干旱生境下外源脯氨酸對紅砂氣孔形態的影響

摘要：本研究以大田環境內的紅砂（Reaumuria soongorica）為對象，噴施不同質量濃度（0，50，100，150，200，250 mg·L-1）的脯氨酸（Proline，Pro），以各處理的第0 d為對照（CK），測量第1，3，6，9 d的葉片氣孔特征（氣孔長、寬、面積和氣孔密度），以揭示紅砂氣孔對外源Pro的響應。結果表明：在各Pro處理、作用時間和Pro處理與作用時間的交互作用下，對葉片的氣孔特征都有顯著影響；各處理下，氣孔長與寬度、氣孔面積和密度間呈極顯著負相關（-0.680，-0.626，-0.690），其余指標間均達極顯著正相關（0.883，0.778，0.769）；對各Pro處理下的氣孔特征進行擬合，氣孔密度與面積、氣孔長度和寬度、氣孔長度和密度間均達極顯著水平（Plt;0.01），且具有相關性。因此，噴施外源Pro可減小紅砂葉片氣孔長，增大氣孔寬、面積和密度，顯著影響氣孔特征，可緩解干旱脅迫的不利影響，其中以100 mg·L-1濃度效果最佳，能顯著提高紅砂的抗旱性。

關鍵詞：外源脯氨酸；干旱脅迫；紅砂；氣孔特征；相關性分析

中圖分類號：S793.9文獻標識碼：A文章編號：1007-0435（2023）03-0777-08

Effects of Exogenous Proline Spraying on Stomatal Morphology of

Reaumuria soongorica under Arid Environment

SHI Wei-ning1， SU Shi-ping1*， LI Yi1， ZHANG Gong2， XI Jie1

（1.College of Forestry， Gansu Agricultural University， Lanzhou， Gansu Province 730070， China; 2.Tongwei County Forestry

and Grassland Service Center， Dingxi， Gansu Province 743300， China）

Abstract：In this study， Reaumuria soongorica was sprayed with different concentrations （0，50，100，150，200，250 mg·L-1） of proline （Pro） in the field environment. The 0th day of each treatment was used as the control （CK），and stomatal characteristics （length，width，area，and density） of leaves were measured on the 1st，3rd，6th，and 9th day after proline spraying to reveal stomatal response to exogenous Pro. The results showed that：the stomatal characteristics of leave were significantly affected by Pro treatment，the days after Pro treatment and the interaction between Pro treatment and the days after Pro treatmen. Under each treatment，there were significant negative correlations between stomatal length and stomatal width，stomatal length and stomatal area，stomatal length and stomatal density，and significant positive correlations between other parameters. The stomatal characteristics under each Pro treatment were analyzed by line or curve fitting. It revealed there was a significant correlation between stomatal density and area，stomatal length and width，stomatal length and density （Plt;0.01）. Therefore，exogenous Pro spraying can reduce stomata length，increase stomata width，area，and density，which significantly affected stomatal characteristics，and alleviate the adverse effects of drought stress. The concentration of 100 mg·L-1 was the best treatment，which could significantly improve the drought resistance of R. soongorica.

Key words：Exogenous proline;Drought stress;Reaumuria soongorica;Stomatal characteristics;Correlation analysis

自然氣候下的植物在每個生長階段都可能會面臨非生物脅迫，這會影響植物的生理、形態、物質代謝以及逆境相關基因表達，進而影響植物的生長發育［1-3］。隨著全球氣候改變，干旱災害越發頻繁，根系對養分和水分吸收降低，致使生長衰退，植物出現萎蔫，土壤荒漠化加劇［4-8］。當遭受干旱脅迫時，植物通過減小或關閉氣孔開度降低蒸騰作用，防止過多的水分流失來保證植物的正常生長［9］。因此了解植物響應干旱脅迫時氣孔形態特性等的變化非常重要，對荒漠化防治具有重要意義。

