雞HSP70家族基因鑒定及功能分析

摘要： 熱激蛋白70（HSP70）是一類廣泛存在于動植物體內的分子伴侶，并在各類生物或非生物脅迫過程中發揮重要作用。目前多種動植物體內的HSP70已經得到系統鑒定，但對于雞HSP70尚缺乏全面分析，鑒于此，本研究采用生物信息學方法對雞基因組進行挖掘、鑒定和分析。結果表明，在雞基因組中鑒定出17個HSP70基因家族成員，它們分散在7條染色體上，出現6次串聯重復，且無共線性。HSP70家族蛋白質理化性質差異較大，氨基酸序列長度為472～998 aa，包含15個酸性蛋白質和2個堿性蛋白質，僅HSPA13（rna-NM_001030793.4）出現1次跨膜。同一進化分支上，各成員的保守結構域具有一定相似性，且所有成員均具有Motif1。進化樹分析結果表明，雞、人、鼠3個物種HSP70中相同亞家族成員聚集在一起，表明HSP70家族在不同物種間具有一定的保守性。新城疫病毒感染雞的轉錄組數據分析結果表明，在新域疫病毒感染過程中，多數HSP70基因家族成員表達量發生不同程度下調，其中HSPA8（rna-NM_205003.3）和HSPA2（rna-NM_001006685.1）表達量下調明顯，二者有望成為新城疫防治的新靶點。本研究結果不僅為雞HSP70生物學功能研究奠定基礎，還為其他物種相關研究提供理論參考。

關鍵詞： 雞；HSP70家族基因；生物信息學；功能分析

中圖分類號： S831 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）03-0770-07

Identification and functional analysis of the chicken HSP70 family genes

ZHU Miao， LI Xin-ran

（School of Biological Sciences and Technology， Liupanshui Normal University， Liupanshui 553004， China）

Abstract： Heat shock protein 70 （HSP70） is a kind of molecular chaperone widely found in animals and plants， and plays an important role in various biotic or abiotic stress processes. At present， HSP70 has been systematically identified in various plants and animals， but there is still a lack of comprehensive analysis of chicken HSP70. In view of this， this study adopted bioinformatics methods to excavate， identify and analyze the chicken genome. The results showed that a total of 17 HSP70 gene family members were identified in the chicken genome， which were scattered on seven chromosomes， with six tandem duplications and no collinearity. The physical and chemical properties of HSP70 family proteins were quite different. The amino acid sequence length was between 472 aa and 998 aa， and there were 15 acidic proteins and two basic proteins. HSPA13 （rna-NM_001030793.4） was the only transmembrane protein. The conserved domains of members on the same evolutionary branch were similar to each other， and all members had Motif1. The results of phylogenetic tree analysis showed that the same subfamily members of HSP70 in chicken， human and mouse were clustered together， indicating that HSP70 family was conservative among different species. The results of transcriptome data analysis of chickens infected with Newcastle disease virus showed that the expression levels of most members were down-regulated in different degrees during the infection of Newcastle disease virus. The expression levels of HSPA8 （rna-NM_205003.3） and HSPA2 （rna-NM_001006685.1） were significantly down-regulated， and they were expected to become new targets for Newcastle disease prevention and treatment. The results of this study not only lay a foundation for the study of the biological function of chicken HSP70， but also provide a theoretical reference for the related research of other species.

Key words： chicken;HSP70 family genes;bioinformatics;function analysis

熱激蛋白70（Heat shock protein 70，HSP70），又名熱休克蛋白70，是動植物體內結構保守的一類分子伴侶，具有促進多肽折疊與去折疊、組裝、降解等多種功能，并在細胞穩態中發揮重要作用[1-2]。從結構上看，HSP70家族蛋白質含有3個主要的功能域，即N-末端三磷酸腺苷（ATP）酶結構域（NBD）、C端底物結合域（SBD）以及可變C端形成的“lid”結構[3-4]。HSP70家族成員可在多種生命進程中發揮重要調節功能[5-6]，當生物體遭受外界脅迫時，會促發HSP70在體內大量合成，并通過與靶蛋白結合的方式穩定生物大分子結構，保護生物體免受危害[7-8]。

