DLGAP5作為腎透明細胞癌的診斷標志物及其與CD8+T細胞的相關性

摘要：目的" 探討Discs大同源物關聯蛋白5（DLGAP5）表達在腎透明細胞癌（KIRC）中的作用。方法" 基于癌癥基因組圖譜（TCGA）分析KIRC中DLGAP5的表達情況與臨床參數之間的相關性。應用比例風險（Cox）回歸模型和Kaplan-Meier（K-M）分析評估了DLGAP5在KIRC患者中的預后價值。CIBERSORT分析DLGAP5和CD8+T細胞之間的相關性，基因集富集分析（GSEA）方法篩選和DLGAP5表達相關的生物學途徑。結果" 與正常腎臟組織比較，KIRC中DLGAP5的表達呈顯著上調。其高表達情況與腫瘤組織的分化程度、病理分期、復發和死亡均顯著相關。K-M分析結果表明，DLGAP5高表達與KIRC患者的不良總生存期（OS）和無進展生存期（PFS）相關，且DLGAP5是OS和PFS的獨立預后因子。免疫微環境分析表明，DLGAP5的表達量與多種腫瘤免疫細胞相關，尤其是CD8+T細胞。DLGAP5表達在“細胞周期”“泛素介導的蛋白水解”“蛋白酶體通路”和“T細胞受體信號通路”上顯著富集。藥敏分析結果顯示，高危組患者對阿昔替尼、舒尼替尼更敏感。結論" DLGAP5是KIRC的一種潛在生物標志物，與KIRC的診斷與預后顯著相關，這將為臨床的診斷與治療提供新的研究方向。

關鍵詞：DLGAP5;CD8+T細胞;KIRC;TCGA數據庫;預后

中圖分類號：R737.11" " " " " " " nbsp; " " " " " " " " 文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2023.07.001

文章編號：1006-1959（2023）07-0001-08

DLGAP5 as a Diagnostic Marker of Renal Clear Cell Carcinoma and its Correlation with CD8+ T Cells

LI Kun，HAN Na，FAN Zhi-xiang，CHEN Hong-run，JIN Shuang，ZHANG Zhong-mian

（Department of Oncology，the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450014，Henan，China）

Abstract：Objective" To investigate the role of discs large homolog associated protein 5 （DLGAP5） expression in renal clear cell carcinoma （KIRC）.Methods" The correlation between the expression of DLGAP5 in KIRC and clinical parameters was analyzed based on The Cancer Genome Atlas （TCGA）. The prognostic value of DLGAP5 in KIRC patients was evaluated by proportional risk （Cox） regression model and Kaplan-Meier （K-M） analysis. CIBERSORT was used to analyze the correlation between DLGAP5 and CD8+ T cells. Gene set enrichment analysis （GSEA） was used to screen the biological pathways related to DLGAP5 expression.Results" Compared with normal kidney tissues， the expression of DLGAP5 in KIRC was significantly up-regulated. Its high expression was significantly correlated with tumor differentiation， pathological stage， recurrence and death. K-M analysis showed that high expression of DLGAP5 was associated with poor overall survival （OS） and progression-free survival （PFS） in KIRC patients， and DLGAP5 was an independent prognostic factor for OS and PFS. Immune microenvironment analysis showed that the expression of DLGAP5 was associated with a variety of tumor immune cells， especially CD8+ T cells. DLGAP5 expression was significantly enriched in “cell cycle” “ubiquitin-mediated proteolysis” “ proteasome pathway”and “T cell receptor signaling pathway”. The results of drug sensitivity analysis showed that patients in the high-risk group were more sensitive to axitinib and sunitinib.Conclusion" DLGAP5 is a potential biomarker of KIRC， which is significantly related to the diagnosis and prognosis of KIRC， and will provide a new research direction for clinical diagnosis and treatment.