目前，國內外許多研究通過噴施外源物質，促使植物葉片氣孔形態特征發生變化，減緩環境壓力對植物的傷害。例如外源脫落酸（Abscisic acid，ABA）能增加UV-B脅迫下牛皮杜鵑（Rhododendron chrysanthum）的氣孔寬度來提高光合和蒸騰速率，增強牛皮杜鵑的耐受性［10］；外源硅（Silicon，Si）能提高干旱脅迫下玉米（Zea mays）氣孔器和氣孔的長寬，可增強抗旱性及提高產量［11］；外源褪黑素（Melatonin，MT）通過增大紫花苜蓿（Medicago sativa）的氣孔長度和寬度來響應鹽脅迫［12］。氨基酸積累是一種細胞內信號，可以穩定亞細胞結構、清除活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）和減少對脂質膜的氧化損傷，是植物應對非生物脅迫的一種抗逆性體現［13-15］。其中，脯氨酸（Proline，Pro）作為一種氨基酸，在外源物質施用中頗為廣泛，可參與非生物脅迫的多種機制［16-17］。有研究發現，外源Pro能明顯改善白刺（Nitraria tangutorum）的氣孔形態特征，緩解干旱脅迫的不利影響［18］；曾文靜等［19］發現，Pro處理下的玉米開度顯著上升，可提高抗旱性；Raghavendra等［20］證明，115 mg·L-1的Pro可導致圓葉鴨跖草（Commelina benghalensis）背面表皮氣孔部分關閉，且在任何氯化鉀（KCl）水平下都是部分抑制。

紅砂（Reaumuria soongorica）屬于超旱生小灌木，具有耐旱、抗逆性強等特點，適于生長在干旱半干旱地區，因其具有防風固沙的能力，常用于維持荒漠生態系統的穩定性，對植被的恢復具有重要意義［21-22］。由于極端氣候頻發，紅砂的荒漠植物群落面臨著退化或大面積死亡的風險，因此提高紅砂抗旱能力是一項重要舉措。國內外在紅砂耐鹽［23］、抗旱［24］等方面研究頗多，主要集中于抗氧化系統及滲透調節機制［25］、種子萌發［26］和光合及葉綠素熒光特性［27］等方面，通過外源激素緩解干旱脅迫也有報道［28-29］。

葉片是反映植物對環境響應的地上部分的最敏感器官，葉片氣孔是影響水分脅迫抗性的重要因素，植物可通過氣孔調節來響應環境變化［30-32］。目前，外源Pro緩解紅砂干旱脅迫的研究主要集中在生理特性等方面［4，29］，在葉片氣孔形態方面鮮有報道。基于此，本研究通過對處于干旱脅迫下的紅砂葉片噴施不同濃度Pro，探討氣孔形態變化，以期揭示氣孔響應干旱脅迫下，外源Pro的抗旱機理，同時發現緩解干旱脅迫的Pro的適宜濃度及提高紅砂抗旱性，為紅砂植被恢復以及維護紅砂的生態安全提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗地位于甘肅省武威市林業技術服務中心的超旱生植物良種基地（38°24′N，103°9′E），土壤pH值為7.2，土壤類型是砂質壤土，常年干旱少雨且蒸發量大，是典型的溫帶大陸性荒漠氣候，海拔1 378 m，年均氣溫6.9℃，年均降水量113.2 mm，年均蒸發量2 604.3 mm。

試驗選取長勢良好且基本一致，無病蟲害的同一家系的2年生紅砂幼苗進行處理。

1.2試驗設計

1.2.1前期干旱處理在2022年4—7月對選定的試驗區（環境相對均一）停止人為灌溉，水分來源依靠自然降水。在2022年7月15日，用EM50（美國）測定土壤含水量最低，達2.5%，進行Pro噴施處理。

1.2.2外源脯氨酸處理在7月15日進行人工噴施外源脯氨酸，設置6個濃度梯度（0，50，100，150，200，250 mg·L-1），以第0 d作為對照，每個處理設置3個重復，每個重復設置6株，共108株。用手持式噴霧器在無風、晴朗的17：00對紅砂葉片進行不同濃度的脯氨酸進行噴施，以葉面掛滿水珠滴落為宜。期間進行防雨措施，避免降雨對試驗造成影響。

1.2.3葉片采樣以處理日作為第0 d，在處理后第1，3，6，9 d，早晨露水散盡后，采集無病害葉片并截取中間段，立即放入裝有2.5% 戊二醛固定液的5 mL離心管中，用于電鏡掃描樣品制備。

