人體腸道中多雷擬桿菌的分離與鑒定

摘 要：目的：從健康人體腸道菌群中分離篩選出擬桿菌菌株，并進行鑒定培養。方法：從4位無腸道疾病史，且在研究前近1個月內未使用抗生素的健康供體中采集糞便樣品，于添加有血紅素、維生素K1的腦心浸液肉湯培養基中初篩，再于添加有脫纖維羊血、血紅素、維生素K1的布氏瓊脂培養基復篩，將篩選到的菌株進行形態學及培養特征的觀察、革蘭氏染色及顯微鏡的鏡檢、生理生化鑒定、菌落PCR反應和16S rRNA保守序列測定與分析，以確定種屬。結果：篩選得到的NG01菌株經厭氧培養后在血平板上產生灰白色、不透明、表面光滑、邊緣規則、濕潤、輕微隆起、呈圓形、中等大小的菌落，菌株專性厭氧，呈革蘭氏陰性，無芽孢，棒桿狀，排列無規則，能發酵葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖等，不發酵D-山梨醇、肌醇、核糖等，氧化酶和過氧化氫酶檢測均呈陰性。經Blast序列比對，NG01菌株與Bacteroides dorei 175的16S rRNA相似度達到98.96%。結論：分離得到的NG01菌株在細菌形態、培養特性、生理生化反應結果符合擬桿菌屬特征。

關鍵詞：腸道菌群；多雷擬桿菌；分離鑒定；16S rRNA測序

腸道菌群是人體腸道微生物區系的重要組成部分，其中含有將近1 000種菌^[1-2]，能夠對食物起到二次消化、吸收的作用。擬桿菌屬在糞便中是優勢菌種，占糞便微生物的30%～40%，每克糞便中該菌屬含量可達到10⁹～10¹¹個，比腸桿菌及腸球菌還要高出4～7個數量級^[3-4]。因此，糞便是篩選擬桿菌株的天然優質來源。擬桿菌屬又稱類桿菌屬，是呈棒桿狀、專性厭氧、不產芽孢的革蘭氏陰性菌^[5]。擬桿菌屬以脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）為模式菌株，是人體腸道菌群的主要成員^[6]，有助于維持正常的腸道生理功能。21世紀益生菌研究領域空前發展，乳酸菌、雙歧桿菌、糞鏈球菌等作為第一代益生菌已應用于微生態學制劑以及人體疾病預防和保健^[7]。擬桿菌憑借其自身獨特的性質及理想的人體腸道來源，很有可能成為第二代益生菌的主力菌株，從而起到緩解疾病、恢復人體健康的作用^[8]。因此，開發利用尚未被人發現的擬桿菌，對促進與中國人腸道結構特征兼容的益生菌產品的開發過程具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 磷酸緩沖液溶液（PBS），中國吉諾生物醫藥技術有限公司；酵母提取物、血紅素、維生素K1、脫纖維羊血、細菌生理生化特性鑒定用的葡萄糖發酵管、蔗糖發酵管、3% NaCl甘露糖、乳糖發酵管、山梨醇發酵管、肌醇發酵管、D-核糖、2%過氧化氫酶試劑、氧化酶試紙、厭氧培養袋、厭氧產氣包、氧氣指示劑，中國海博生物技術有限公司；TIANamp Bacteria DNA Kit 離心柱型細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR Kit 聚合鏈式反應試劑盒，中國杭州眾鑫儀器有限公司。

1.1.2 培養基 腦心浸液肉湯（BHI）、布氏瓊脂培養基（Brucella Agar），中國海博生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 糞便樣品的采集和預處理 選擇4位1個月內沒有藥物、抗生素、益生菌使用史的健康成人作為研究對象，其中男性2人、女性2人。研究對象自行采集晨起第一次排出的新鮮糞便中間段沒有接觸空氣和地面的部分，然后將其放入糞便樣本采樣管內，以此為實驗樣品。配制磷酸緩沖液PBS：NaCl 8.0 g/L、KCl 0.2 g/L、Na₂HPO₄ 1.44 g/L、KH₂PO₄ 0.24 g/L，用磷酸將pH調至6.8，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。于超凈臺內稱取10 g糞便于無菌容器中，加入80 mL無菌PBS緩沖液，充分攪拌懸浮后用無菌三層紗布過濾，得到糞便原液，取1 mL用血細胞計數板計數，其余立即置于厭氧環境中靜置備用。

