of breeder cocks， which could be used as potential genes for improving sperm motility.

Key words： breeder cocks; sperm motility;weighted gene co-expression network analysis （WGCNA）;hub gene

種公雞在家禽生產中具有重要作用，每年每羽種公雞可以使超過1 000個種蛋受精[1]。對于家禽養(yǎng)殖業(yè)而言，高繁殖力的種公雞可以提高畜禽生產經(jīng)濟效益。精液品質是種公雞最主要的繁殖性狀，良好的精液品質可以提高種公雞的利用效率，加速雞的遺傳改良進程[2]。公雞的精液品質主要包括精液顏色、精子活力、精子密度等[3]，其中精子活力是精子生存能力、受精能力的體現(xiàn)，最能反映精液的品質。精子活力是高遺傳力性狀[2]，研究精子活力的分子遺傳機制是提高種公雞精子活力的有效方法。

加權共表達網(wǎng)絡分析（Weighted correlation network analysis，WGCNA）是通過構建共表達網(wǎng)絡研究基因功能的重要方法[4]。WGCNA利用基因共表達數(shù)據(jù)將大量基因劃分為少數(shù)模塊，將模塊與性狀關聯(lián)后可確定核心基因所在關鍵模塊，并篩選出核心基因[5]。用WGCNA分析法將表達模式相似的基因進行聚類[4]，分析基因與性狀之間的關系，在動物育種方面得到了廣泛應用。Liu等[6]通過對牛28個精子測序數(shù)據(jù)進行WGCNA分析，發(fā)現(xiàn)精子DNA甲基化可能會影響公牛的繁殖性能。Xu等[7]以湖羊睪丸為試驗材料，對不同月齡湖羊睪丸測序數(shù)據(jù)進行WGCNA分析，鑒定出2個與睪丸發(fā)育高度相關的基因模塊，還發(fā)現(xiàn)DNAH17、SPATA4、PDGFA、VIM和INHBA是影響睪丸大小的關鍵基因。Robic等[8]以影響豬睪丸類固醇代謝的CYP11A1或HSD17B3基因為核心，鑒定這2個基因所在模塊以尋找更多影響類固醇代謝的基因。目前尚無用WGCNA分析法鑒定種公雞精子活力關鍵基因的報道，本研究擬用WGCNA分析法鑒定種公雞睪丸、附睪中影響精子活力的核心基因，從而進一步闡明種公雞精子活力遺傳的分子機制。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集與處理

本試驗利用筆者所在課題組前期對不同精子活力的種公雞睪丸、附睪組織進行轉錄組測序所得數(shù)據(jù)[9-10]進行分析。試驗前期通過檢測種公雞的精子活力，各選取4羽高、低精子活力的公雞，屠宰后取睪丸、附睪組織。所取組織樣本分為G（睪丸）、F（附睪）2組，再根據(jù)精子活力分為H（高活力）、L（低活力）組。用TopHat2[11]、Haseq2[12]對轉錄組數(shù)據(jù)進行比對和定量，并除去表達量為0的基因。

1.2 共表達網(wǎng)絡的構建

用WGCNA分析包[13]構建基因共表達網(wǎng)絡。首先計算任意2個基因之間的相關系數(shù)，用pickSoftThreshold函數(shù)確定最佳軟閾值，選擇相關系數(shù)加權值（power）=7對關系矩陣進行冪運算，建立無尺度的鄰近矩陣。采用adjacency函數(shù)將鄰近矩陣轉換為TOM矩陣，根據(jù)TOM矩陣的相異程度，按照層次聚類法和動態(tài)剪切樹的標準進行基因聚類和模塊劃分。用模塊基因進行主成分分析（PCA），得到模塊特征值（ME）。

1.3 目標模塊的選擇

為了篩選與表型數(shù)據(jù)相關的模塊，計算模塊特征向量（ME）與樣本表型的相關程度。本研究以決定系數(shù)（R2）≥0.6、顯著性水平0.05為標準，選取與樣本表型顯著相關的模塊，表型數(shù)據(jù)見表1。

1.4 精子活力相關基因的篩選與網(wǎng)絡構建

將目標模塊中的基因導入STRING構建蛋白質互作網(wǎng)絡。使用Cytoscape軟件的cytoHabba插件計算基因的連接度，將結果排名前15的基因作為核心基因，繪制前10個基因的網(wǎng)絡圖。

1.5 目標模塊的GO和KEGG富集分析

用ClusterProfiler包對雞精子活力相關模塊內的基因作GO、KEGG富集分析，得出睪丸、附睪中參與精子活力調控的關鍵基因富集的生物學過程，閾值為0.05。

2 結果與分析

2.1 WGCNA分析

對定量數(shù)據(jù)除去表達量為0的基因后，得到14 227個基因用于加權基因共表達網(wǎng)絡分析。相關系數(shù)加權值（power）大于7時，網(wǎng)絡中基因之間的連接服從無尺度網(wǎng)絡分布，因此選取power=7構建無尺度網(wǎng)絡（圖1）。采用動態(tài)剪切法劃分，構建了11個模塊，基因聚類數(shù)量最多的青綠色（Turquoise）模塊含有6 753個基因，基因聚類數(shù)量最少的紫色（Purple）模塊僅含有49個基因，灰色模塊代表沒有被聚類的基因（圖2）。