雞作為世界上飼養數量最多的禽類動物[9]，每年出欄量約超過6.00×1010羽，已成為人類重要的動物蛋白質來源[10]。新城疫（Newcastle disease，ND）是危害禽類養殖業的主要疫病之一，具有傳播迅速、致死率高的特點，已被中國列為二類傳染病[11]，對ND的防治具有重要意義。隨著科學技術的完善和發展，雞全基因組測序已經完成，但目前關于雞HSP70家族基因研究的相關報道較少。本研究擬通過對雞HSP70進行鑒定和分析，全面解析該家族基因的結構特征、進化關系及其功能等信息，并進一步揭示雞HSP70在新城疫病毒（NDV）感染過程的調節機理，以期為新城疫的防治提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 雞HSP70家族蛋白質鑒定

雞基因組（版本號：bGalGal1.mat.broiler.GRCg7b，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome /？term=chicken）、注釋信息及新城疫感染的轉錄組數據（PRJNA675698）均來自NCBI數據庫，通過比對HSP70隱馬爾可夫模型（http：//pfam.xfam.org/）獲取雞HSP70氨基酸序列信息，并進一步利用保守結構域數據庫（CDD， https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/？term=）篩查其是否含有特征結構域，最終確定雞HSP70家族成員。

1.2 雞HSP70家族生物信息學分析

采用ExPASy（http：//web.expasy.org/protparam/）對雞HSP70家族蛋白質的等電點和相對分子質量進行分析；通過WoLF PORST（https：//wolfpsort.hgc.jp/）預測亞細胞定位；利用TMHMM-2.0網站（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）獲取雞HSP70家族蛋白質氨基酸序列長度和跨膜次數；使用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）預測雞HSP70保守基序；利用注釋文件獲取HSP70家族基因編碼區（CDS）和非編碼區（UTR）信息；采用GSDS實現基因結構可視化[12]；使用MEGA X鄰接法（NJ）構建雞、人、鼠的系統發育樹[13]。

2 結果與分析

2.1 雞HSP70家族蛋白質鑒定及其特性分析

本研究共鑒定出17個HSP70家族成員，氨基酸長度為472～998 aa，相對分子質量為52 133.88～112 040.80，包含2個堿性蛋白質（HSPA12A.3和HSPA12A.4，等電點為8.51）和15個酸性蛋白質（等電點為5.01～6.32）。亞細胞定位結果（表1）表明，有11個成員定位于細胞質，占比最多，有4個成員定位于內質網，而位于線粒體和胞外的成員相對較少。此外，除HSPA13有1次跨膜外，其余成員跨膜次數均為0次。

2.2 雞HSP70家族成員結構分析

為了更好地了解雞HSP70家族蛋白質結構特征，利用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）對蛋白質保守基序進行分析，結果（圖1a）表明，同一分支上的保守基序在數量和順序上的相似性較高，不同分支間差異較大，且所有成員均含有Motif1，表明該家族成員間可能具有相同的功能位點。Motif1～Motif10組成見圖1c。對于基因結構而言，在同一分支上，除了極個別成員相對其他成員的結構有較大差異外，從整體上看，CDS和UTR的構成基本相似（圖1b）。

2.3 雞HSP70家族成員系統發育分析

基于雞HSP70氨基酸序列，構建其與人、鼠HSP70家族成員的系統進化樹。圖2顯示，3個物種間均含有HSPH1、HSPA2、HSPA4、HSPA4L、HSPA5、HSPA8、HSPA9、HSPA12A、HSPA13、HSPA14以及HYOU1。但雞的HSP70家族中未發現HSPH1A、HSPH1B、HSPH1L、HSPA6（僅存在于鼠中）和HSPA7（僅存在于人中）。

2.4 雞HSP70家族基因染色體定位及共線性分析

根據基因定位信息繪制雞HSP70基因家族成員在染色體上的分布模式圖，圖3顯示，17個家族成員無規律分散在7條染色體上，其中1號染色體和6號染色體上基因分布較多，各有4個，4號染色體和5號染色體上基因分布較少，各有1個，此外，17個成員間共出現6次串聯重復。由圖3b可知，基因間未發現共線性，表明串聯重復可能是雞HSP70基因家族的主要擴張因素之一。

2.5 雞HSP70基因家族成員在新城疫病毒感染條件下的表達特性

為了解雞HSP70基因家族成員在生物脅迫環境中的調節機制，本研究分析了該家族成員在正常情況和新城疫病毒（NDV）感染情況下的基因表達量。圖4顯示，17個雞HSP70基因家族成員中有10個基因在NDV感染后表達量下調，1個基因表達量上調，其中HSPA8（rna-NM_205003.3）和HSPA2（rna-NM_001006685.1）的表達量下調明顯，表明二者可能在雞抵御NDV感染過程中發揮重要作用，有望成為新城疫治療的新靶點。