1.2.2 改良培養基配制 BHI商品培養基粉末38.5 g/L，酵母提取物5 g/L，調pH至7.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，冷卻至50 ℃以下加入血紅素5 mg/L、維生素K1（VK1）1 mg/L，商品VK1濃度為0.02%，每支含量1 mL，因此，每200 mL BHI培養基需加入1支商品VK1。配制布氏瓊脂培養基：布氏瓊脂商品粉末6.75 g，用NaOH調節pH至7.5，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，脫纖維羊血56 ℃水浴保溫30 min，平板冷卻至50 ℃以下時加入5%脫纖維羊血、5 mg/L血紅素、1 mg/L VK1。

1.2.3 BHI初篩 菌液用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，分別稀釋10⁷、10⁸、10⁹倍，然后取96孔板加入180 μL BHI培養基及20 μL經梯度稀釋后的菌液，于37℃厭氧培養，每個梯度平行3次。

1.2.4 布氏瓊脂血平板復篩 96孔板培養3～4 d后取出觀察，記錄有明顯渾濁的孔位，將這些渾濁的菌液稀釋10²、10³、10⁴倍，取100 μL涂布于布氏瓊脂血平板上，于37℃厭氧培養。

1.2.5 鏡檢 目前已知一系列擬桿菌屬的傳統形態學特征，普遍意義上該屬菌落呈灰白色、圓形、凸起，該菌屬專性厭氧，呈小桿狀，革蘭氏染色陰性，本研究根據這一系列傳統特征進行初篩。布氏瓊脂血平板培養1～2 d后取出，觀察菌落特征，記錄有明顯菌落產生的平板，挑取單菌落于BHI液體培養基內進行37 ℃厭氧培養，另設對照組于有氧、微氧條件下培養。培養1～2 d后觀察菌液是否渾濁，取需氧下澄清，而微氧、厭氧下渾濁的菌株，顯微鏡下鏡檢、染色觀察細菌形態。

1.2.6 生理生化鑒定 （1）葡萄糖發酵實驗：取一內盛2 mL無菌水的ep管，用接種針從平板上挑取已純化單菌落至無菌水中仔細混合成均勻細菌懸液，取3滴滴入葡萄糖發酵管中，接種完后用封口膜封口并放入36 ℃的環境中培養18～24 h。結果觀察：陽性為黃色，陰性為藍色或藍綠色。（2）蔗糖發酵實驗：取蔗糖發酵管，接種方法、培養條件及結果觀察均同上。（3）甘露糖發酵實驗：取甘露糖發酵管，接種方法、培養條件及結果觀察均同上。（4）D-山梨醇發酵實驗：取山梨醇發酵管，接種方法、培養條件及結果觀察均同上。（5）肌醇發酵實驗：取肌醇發酵管，接種方法及結果觀察均同上，培養條件為28℃培養18～24 h。（6）乳糖發酵實驗：取乳糖發酵管，接種方法、培養條件同上。結果觀察：陽性為黃色，陰性為灰紫色、紫色或紫紅色。（7）核糖發酵實驗：取核糖發酵管，接種方法、結果觀察同上，培養條件為24～48 h。（8）過氧化氫酶實驗：滴加2～3滴3%過氧化氫酶試劑至菌落或培養基中。結果觀察：陽性為產生氣泡，陰性為無氣泡產生。（9）氧化酶實驗：將氧化酶試紙用蒸餾水浸濕，用細玻璃棒或一次性接種針挑取單個菌落涂在試紙上。結果觀察：在30 s內變為藍色或藍紫色為強陽性，2 min內不變色為陰性。