2.2 模塊相關性與重要模塊的識別

每個基因共表達模塊與高、低精子活力睪丸和附睪組織的關聯(lián)性分析結果如圖3所示。以各基因聚類模塊的特征值為標準，發(fā)現(xiàn)黃色（Yellow）模塊與高精子活力睪丸的相關性最高，但相關性不顯著。青綠色（Turquoise）模塊是與低精子活力睪丸顯著相關的模塊（R2=0.6， P=0.01）。黃色（Yellow）模塊是與高精子活力附睪顯著正相關的模塊（R2=0.68， P=0.004）。紅色（Red）模塊是與低精子活力附睪顯著正相關的模塊，且決定系數(shù)為0.70（圖3a）。通過模塊相關性分析發(fā)現(xiàn)，紅色（Red）模塊與黃色（Yellow）模塊的相關性較高，因此可將這2個模塊作為影響精子活力的特異性模塊（圖3b）。

2.3 網(wǎng)絡構建與核心基因鑒定

圖4為3個模塊的網(wǎng)絡構建結果，由Cytoscape結果確定IFT74、TRAF3IP1、NUP153、NUP54、TTC30A、IFT80、NUP155、IFT81、IFT140和IFT57是青綠色（Turquoise）模塊的核心基因，CYP4B1、LOC421584、APOA4、ENSGALP00000006662、AGXT、SLC51A、GAL9、PLA2G12B、TM6SF2和FTCD是黃色（Yellow）模塊的核心基因，MYO1F、CTSS、FES、LOC100857714、RAC2、MYO1G、MPEG1、CCLI10、RSFR和ITGB2是紅色（Red）模塊的關鍵基因。此外，未繪入圖中的HMOX2、CYP4B1、ANG基因也是與種公雞精子活力相關的核心基因。

2.4 目標模塊中基因的生物學功能分析

Turquoise模塊的基因富集分析結果見圖5。生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）這幾個GO類別分別顯著富集的前2個條目分別為DNA修復、染色體結構，RNA聚合酶復合體、細胞質，催化活性作用于蛋白質和RNA結合（圖5a）。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，Turqueious模塊的基因顯著富集到核苷酸切除修復、核糖體生物發(fā)生和RNA降解等與核苷酸相關的通路上（圖5b）。

Yellow模塊的基因顯著富集在區(qū)域化、解剖結構形態(tài)發(fā)生和前置/后置模式規(guī)范3個生物學過程及DNA結合轉錄因子活性、轉錄調節(jié)器活性、序列特異性DNA結合等分子功能條目（圖6a）。細胞色素P450對異類物質的代謝、MAPK信號通路、谷胱甘肽代謝和藥物代謝-細胞色素P450是Yellow模塊基因顯著富集的信號通路（圖6b）。

Red模塊的基因顯著富集于免疫系統(tǒng)過程、白細胞的細胞-細胞粘連、對細菌的反應、對生物刺激的反應、對T細胞活化的正向調控和淋巴細胞活化等生物學過程（圖7a）。信號通路主要涉及細胞因子-細胞因子受體相互作用、產生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡、噬菌體、細胞黏附分子、細胞凋亡和緊密連接等（圖7b）。

3 討論

本研究通過WGCNA分析將14 227個基因富集到11個共表達模塊，利用各個模塊的ME值對各模塊與目標性狀進行相關性分析，得出精子活力性狀研究的3個關鍵目標模塊為Turquoies模塊、Yellow模塊、Red模塊。再通過互作網(wǎng)絡的連接度篩選得出，IFT基因家族、HMOX2、CYP4B1、ANG、ITGB2為影響精子活力的候選基因。

Turquoies模塊的基因主要參與核苷酸切除修復（NER）、同源重組和核糖核酸降解等與核糖體相關的通路。其中，核苷酸切除修復系統(tǒng)在精子發(fā)生過程中對于去除大塊DNA加成物至關重要[14]。研究發(fā)現(xiàn)，核苷酸切除修復參與大鼠睪丸的氧化應激[15]。通過對牦牛、牛睪丸轉錄組的分析發(fā)現(xiàn)，生精停滯導致雄性不育的差異長鏈非編碼RNA（lncRNA）富集在核苷酸切除修復通路上[16]，這與本研究結果相似。同源重組（HR）以程序化的DNA雙鏈斷裂（DSBs）的產生為起點，從而造成遺傳信息的交換和基因組的多樣性[17]。睪丸精子干細胞的同源重組途徑可以檢測DNA損傷修復[18]，因此同源重組對于睪丸精子發(fā)生至關重要。IFT家族基因和HMOX2是睪丸組織中與精子活力相關的關鍵基因。IFT基因家族中的IFT57、IFT74、IFT80、IFT81、IFT140和HMOX2是Turquoise模塊的核心基因，在低精子活力睪丸中高表達。IFT172的失活似乎對有絲分裂、減數(shù)分裂沒有影響，但會阻礙精子發(fā)生。IFT基因敲除會導致小鼠精子數(shù)量、活力減少60%，從而造成雄性不育[19]。早期研究檢測到HMOX1、HMOX2在人類睪丸等生殖器官中表達[20]，表明這些基因可能在動物睪丸中表達 。從Leydig細胞中的HO-1衍生的CO調節(jié)了精子發(fā)生并引起生殖細胞的凋亡[21]。HMOX2通過調節(jié)類固醇激素的生成來影響精子活力。IFT家族基因和HMOX2是睪丸組織中影響精子活力的基因。

