雙蛋白豆酸乳制作工藝優(yōu)化及抗氧化作用研究

摘要：目的：優(yōu)化雙蛋白豆酸乳制作工藝，檢測(cè)抗氧化活性。方法：以大豆和脫脂奶粉為基本原料，基于單因素試驗(yàn)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化工藝，通過(guò)DPPH自由基清除、超氧陰離子清除、羥自由基清除法檢測(cè)雙蛋白豆酸乳抗氧化活性。結(jié)果：優(yōu)化工藝為干豆 ∶水=1 ∶10.25、脫脂奶粉添加量4.62%、發(fā)酵溫度40.43 ℃、發(fā)酵時(shí)間8.68 h，該工藝感官評(píng)分89.91，與模型預(yù)測(cè)值89.85接近，發(fā)酵溫度影響較為顯著；抗氧化活性方面，DPPH自由基清除能力7.919 U/mL、超氧陰離子自由基清除能力10.448 U/mL、羥自由基清除能力3.573 U/mL，與自制酸牛奶相比分別提高13.31%、9.97%、2.61%。結(jié)論：?jiǎn)我蛩卦囼?yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化后的雙蛋白豆酸乳口感佳，與同型乳制品相比有更高的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：雙蛋白；豆酸乳；工藝優(yōu)化；抗氧化雙蛋白工程是近幾年國(guó)家大力支持的重大項(xiàng)目，《國(guó)民營(yíng)養(yǎng)計(jì)劃（2017—2030年）》提出：“以?xún)?yōu)質(zhì)動(dòng)物、植物蛋白為主要營(yíng)養(yǎng)基料，加大力度創(chuàng)新基礎(chǔ)研究與加工技術(shù)工藝，開(kāi)展雙蛋白工程重點(diǎn)產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化推廣”。本研究產(chǎn)品（雙蛋白豆酸乳）是以大豆和脫脂奶粉為基本原料，經(jīng)益生菌發(fā)酵而成的乳制品。大豆含有豐富的優(yōu)質(zhì)植物蛋白，被冠以“田中之肉”的美譽(yù)[1]，且氨基酸種類(lèi)齊全，含有人體所需的8種氨基酸，是一種健康食品[2-3]。此外，大豆中還含有低聚糖、異黃酮、磷脂、皂苷等功能性物質(zhì)，是高血壓、糖尿病、血管粥樣硬化病人及素食主義者的理想食品[4-5]。豆酸乳中的異黃酮對(duì)預(yù)防腫瘤、心血管等疾病以及緩解更年期癥狀等有積極的作用[6]，發(fā)酵后可生成更多的維生素、礦物質(zhì)、大量益生菌，對(duì)調(diào)節(jié)腸道菌群及增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能有非常積極的作用[7-8]。脫脂奶粉是將鮮牛奶脫去脂肪再干燥而成，含有豐富的球蛋白、乳蛋白、酪蛋白，與大豆蛋白形成良好互補(bǔ)作用。本研究對(duì)雙蛋白豆酸乳制作工藝進(jìn)行優(yōu)化，以感官評(píng)分為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化制作工藝。

氧化應(yīng)激損傷和抗氧化保護(hù)作用的理論備受關(guān)注[9-11]，篩選具有抗氧化活性的天然資源已成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品科學(xué)研究的新趨勢(shì)。抗氧化肽就是其中一類(lèi)，它具有抑制生物大分子過(guò)氧化和清除體內(nèi)自由基產(chǎn)物的功能，而且是通過(guò)蛋白酶在溫和條件下水解蛋白質(zhì)而獲得，食用安全性高[12]。雙蛋白豆酸乳具有多種生物活性肽，除了能夠提供必需氨基酸外，還具有較強(qiáng)抗氧化作用。本研究通過(guò)采用DPPH自由基清除法、超氧陰離子清除法、羥自由基清除法對(duì)雙蛋白豆酸乳抗氧化活性進(jìn)行初步探索，以期為雙蛋白豆酸乳的高值化利用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

大豆，黑龍江非轉(zhuǎn)基因大豆；乳糖，美國(guó)Leprino Food生產(chǎn)；乳酸菌混合凍干粉，由北京川秀科技有限公司提供；超氧陰離子自由基、羥自由基清除能力測(cè)定試劑盒、DPPH、95%乙醇，由青島科創(chuàng)質(zhì)量檢測(cè)有限公司提供；自制酸牛奶（設(shè)備、菌種、材料均與雙蛋白豆酸乳相同）。

1.2主要儀器設(shè)備

膠體磨（JMS～80A），廊坊市惠友機(jī)械有限公司；電子天平（BT224S型），賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；均質(zhì)機(jī)（JJ-01/60），廊坊市冠通機(jī)械有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋（LS-B50L），上海華線(xiàn)醫(yī)用核子儀器有限公司；生物安全柜（BSG-1100IIB2-X），濟(jì)南鑫貝西生物科技有限公司；酶標(biāo)儀（MolecularDevices），美國(guó)；恒諾低溫離心機(jī)，湖南；捷美恒溫水浴鍋，蘇州；GC128可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海。