1.2.7 菌落PCR擴增與測序 在無菌PCR管中加入20 μL Triton-×100，挑取單菌落于其中充分混合，另設不加菌落為空白對照組。PCR管于100℃恒溫水浴2 min，取1 μL上清液為模板，于25 μL PCR反應體系中進行PCR反應，引物采用16S引物（上游引物Eub338F為ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，下游引物Eub518R為ATTACCGCGGCTGCTGG）^[9]。25 μL PCR擴增體系組成為基因組DNA模板1 μL、上游引物（10 μmol/L）1 μL、下游引物（10 μmol/L）1 μL、2xTaq Plus PCR MasterMix 12.5 μL、超純水 9.5 μL。PCR反應循環程序：①94 ℃預變性3 min；②94 ℃變性30 s；③55 ℃退火30 s；④72 ℃ 延申1 min；⑤將上述3個步驟循環30次；⑥最后在72 ℃延伸5 min。PCR反應結束后，取5 μL反應液在60 V、90 min條件下進行5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，隨后送至生工生物公司進行16S rRNA測序，測序結果于NCBI網站進行blast比對。最后利用MEGA 6.0軟件采用鄰接法、Bootstrap重復次數為1 000次構建系統發育樹，根據親緣關系分析判斷篩得菌株的種屬。

2 結果與分析

2.1 菌落特征觀察

經厭氧培養后觀察在血平板上生長出的菌落形態，發現有兩株菌落為灰白色、不透明、表面光滑、邊緣規則、濕潤、輕微隆起、呈圓形、中等大小、直徑為1～2 mm，如圖1所示，這些條件符合公認的擬桿菌菌落形態，編號這兩株菌株為NG01和NG02，其中NG01的菌落直徑稍小于NG02，且菌落數量多于后者。

2.2 菌體形態觀察及革蘭氏染色鏡檢

NG01和NG02菌液于顯微鏡下鏡檢如圖2所示，均呈小棒桿狀、無芽孢、排列無規則，常單獨存在，少見群集。革蘭氏染色后，菌體鏡檢結果呈紅色，如圖3所示，說明NG01、NG02菌株均為革蘭氏陰性，符合擬桿菌為革蘭氏陰性的特性。

2.3 厭氧實驗

將培養于BHI培養基中的NG01、NG02菌株分別置于有氧、微氧及無氧條件下培養，發現2種菌株在有氧、微氧環境下均無法生長，培養2 d后菌液仍澄清，而在無氧環境下能夠生長，菌液渾濁，如圖3所示。這與擬桿菌的專性厭氧特性相吻合。

2.4 菌落PCR電泳

NG01、NG02菌株的PCR電泳結果如圖4所示，可見樣品條帶清晰，說明PCR結果較好，產物濃度高，與Marker對照后，發現PCR得到的基因片段大小菌為200 bp左右（圖5）。

2.5 生理生化鑒定結果

如附表所示，NG01及NG02菌株能發酵葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖等，不能發酵D-山梨醇、肌醇、核糖等，不產生氧化酶及過氧化氫酶。

2.6 測序及分析結果

16S rRNA測序分析結果顯示，NG01及NG02序列相同，說明這2種菌株是屬于同一物種，下面只對NG01序列進行分析。經過BioEdit進行序列剪輯合并校準后，得到總序列，其總長度為192 bp，與PCR電泳結果相符合，序列為：ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGAGAGCCTGAACCAGCCAAG-TAGCGTGAAGGATGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTTCT-TTTATAAAGGAATAAAGTCGGGTATGCATACCCGTTTGC-ATGTACTTTATGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTGCCAG-CAGCCGCGGTAAT。

Blast結果顯示，NG01菌株序列與Bacteroides vulgatus ATCC8482、Bacteroides vulgatus JCM5826及Bacteroides dorei 175序列相似性分別高達99.48%、99.48%、98.96%，人們普遍認為，98%的16S rRNA序列同一性表明菌株是同一物種的成員^[9]，由此可見，NG01（NG02）菌株與Bacteroides vulgatus ATCC8482、Bacteroides vulgatus" JCM5826、Bacteroides dorei 175密切相關。如圖6所示，該進化樹顯示了菌株NG01的系統發育關系，序列相似性水平和進化樹的分支模式都說明該菌株應被歸入擬桿菌屬，分析枝長信息可得，菌株NG01與多雷擬桿菌的物種距離比較接近，說明菌株NG01為多雷擬桿菌。

3 結論

本試驗以健康人體糞便為研究對象，利用改良BHI培養基及改良布氏血平板篩選擬桿菌，而后結合傳統方法及現代分子生物學技術進行菌種鑒定。結果表明，篩選所得菌種為Bacteroidetes dorei NG01。