Yellow模塊的基因可能在異類物質代謝、外源藥物代謝過程中發(fā)揮作用。細胞色素P450對異類物質代謝通路、MAPK信號通路和谷胱甘肽代謝通路是與高精子活力附睪顯著相關的通路。細胞色素P450對異類物質代謝在胚胎干細胞分化成精子干細胞的過程中發(fā)揮著重要作用，細胞色素P450基因家族內CYP450基因的相對表達量降低使得精子畸形率升高，并對精子活力、密度也有影響[22]，這與本研究結果相似。MAPK信號通路通過調節(jié)附睪中緊密連接蛋白質的表達和分布，有助于維持附睪儲存、精子成熟所需的腔內環(huán)境[23]。此外，MAPK信號通路影響Sertoli細胞的乳酸供應，并且MAPK信號通路在調節(jié)精原干細胞自我更新中也占據(jù)主導地位[24]。谷胱甘肽代謝是能量代謝的一種，其代謝產物半胱氨酸可以促進睪丸類固醇激素的合成，類固醇激素又可以合成睪酮、雄烯酮，因此谷胱甘肽代謝間接影響睪丸內精子發(fā)生相關激素的合成。谷胱甘肽代謝通路中的谷胱甘肽過氧化物酶5基因（GPx5）是在附睪中強表達的基因，GPx5可以調節(jié)附睪內活性氧自由基的濃度，促進精子發(fā)育成熟，維持精子完整性[25]。CYP4B1是Yellow模塊的核心基因，在高精子活力附睪中表達。CYP4B1是一種哺乳動物的細胞色素P450單加氧酶，能夠羥基化不飽和脂肪酸。Lahnsteiner等[26]研究發(fā)現(xiàn)，脂質的組成和代謝對精子活力有顯著影響。此外，Yellow模塊中的基因通過參與附睪的代謝活動來調控精子活力。

Red模塊的基因可以保護精子免受氧化應激的危害，具有抗凋亡、抗炎癥的功能。細胞因子-細胞因子受體相互作用、細胞凋亡、細胞黏附分子是與低精子活力附睪性狀相關的通路。研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子-細胞因子受體相互作用通路上相關基因的表達可導致雄性附睪炎，表明該通路參與附睪炎癥的發(fā)生[27]。通過探索新鮮、冷凍后解凍公豬精子中的miRNA、mRNA譜發(fā)現(xiàn)，新鮮、冷凍公豬精液的差異mRNA在細胞因子-細胞因子受體相互作用通路富集[28]，表明該通路是調控精子活力的通路。細胞凋亡是細胞在基因作用下的正常死亡，可以維持機體內環(huán)境的相對穩(wěn)定。在精子發(fā)生過程中，涉及生精細胞的凋亡，而生精細胞的凋亡可以維持支持細胞與生精細胞的數(shù)量平衡[29]。細胞凋亡通路上基因的表達與精子凋亡、精液質量顯著相關[30]，這與本研究結果一致。黏附分子在附睪中的表達可以調節(jié)附睪內的炎癥反應[31]。ANG、ITGB1是Red模塊內與精子活力相關的基因，其中ANG參與應激反應，在炎癥反應期間其表達量增加[32]。研究發(fā)現(xiàn)，ANG缺失阻止了炎癥誘導的精子中5′-tsRNA表達譜的改變，下調了線粒體氧化磷酸化、翻譯/核糖體途徑，進而影響精子活力[33]。ITGB1是細胞黏附分子家族基因中的1個基因，參與細胞表面黏附信號通路[34]。Matsuyama等[35]研究發(fā)現(xiàn)，ITGB1的表達使得精子數(shù)量減少，造成Sertoli-生殖細胞黏附連接的功能障礙。Azizi等[36]研究發(fā)現(xiàn)，ITGB1在精子分化過程中表達量下調。此外，ANG、ITGB1是與附睪組織炎癥反應有關的基因。

4 結論

本研究通過WGCNA分析，獲得了與雞精子活力相關的基因集，篩選出3個與精子活力顯著相關的模塊。關鍵模塊中的IFT家族基因、HMOX2、CYP4B1、ANG、ITGB2等基因在調控雞精子活力中發(fā)揮著關鍵作用。本研究結果為闡明種公雞睪丸、附睪調控精子活力的分子機制奠定了基礎。

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（責任編輯：徐 艷）

收稿日期：2022-06-25

作者簡介：原佳妮（1999-），女，山西晉城人，碩士研究生，研究方向為功能基因組學與生物信息學。（E-mail）BUAYjn@163.com

通訊作者：邢 凱，（E-mail）xk181986@163.com