Key words：DLGAP5;CD8+ T cells;KIRC;TCGA database;Prognosis

腎透明細胞癌（KIRC）的發病率呈逐漸上升趨勢。30%的患者在確診為KIRC時已出現遠處轉移，60%的KIRC患者在確診后會在1～2年內死亡[1]。據此，需進一步加強探索對KIRC早期診斷和預后有價值的生物標志物。目前已經證實，KIRC的發生和發展是由決定腫瘤生物學行為的基因的異常表達觸發的[2]。因此，鑒定出具有潛在臨床意義的失調基因有助于改善KIRC的診斷和治療。既往研究表明[3]，癌細胞的分裂通常伴隨著有絲分裂相關因子和蛋白質的異常表達。機體調節胞內有絲分裂的相關因子和蛋白質水平及功能的一種重要機制是依賴于泛素-蛋白酶體途徑介導[4]。泛素及其起始酶系統和蛋白酶體系統成為了負責該調節過程的重要組成[5]。泛素-蛋白酶體途徑調節DLGAP5，而后者是被磷酸化參與有絲分裂過程的蛋白。在有絲分裂過程中位于紡錘體中，其通過調節細胞周期而發揮作用[6]，作為細胞周期的關鍵因子，在細胞惡變中也起著重要作用，例如在結直腸癌、乳腺癌和肺癌中作為潛在的致癌蛋白起作用[7，8]。有研究發現[9，10]，DLGAP5表達水平與非小細胞肺癌的總生存期（OS）和無復發生存（RFS）呈負相關，實驗發現DLGAP5沉默后，癌細胞的遷移和增殖能力被顯著抑制。據此，推測DLGAP5在KIRC的發生和發展中扮演重要角色。然而關于DLGAP5在KIRC中發揮作用的研究卻很少。本研究分析了KIRC中DLGAP5的表達譜及其在該疾病中的臨床意義，探討了DLGAP5與癌癥免疫浸潤之間的相關性，以及DLGAP5在KIRC中的生物學功能，現報道如下。

1數據與方法

1.1數據來源" 從TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov）-KIRC數據集中獲取了539個KIRC組織和72個正常對照樣本相關的mRNA-seq。于UCSC數據庫（https：//xenabrowser.net/）中搜索與TCGA數據庫中患者對應的臨床數據。去除沒有完整TNM分期和生存數據的樣本后，獲得了939組臨床數據。在獲得的信息中，527份完整包含了mRNA-seq 數據和臨床數據。采用R軟件中的edgeR包，通過設置Plt;0.05和|log2FoldChange|gt;2為閾值，鑒定正常組織與KIRC樣本之間的差異基因。此外，還使用基因表達譜交互分析（GEPIA）（http：//gepia.cancer-pku.cn/）數據庫。檢索了不同正常組織和癌組織之間的DLGAP5表達水平[11]。

1.2 CIBERSORT 算法" CIBERSORT（https：//cibersort.stanford.edu）是一個基于線性支持向量回歸原理的免疫細胞亞型表達矩陣反卷積的網絡工具，可用RNA-seq數據來估計相關免疫細胞的浸潤情況[12]。為了評估DLGAP5的表達對免疫細胞的影響，從TCGA下載了539個KIRC樣本的mRNA-seq。然后，根據DLGAP5表達量的中位數將539個腫瘤樣本分為低表達組和高表達組，并利用分析結果分別評估 DLGAP5和CD8+T細胞之間的相關性。

1.3基因集富集分析（GSEA）" 在KIRC中，為了探索與DLGAP5表達相關的富集通路，使用TCGA-KIRC數據集在GSEA中進行了探索，并計算標準化富集分數（NES）。當錯誤發現率（FDR）的p值和q值均在0.05以下時，則說明基因集呈顯著富集。

1.4統計學方法" T檢驗分析了不同臨床病理組之間DLGAP5表達量差異。通過ROC曲線計算曲線下面積（AUC）來判斷DLGAP5對KIRC的診斷意義。運用χ2檢驗分析不同臨床病理參數與DLGAP5的表達量水平之間的差異。R軟件（版本 4.0.3）用于統計分析，并計算最優分類點，將樣本分為高、低DLGAP5表達組。利用K-M分析和Log-rank檢驗的方法，對兩組的OS和PFS情況進行了分析。Cox比例風險模型確定了OS和PFS的獨立預測因子，同時還計算了其95%置信區間的風險比。當雙尾Plt;0.05時表示差異有統計學意義。GSEA（版本4.0.1）用于研究DLGAP5富集通路。