4 討論

人們對擬桿菌的最初認識起源于其致病性，即當宿主正常的微生態平衡失衡時可能會導致內源性感染的出現^[10]。隨著微生態學的發展及研究的深入，研究人員逐漸認識到擬桿菌是人類及許多動物體內常見的菌群，甚至有益于健康，如有文獻報道稱擬桿菌減少會導致肥胖^[11]。此外，吳彥彬等^[12]在對擬桿菌的益生作用研究中發現，多形擬桿菌能根據宿主攝入物質的類型靈活調節自己的基因組，從而通過降解作用使得宿主及自身充分吸收外界營養，最終達到維持整個腸道菌群健康的效果。模式菌株脆弱擬桿菌是哺乳動物內數量最多的菌群，該菌群數量是人體健康狀況的一項重要指標，與人的生長發育、新陳代謝都有關系，其數量下降將引起需氧菌與兼氧菌的細菌過度增長綜合征，使得腸道菌群失調，導致病理狀態，如霍亂引起腹瀉時該菌數量下降至10^-5個/g^[3，13]。1995年，張季階等^[14]通過分離出的一株脆弱擬桿菌（BF839）的臨床觀察表明，此菌株是人體益生菌，可以調節菌群、增強免疫力、促進兒童的生長發育、預防腸道及呼吸系統疾病、增進食欲和改善睡眠，科學家們還認識到該菌可用于治療糖尿病、肥胖等疾病，具有被開發成新一代益生菌的潛力^[15]。擬桿菌屬與人類和動物健康息息相關，因此分離和鑒定以前未知的擬桿菌屬對人類健康具有重要意義。最近，Bacteroides coprocola、Bacteroides coprosis、Bacteroides finegoldii、Bacteroides tutois、Bacteroides plebeius等菌株逐漸被研究分離單培養，并進行表征^[16-19]。有研究表明，多雷擬桿菌對人類腸道系統的正常功能起著重要作用，其與影響細菌生長的膽汁濃度間存在一定的關系，從而調節腸道菌群^[20]。然而，除了許多有益功能外，它可能還具有條件致病性^[21]，《國際系統和進化微生物學雜志》也正在審查和分離多雷擬桿菌。因此，Bacteroides dorei NG01的分離與鑒定對擬桿菌屬益生菌的開發和腸道菌群健康的調節具有重要作用。

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Isolation and Identification of Bacteroides dorei NG01 from Human Intestines

SU Xiao-ming¹，XIANG Sha-sha¹，SHI Li-hua¹，WANG Xin-yang¹，

SHEN Yu-biao¹，YING Jian²，CHEN Jie³，ZHU Xuan³

（¹Weifang Elbe-Health Co.，Ltd.，Weifang 261057，China;²Beijing Key Laboratory of Nutrition，Health and Food Safety，

COFCO Nutrition and Health Research Institue Co.，Ltd.，Beijing 102200，China;

³School of Food Science and Bioengineering，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310018，China）

Abstract：ObjectiveTo isolate and identify the unknown strain of Bacteroides from healthy human intestinal flora.MethodStool samples were collected from 4 healthy donors who had no history of intestinal disease and had not used antibiotics in the past month before the study，the intestinal bacteria were placed in brain heart infusion broth （BHI） medium supplemented with heme and vitamin K1 for initial screening，and then re-screened on Brinell agar medium supplemented with defibrinated sheep blood，heme and vitamin K1. The selected strains were subjected to observation of morphology and culture characteristics，Gram staining and microscopic examination，physiological and biochemical identification，colony PCR reaction and 16S rRNA conservative sequence determination and analysis to determine the species. ResultThe colonial morphology of selected NG01 strain was off-white，opaque，smooth surface，regular edges，moist，slightly raised，round，and medium-sized. The strain was obligate anaerobic，Gram-negative，no spores，rod-shaped，irregular arrangement，and can ferment glucose，sucrose，mannose，lactose，whereas couldn’t ferment D-sorbitol，inositol，ribose，and didn’t contain oxidase，catalase. The Blast sequence alignment showed that the 16S rRNA similarity between NG01 strain and Bacteroides dorei 175 reached 98.96%.ConclusionThe isolated NG01 strain conforms to the characteristics of Bacteroides in its bacterial morphology，culture characteristics，and physiological and biochemical reaction results.

Keywords： intestinal flora;Bacteroides dorei; isolation and identification; 16S rRNA sequencing