1.3氣孔特征測定方法

1.3.1電鏡掃描的樣品制備和觀察制備和觀察參考魏斌［18］的試驗方法。

用蒸餾水將葉片表面沖洗干凈，截取中間段放入2.5% 戊二醛固定液中，抽真空下沉，在4℃下固定2 d，最長不超于4 d。用磷酸緩沖液（0.1 mol·L-1，pH值 7.1）清洗3次，每次15 min，用梯度為 30%，50%，70%，80%，90%，95%乙醇，每次15 min進行3次逐級脫水，再用體積分數為100%叔丁醇置換2次，每次20 min。將脫水樣品進行干燥后，粘貼在掃描電鏡樣品臺上，用真空離子濺射儀噴鍍金屬膜，最后在掃描電鏡下觀察成像，每枚葉片在顯微鏡下隨機選取20個視野進行統計。

氣孔面積=3.14×1/4×（氣孔長×氣孔寬）

1.4數據處理和分析

采用ImageJ2x軟件對紅砂葉片氣孔長、氣孔寬進行測量，計算出氣孔面積和氣孔密度（單位面積內氣孔的數量）。試驗數據通過Excel進行整理，數據表示為：平均值±標準差。采用雙因素方差分析分析Pro、處理時間兩種因素對紅砂葉片氣孔形態的影響，利用單因素方差分析同一指標下，不同處理對氣孔形態特征的影響，利用Duncan檢驗各組間的顯著性差異（Plt;0.05），均在SPSS 25.0中進行。并利用Origin 8.5軟件進行作圖。

2結果與分析

2.1不同脯氨酸質量濃度對紅砂葉片氣孔的影響

不同脯氨酸處理下，紅砂葉片氣孔形態與對照組相比發生不同程度的變化。由圖1可觀察到氣孔保衛細胞為腎形，氣孔呈橢圓形，在Pro濃度為0 mg·L-1時，氣孔微張，在Pro濃度達到100 mg·L-1時，氣孔開張度增大。

2.2各處理下氣孔特征的影響

由表1可以看出，氣孔密度和長度在處理時間與Pro濃度交互作用為顯著差異外（Plt;0.05），其余各性狀在處理時間、Pro濃度、處理時間與Pro濃度交互作用間均達到極顯著差異水平（Plt;0.01）。

2.3Pro與時間處理對紅砂氣孔長度的影響

如圖2所示，隨Pro處理濃度的增加，氣孔長度呈現先減小后增大的趨勢；氣孔長度隨時間的推移總體呈現增大趨勢。

在50～200 mg·L-1各濃度處理下，隨著時間的延長，氣孔長度先減小后增大，與未經Pro噴施的干旱處理相比，第1 d達到最小值，第9 d與第0 d相比，分別增加4.27%，3.58%，4.83%和7.40%，其中100 mg·L-1增幅最小；當濃度為250 mg·L-1時，氣孔長度隨試驗天數的增加持續增大。研究表明，噴施適當濃度的Pro有助于減小氣孔長度來緩解干旱脅迫的影響，但過高濃度的Pro反而會促進氣孔長度的增大。

2.4Pro與時間處理對紅砂氣孔寬度的影響

如圖3所示，在處理的9 d期間，與未經Pro處理組相比，氣孔寬度變化明顯，說明不同濃度的Pro處理組對紅砂葉片氣孔寬度有明顯影響。隨Pro處理濃度的增加，氣孔寬度先增大后減小；氣孔寬度隨時間的推移呈現出先增大后減小的變化趨勢。

各濃度處理下，隨時間的延長，氣孔寬度先增大后減小，差異顯著（Plt;0.05）。當濃度≤200 mg·L-1時，早期氣孔寬度增大，在第3 d達到最大值，第9 d與第0 d相比，50～200 mg·L-1分別減小37.79%，1.15%，4.51%和16.41%，其中100 mg·L-1減幅最小；當濃度=250 mg·L-1時，在第1 d達到最大值，第9 d跟第0 d相比，氣孔寬度減小39.22%。表明100 mg·L-1的處理效果最明顯，可緩解干旱對紅砂的不利影響。