1.3方法

1.3.1雙蛋白豆酸乳制作工藝及優(yōu)化

（1）雙蛋白豆酸乳主要制作工藝：大豆→浸泡→煮豆→磨漿（加脫脂奶粉）→均質(zhì)→巴氏殺菌→接種→發(fā)酵→調(diào)制→成品→品評(píng)。

（2）單因素試驗(yàn)：以干豆與水的比例、奶粉添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)3次，取平均值。在其他因素不變的情況下，評(píng)分小組分別對(duì)每個(gè)因素4個(gè)不同水平的雙蛋白豆酸乳進(jìn)行感官評(píng)定[13]。①干豆與水的比例對(duì)感官評(píng)定的影響：以奶粉添加量為5%、發(fā)酵溫度40 ℃、發(fā)酵時(shí)間為8 h，測(cè)定不同干豆與水的比例（1 ∶6、1 ∶8、1 ∶10、1 ∶12、1 ∶14）對(duì)感官評(píng)定的影響。②奶粉添加量對(duì)感官評(píng)定的影響：以干豆與水的比例為1 ∶10、發(fā)酵溫度為40 ℃、發(fā)酵時(shí)間為8 h測(cè)定不同奶粉添加量（3%、5%、7%、9%、11%）對(duì)感官評(píng)定的影響。③發(fā)酵溫度對(duì)感官評(píng)定的影響：以干豆與水的比例1 ∶10，以奶粉添加量5%、發(fā)酵時(shí)間8 h測(cè)定不同發(fā)酵溫度（34、36、38、40、42 ℃）對(duì)感官評(píng)定的影響。④發(fā)酵時(shí)間對(duì)感官評(píng)定的影響：以干豆與水的比例1 ∶10、以奶粉添加量為5%、發(fā)酵溫度為40 ℃，測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間（4、6、8、10、12 h）對(duì)感官評(píng)定的影響。

（3）響應(yīng)面法優(yōu)化制作工藝：綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以干豆與水的比例、乳糖添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為自變量，以感官評(píng)定為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken[14]設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)（表1）。

（4）感官評(píng)分方法：邀請(qǐng)10位專(zhuān)業(yè)人員組成評(píng)分小組，分別從雙蛋白豆酸乳口感（40分）、色澤（20分）、組織狀態(tài)（20分）、風(fēng)味（20分）等4個(gè)評(píng)價(jià)項(xiàng)目進(jìn)行打分，每個(gè)評(píng)價(jià)項(xiàng)目分3個(gè)等級(jí)（表2），取平均值作為最終感官評(píng)定結(jié)果。

1.3.2雙蛋白豆酸乳抗氧化能力檢測(cè)

（1）DPPH 自由基清除法[15]：取DPPH 1 mg溶于約20 mL溶劑（乙醇、95乙醇或甲醇）中，超聲5 min，充分振搖，務(wù)使上下各部分均勻。取1 mL該 DPPH 溶液，在519 nm處測(cè)A值，使A處于1.2～1.3之間最佳（表3）。

（2）超氧陰離子清除法[16]：利用 NADH-PMS-NBT 為超氧陰離子生成系統(tǒng)，超氧陰離子清除劑能減少NBT的藍(lán)色。通過(guò)檢測(cè)560 nm處吸光值可判斷體系中還原物質(zhì)的還原能力，計(jì)算公式如式（1）：

超氧陰離子自由基清除能力（%）=[空白孔吸光值-（測(cè)定孔吸光值-對(duì)照孔吸光值）×100]/空白孔吸光值（1）

（3）羥自由基清除能力測(cè)定[17]：H₂O₂ / Fe²⁺ 通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，將鄰二氮菲-Fe²⁺水溶液中Fe²⁺氧化為 Fe³⁺，導(dǎo)致536 nm吸光度下降，樣品對(duì)536 nm吸光度下降速率的抑制程度，反映了樣品清除羥自由基的能力（表4）。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，組與組之間的比較以x±s表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

2.1雙蛋白豆酸乳制作工藝單因素試驗(yàn)分析

2.1.1干豆與水比對(duì)感官評(píng)分的影響由表5可知，干豆水比1 ∶10時(shí)，平均感官得分最高（89.80），P＜0.05說(shuō)明5個(gè)組之間是有差異的。比例越高，雙蛋白豆酸乳濃度越稠，口感不佳，且過(guò)均質(zhì)機(jī)時(shí)容易堵塞；比例越低濃度越稀，營(yíng)養(yǎng)少，口感差。

2.1.2奶粉添加量對(duì)感官評(píng)分的影響由表5可知，奶粉添加量為5%時(shí)，平均感官得分最高（88.80），P＜0.05說(shuō)明5個(gè)組之間是有差異的。奶粉添加量越高，豆香味越淡，成本高且蛋白比例失調(diào)，氨基酸互補(bǔ)性差。