2結果

2.1 DLGAP5差異分析及診斷價值" 應用GEPIA分析方法研究了部分正常人體組織和腫瘤組織中DLGAP5的基因表達情況。與正常腎臟組織（n=72）相比，KIRC組織中DLGAP5表達量顯著上調（n=539）（Plt;0.0001），而正常人體組織中DLGAP5表達水平極低，見圖1A和1B，ROC曲線（AUC=0.933，Plt;0.0001）。圖1C也證實了DLGAP5上調在KIRC中具有相當大的診斷價值。

2.2 DLGAP5過表達與腫瘤進展相關" 根據DLGAP5表達量，將KIRC樣本分為低DLGAP5表達組和高DLGAP5表達組，并根據OS的最佳閾值檢測DLGAP5表達的臨床意義。兩組年齡比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05），見表1。然而，DLGAP5高表達與性別、腫瘤分化程度、晚期TNM分期、生存狀態和疾病狀態密切相關（Plt;0.05）。以DLGAP5 mRNA表達數據為連續變量，進一步證實了部分臨床病理組之間DLGAP5表達水平的差異（Plt;0.05），見圖2。

2.3 DLGAP5的高表達預測KIRC患者的OS和無進展生存期（PFS）" 根據最佳閾值生成K-M曲線評估DLGAP5在KIRC中的預后價值。觀察到DLGAP5高表達的KIRC患者具有相對較差的OS（HR=2.324， P=1.43E-08）和PFS（HR=2.602，P=5.32E-10），見圖3。此外，還進行Cox回歸分析，探討KIRC中影響OS的獨立因素，單因素分析顯示，年齡、TNM分期、組織學分級和DLGAP5表達與KIRC的OS顯著相關（Plt;0.05）。多因素分析證實，TNM分期、組織學分級、DLGAP5高表達是不良OS的獨立指標（Plt;0.05），見表2。

2.4 DLGAP5表達與KIRC免疫浸潤之間的相關性" 現已證實腫瘤浸潤淋巴細胞是腫瘤患者OS的獨立預后因素，因此試圖探討DLGAP5表達是否與KIRC 免疫浸潤有關。根據DLGAP5表達量的中位數將KIRC患者分為高、低表達組。依賴于CIBERSORT計算方式，分析呈現出兩組中22種不同免疫細胞亞型的比例。如圖4A所示，DLGAP5表達水平主要影響CD8+T細胞、M2巨噬細胞、CD4記憶靜息T細胞、單核細胞、活化的NK細胞等。進一步分析表明與低表達組比較，CD8+T細胞于高表達組中顯著增加（Plt;0.001）。相反，M2巨噬細胞、CD4記憶靜息T細胞、靜息肥大細胞、單核細胞、活化NK細胞在高表達組均顯著降低（Plt;0.05）。如圖4B所示DLGAP5表達量（N=611）與CD8+T細胞呈顯著正相關（cor=0.322，Plt;0.001）。KM分析表明高比例的CD8+T細胞與KIRC中的不良PFS相關（Plt;0.05），見圖4C。

2.5基因集富集分析" 通過GSEA研究KIRC中DLGAP5上調的潛在生物學功能，并發現“細胞周期”“泛素介導的蛋白水解”“蛋白酶體通路”和“T細胞受體信號通路”顯著富集（Plt;0.05），見圖5。

2.6免疫與基因表達" 考慮到基于檢查點抑制劑的免疫治療的重要性，進一步探討了高表達組與低表達兩組之間免疫檢查點表達的差異。37個檢查點基因在兩組之間存在顯著差異，包括許多已驗證的有效免疫治療靶點，如PDCD1（PD-1）、CD274（PD-L1）、CTLA4，見圖6。

2.7預后特征的藥敏分析" 采用“pRRophetic”R包預測化療藥物的IC50（指藥物誘導凋亡的能力，數值越低能力越強）。除免疫檢查點抑制劑外，多種靶向藥物成為晚期腎癌藥物治療的主要手段，可用于一線及二線選擇。因此，對需要靶向治療的患者進行藥物敏感性試驗是非常重要的。排除無效藥物，明確有效藥物進行治療，一直是腫瘤學界探討并攻克的難題。本研究中兩組有138種靶向藥物和部分化療藥物的IC50水平。其中選取了6種具有代表性的靶向藥物如圖7A～圖7F所示。發現替西羅莫司、阿昔替尼、博蘇替尼、索拉非尼、舒尼替尼及達沙替尼可能是治療高表達人群的首選藥物。