2.5Pro與時間處理對紅砂氣孔面積的影響

如圖4所示，隨Pro濃度的增加，氣孔面積呈先增大后減小的趨勢；氣孔面積隨時間的推移總體呈現出減小趨勢。

未經Pro噴施的干旱處理，氣孔葉片隨時間延長呈現先增長后降低的變化趨勢，且在第6 d達到最大值。在50～200 mg·L-1各濃度的Pro處理下，隨著時間的延長，氣孔面積先增大后減小，在早期可以增大葉片氣孔面積，在處理第3 d達到最大值。50 mg·L-1濃度處理下，第9 d與第0 d相比，氣孔面積減小5.55%；100～200 mg·L-1在第6 d也開始降低，但在第9 d的氣孔面積仍大于第0 d，氣孔面積分別提高23.85%，23.68%和10.55%，其中100 mg·L-1增幅最大；在250 mg·L-1處理的9 d時間內則逐步減小，減小31.86%。可見，100 mg·L-1處理下效果最明顯，可緩解干旱對紅砂的不利影響。

2.6Pro與時間處理對紅砂氣孔密度的影響

如圖5所示，隨Pro濃度的增加，氣孔密度呈先增大后減小的變化趨勢；氣孔密度隨時間的推移總體呈現出減小趨勢。

在濃度≤200 mg·L-1各濃度處理下，氣孔密度隨時間的延長先增大后減小，在處理第3 d達到最大值，第6 d開始下降。在50 mg·L-1，150 mg·L-1和200 mg·L-1處理下，第9 d與第0 d相比，氣孔密度分別減小1.33%，1.54%和8.64%；雖然100 mg·L-1處理在第6 d開始降低，但第9 d的氣孔密度仍大于第0 d，氣孔密度可提高3.83%；250 mg·L-1處理下的氣孔密度在9 d時間內減小15.54%。可見，噴施適宜濃度的Pro可緩解干旱對紅砂的脅迫影響，過高的Pro濃度抑制氣孔的發生，使氣孔密度減小。

2.7氣孔形態特征各指標間的關系

各指標相關系數見表2，氣孔長與氣孔寬度、氣孔面積和氣孔密度間呈極顯著負相關（-0.680，-0.626，-0.690），其余指標間均達極顯著正相關關系（0.883，0.778，0.769）。

2.8各Pro處理間氣孔形態特征間的關系

對不同Pro處理下的氣孔形態特征進行線性擬合和非線性擬合。如圖6所示，氣孔密度與面積、氣孔長度和寬度、氣孔長度和密度間均達極顯著水平（Plt;0.01）。

如圖6A所示，Pro處理下氣孔長度隨寬度的增大而減小；0～200 mg·L-1處理下的氣孔密度隨長度的增加呈現先增大后減小趨勢（圖6B）；圖6C中，氣孔密度與寬度之間呈線性關系；圖6D可以看出，0 mg·L-1Pro處理下氣孔密度隨面積的增加而減小，100 mg·L-1下氣孔密度隨面積增加而增加，而其余濃度處理下，氣孔密度隨面積的增加呈現先減小后增大的變化趨勢。

3討論

水分是植物生長代謝過程中必不可少的原料和介質，水分不足會影響植物的光合作用和氣孔特征，對生長發育造成不利影響，并產生多種防御機制來應對面臨的困境［33-35］。氣孔是由兩個保衛細胞圍成的能與外界進行水氣交換的小孔［36］。氣孔運動在控制氣體交換和平衡需水量方面具有重要作用，植物可通過氣孔調節來響應環境變化，維持植物正常的生命活動［37］。Pro葉面噴施可改變植物氣孔形態來響應干旱脅迫［38］。本試驗通過對紅砂葉片氣孔進行掃描電鏡觀察，表明噴施適宜濃度的外源Pro可減小氣孔長度及增大氣孔寬度、面積和密度，緩解干旱脅迫對植物的影響。

結果表明，干旱脅迫下的紅砂氣孔長度會隨時間的延長而增大。這與Sun等［39］對干旱脅迫下噴施外源磷脂酰膽堿保持桃（Prunus persica （L.） Batsch.）根細胞膜完整性研究結論一致，說明紅砂保衛細胞在水分充足的情況下呈現圓潤狀態，面臨干旱脅迫時，葉氣孔會形成更長的氣孔，保證在失水時能吸收足量的CO2進行正常的光合作用來減緩傷害。噴施外源Pro，可減小細胞伸長，使氣孔長度縮小，這是因為Pro緩解了因水分不足而使紅砂氣孔呈現的細而窄的特點。