3 討論

HSP70作為熱激蛋白重要成員之一，在生物的抗逆脅迫和生長發育過程中發揮重要調節作用[14]，因此對雞HSP70家族成員的全面鑒定和分析具有重要意義。本研究通過生物信息學的方法共鑒定出17個HSP70家族成員，其在氨基酸序列長度、等電點、相對分子質量等方面均存在一定差異。亞細胞定位結果表明，雞HSP70主要分布在細胞質、內質網，推測HSP70家族成員可能在雞的整個生命活動過程中均發揮重要調節作用[15]。HSP70家族大多數成員定位于細胞質內，這與已報道的牛[16]以及綠豆[6]等動植物中HSP70家族成員的定位情況相一致。在福壽螺鑒定出的13個HSP70家族成員中有6個定位于細胞質中，其中有4個（PcaHSP70-1、PcaHSP70-4、PcaHSP70-8、PcaHSP70-9）在熱應激中表達量顯著變化[17]；而三疣梭子蟹的9個HSP70家族成員中有5個定位在細胞質中，其中HSC70l.2參與了低鹽脅迫反應[18]。在本研究中，定位于細胞質中的雞HSPA2和HSPA8參與了新城疫病毒感染宿主的過程，說明HSP70在細胞質中發揮功能是其應對各種生物和非生物脅迫的重要作用方式。保守基序和基因結構分析結果表明，同一分支上基因構成相近，不同分支間差異較大，這可能是導致基因功能發生分化或進化的原因之一[19]。通過構建雞、人和鼠的進化樹，發現3個物種中相同類型的HSP70家族成員各自聚集，表明HSP70家族成員在不同物種間具有一定穩定性，但同時雞中又缺少人和鼠的個別家族成員，該差異的產生可能是由于不同綱（雞屬于鳥綱，人和鼠屬于哺乳綱）物種間的親緣關系較遠。對雞HSP70家族成員進行進化樹分析，有助于根據其他物種中已驗證的基因功能推測雞中相近基因的功能，為后續對雞HSP70基因家族成員功能探索提供參考。

HSP70與病毒、細菌感染密切相關[20]。對雞轉錄組數據進行分析，發現在NDV感染過程中HSPA8（rna-NM_205003.3）和HSPA2（rna-NM_001006685.1）的表達量明顯下調，表明二者可能參與調控宿主體內病毒復制過程。HSPA8和HSPA2對體內病毒進行調控的作用機制已有相關報道，如HSPA8可調節雞巨噬細胞增殖、凋亡及其免疫功能，與巨噬細胞耐受性和自身穩定性相關[21]；HSPA2可通過與豬傳染性胃腸炎病毒非結構蛋白質發生互作，進而促進該病毒的復制[22]；乙肝病毒通過上調miR-382/19a可靶向抑制HSPA2表達，使HSPA2在Hep G2.215細胞系中表達下調[23]；HSPA8作為禽傳染性支氣管炎病毒的黏附分子，可以通過與該病毒發生互作的方式抑制此病毒在細胞中的復制[24]；此外，HSPA8還可通過與糖蛋白發生互作抑制埃博拉病毒顆粒復制[25]。綜上可知，HSPA2和HSPA8可能是抑制宿主體內病毒復制的潛在靶基因，但具體的靶向作用位點及作用機制有待于后續深入探究，本研究結果可為ND防治奠定理論基礎。

4 結論

關于HSP70在多種動植物體內的功能及其相關機制已得到廣泛研究［26-29］，但對雞HSP70家族成員的研究還遠遠不夠。本研究通過對雞HSP70基因家族成員進行鑒定及生物信息學分析，發現HSPA2和HSPA8可能是抑制NDV感染雞的潛在靶點，這一結果可為后續研究HSP70功能奠定理論基礎。

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（責任編輯：王 妮）

收稿日期：2022-09-07

基金項目：貴州省高校青年科技人才成長項目[黔教合KY字（2022）060]；六盤水師范學院高層次人才引進計劃項目（LPSSYKYJJ201803）

作者簡介：朱 淼（1987-），女，遼寧本溪人，碩士，實驗師，主要從事生化與分子生物學研究。（E-mail）331628524@qq.com

通訊作者：李欣燃，（E-mail）lixr1219@126.com