3討論

隨著遺傳學和分子生物學的發展，KIRC的早期診斷和更個性化的腫瘤管理得到了推動，其中至關重要的一步是關鍵生物標志物的識別。通過分析發現，與正常腎臟組織相比，KIRC組織中DLGAP5表達水平顯著上調。通過ROC曲線評估DLGAP5 mRNA表達水平對KIRC的診斷價值，提示DLGAP5可能是一種有利于KIRC分子和病理診斷的生物標志物。此外，本研究還評估了DLGAP5上調在KIRC中的臨床意義，并且發現KIRC的高表達與低分化腫瘤、晚期TNM分期、復發和死亡相關，提示DLGAP5可能與KIRC的發生和發展有關。K-M分析顯示，DLGAP5高表達的KIRC患者OS和PFS相對較差（Plt;0.05）。多因素分析也證實，DLGAP5高表達是KIRC中不利OS的獨立預后因素。上述結果表明，DLGAP5有望成為改善臨床決策的一個有價值的預后因素。

腎透明細胞癌易發生免疫浸潤，腫瘤微環境的特點強烈影響免疫治療的反應[13]。因此，本研究進一步探討了DLGAP5與腫瘤微環境之間是否存在潛在的聯系。GSEA顯示DLGAP5在T細胞受體信號通路中顯著富集。CIBERSORT分析顯示，DLGAP5的表達與KIRC中多種免疫浸潤水平有關，其中CD8+T細胞是受DLGAP5表達影響的主要免疫細胞。既往研究也發現，與其他21種免疫細胞相比，KIRC中CD8+T細胞的含量更高，且CD8+T細胞比例高與不良預后相關[14]，本研究中圖4A和圖4C的發現與該研究高度一致，進一步證明了DLGAP5與CD8+T細胞呈正相關（cor=3.22，Plt;0.01）。DLGAP5有望成為KIRC的免疫治療靶點。

DLGAP5在KIRC中的潛在生物學功能尚未完全闡明。富集分析表明，KIRC中DLGAP5的高表達與細胞周期、泛素介導的蛋白水解、蛋白酶體和T細胞受體信號通路有關，這些都被證實與腫瘤的發生和發展有關[15，16]。在細胞癌變過程中，DLGAP5通過調節細胞周期發揮功能，其表達水平在細胞周期中呈循環性變化[9]。此外，Li Y等[4]還發現，DLGAP5作為一種調節細胞周期的新基因，可以使癌細胞停滯于G2/M期，顯著提高乳腺癌細胞的生長、遷移和侵襲能力。因此，DLGAP5的過表達可能促進細胞周期紊亂和基因組突變的積累。

DLGAP5是一種由泛素-蛋白酶體機制調控的有絲分裂磷酸化蛋白，SCF是一種多組份復合物，是泛素偶聯物中的一種，其成分包括一些F-box蛋白的共同成分和可變成分[5]。Fbx7是DLGAP5水解酶介導的蛋白水解所必需的F-box蛋白。在SCFFbx7復合物中，Fbx7通過Cdk1-cyclin b磷酸化依賴的方式，招募DLGAP5通過其c端脯氨酸富集區（SCF核心復合物），誘導DLGAP5蛋白泛素化，高水平的DLGAP5蛋白導致有絲分裂相關因子的異常表達，而有絲分裂成分和細胞周期相關蛋白的表達異常，創造了腫瘤細胞發生增殖所需環境。

綜上所述，基于TCGA數據庫，本研究結果證明了預后標志物DLGAP5對KIRC的生存預后、腫瘤浸潤免疫細胞、免疫治療反應和藥物敏感性的預測價值。同時，還需要臨床試驗進一步證實本研究的觀察結果和DLGAP5預后價值的機制。

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收稿日期：2022-08-24;修回日期：2022-09-15

編輯/肖婷婷

基金項目：鄭州大學第二附屬醫院2020年度科技創新人才培育基金拔尖人才項目（編號：2020BJRCB04）

作者簡介：李坤（1990.5-），男，湖北仙桃人，碩士研究生，主要從事腫瘤基礎與臨床研究

通訊作者：張中冕（1964.12-），男，河南鄭州人，碩士，主任醫師，教授，主要從事腫瘤基礎與臨床研究