干旱脅迫下，葉片氣孔寬度和面積減小，甚至關閉氣孔。這是因為葉綠素合成受阻，致使葉綠體和線粒體等功能損傷，光合強度下降，引起葉片中細胞碳水化合物含量下降和氣孔保衛細胞滲透壓下降，故不能從環境中吸水膨脹，氣孔縮小［40］。這與薛澤民等［41］、王凱麗等［42］研究的干旱脅迫下植物葉片氣孔寬度減小的結論相同。在植物遭受干旱脅迫時，水力控制理論和化學信號（ABA）理論在調控氣孔運動方面得到了廣泛的支持［36］。此外pH值的變化也是調控氣孔運動的一種信號，木質部等空間的汁液pH值會在干旱脅迫下升高，使ABA分子解離形成ABA－，葉肉細胞胞質酸化，讓更多的ABA運輸至保衛細胞調控氣孔運動［36］。本研究中，噴施適量的Pro可增大氣孔寬度和面積，一方面是因為滲透調節物質含量的增加，可降低滲透勢并保持膨壓，增大氣孔寬度；另一方面Pro參與葉綠素的合成，導致光合強度、碳水化合物含量及氣孔保衛細胞滲透壓上升，氣孔寬度增大［4，43］。有研究［4］表明，外源噴施Pro可補充干旱脅迫下紅砂的內源Pro、可溶性糖（soluble sugar，SS）和可溶性蛋白（Soluble protein，SP）的含量，因此氣孔寬度增大。

本研究表明，紅砂通過減小氣孔密度來響應干旱脅迫。這與張瀚等［44］在PEG模擬干旱脅迫下的五唇蘭（Phalaenopsis pulcherrima）葉片氣孔密度研究一致。干旱脅迫下，紅砂氣孔密度呈現逐漸減小趨勢，一方面是因為干旱產生過量可參與調控氣孔運動的活性氧H2O［45］2，抑制保衛細胞細胞質膜的內向K+通道［46］，而K+流出會降低膨壓，促進氣孔關閉或抑制氣孔發生，從而降低氣孔的密度；另一方面氣孔密度是由葉片氣孔數和葉面積共同決定［47］，干旱脅迫會通過關閉部分氣孔或減少葉片氣孔數、減小葉面積和降低葉片內水分過度散失而帶來的傷害，最終葉片氣孔數減小幅度大于葉面積減小幅度，氣孔密度降低［48］。施用100 mg·L-1的外源Pro可增大氣孔密度，是因為SOD，CAT等抗氧化酶的活性增強有效的清除了活性氧的毒害［4］，從而導致H2O2濃度下降，促進氣孔分化，氣孔數目和密度增加；同時K+等滲透調節物質的含量增加，保衛細胞滲透勢降低，導致氣孔保衛細胞的伸長減小、氣孔開張且密度增大［49］；另一方面是因為植物體內相關基因的表達促進氣孔發生，影響氣孔密度［50］，在劉炫杉［51］的研究中證明擬南芥基因HSL3通過調節保衛細胞中H2O2水平進而調節氣孔關閉的能力。

本研究發現，過高的Pro濃度可加劇干旱對紅砂的傷害，是因為過量Pro積累在代謝過程中向呼吸鏈輸送電子，使電子超載而外泄，造成ROS的大量累積，損害蛋白質等大分子，這與Verbruggen等［52 ］的研究結果一致。

4結論

在干旱脅迫下，噴施不同質量濃度的外源Pro，利用掃描電鏡對紅砂葉片氣孔進行觀測。結果表明，在不同濃度Pro、處理時間的不同、不同濃度與處理時間的交互作用下的葉片氣孔長、氣孔寬、氣孔面積和氣孔密度均差異顯著。噴施適宜的Pro可以減小葉片氣孔長，增大氣孔寬、面積和密度，來緩解干旱脅迫對紅砂的傷害，其中100 mg·L-1下的處理效果最明顯。

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（責任編輯劉婷婷）