2.1.3發(fā)酵溫度對(duì)感官評(píng)定的影響由表5可知，發(fā)酵溫度為40 ℃時(shí)，平均感官得分最高（89.50），P＜0.05說(shuō)明5個(gè)組之間是有差異的。發(fā)酵溫度低時(shí)，益生菌不活躍，發(fā)酵產(chǎn)酸不足，影響風(fēng)味。溫度過(guò)高，產(chǎn)酸過(guò)多，酸味偏重。

2.1.4發(fā)酵時(shí)間對(duì)感官評(píng)定的影響由表5可知，發(fā)酵時(shí)間為8 h時(shí)，平均感官得分最高（89.60），P＜0.05說(shuō)明5個(gè)組之間是有差異的。發(fā)酵時(shí)間短，益生菌數(shù)量不足，產(chǎn)酸量低，口感不佳。發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)時(shí)，酸澀味加重，口感較差。

2.1.5響應(yīng)面法優(yōu)化雙蛋白豆酸乳制作工藝如表6所示，隨機(jī)設(shè)計(jì)29組試驗(yàn)，以感官評(píng)分為響應(yīng)值，各個(gè)試驗(yàn)因子對(duì)感官得分的影響按編碼因素計(jì)算的回歸關(guān)系式：Y=89.65-0.25A+0.13B+0.14C+0.11D-0.28AC+0.13CD。當(dāng)大豆與水比為1 ∶10.25、奶粉添加量為4.26%、發(fā)酵溫度為40.43 ℃、發(fā)酵時(shí)間為8.68 h時(shí)，感官評(píng)分最高（89.91），即為最佳工藝條件。

2.2雙蛋白豆酸乳抗氧化能力

2.2.1DPPH自由基清除能力測(cè)定DPPH法是定量測(cè)定食品抗氧化能力的常用方法之一。通過(guò)檢測(cè)519 nm處的特征吸收峰可判定還原性物質(zhì)減少單電子數(shù)量的程度，因而此方法可對(duì)雙蛋白豆酸乳清除DPPH的能力進(jìn)行快速的定量測(cè)定，從而評(píng)價(jià)雙蛋白豆酸乳的抗氧化能力。如表7所示，雙蛋白豆酸乳具有很好的DPPH自由基清除能力，雙蛋白豆酸乳的清除率較自制酸牛奶高13.31%。

2.2.2超氧陰離子自由基清除力測(cè)定由表7可知，自制酸牛奶和雙蛋白豆酸乳均具有清除超氧陰離子的作用，雙蛋白豆酸乳的清除率較自制酸牛奶高9.97%。

2.2.3羥自由基清除能力測(cè)定由表7可知，自制酸牛奶和雙蛋白豆酸乳均具有清除羥自由基的作用，雙蛋白豆酸乳的清除率較自制酸牛奶高2.61%。

3討論與結(jié)論

本試驗(yàn)采用大豆和奶粉為主要原料制作雙蛋白豆酸乳，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法，以感官評(píng)分為響應(yīng)值優(yōu)化制作工藝。雙蛋白豆酸乳最佳制作工藝是干豆 ∶水=1 ∶10.25、脫脂奶粉添加量4.62%、 發(fā)酵溫度40.43 ℃、發(fā)酵時(shí)間8.68 h。大豆和奶粉比例越高，營(yíng)養(yǎng)成分越高，但在制作過(guò)程中會(huì)由于濃度過(guò)高而堵塞均質(zhì)機(jī)；發(fā)酵溫度影響益生菌的活性，但溫度過(guò)高會(huì)抑制益生菌的生長(zhǎng)；發(fā)酵時(shí)間對(duì)雙蛋白豆酸乳口感有顯著的影響（P＜0.05），發(fā)酵時(shí)間少，酸度不夠，影響雙蛋白豆酸乳的性狀；發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酸度過(guò)大，影響雙蛋白豆酸乳的口感。

雙蛋白豆酸乳較自制酸牛奶有更強(qiáng)的抗氧化能力，其中的大豆肽可清除體內(nèi)代謝產(chǎn)生的自由基，減少組織損傷，提高機(jī)體的抗氧化能力。有研究表明，分子量越小，大豆肽抗氧化能力越強(qiáng)[18]；大豆及其制品含有多種天然抗氧化成分，如維生素E、維生素C、異黃酮等[19]，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。大豆及普通大豆食品中的異黃酮主要是以糖苷形式存在，而在發(fā)酵過(guò)程中，大豆中的糖苷在微生物的作用下轉(zhuǎn)化為活性更高的異黃酮苷元[20]。研究表明，人體利用大豆異黃酮苷元的速度遠(yuǎn)高于糖苷型，且苷元型大豆異黃酮無(wú)論在抗氧化、抗脂質(zhì)過(guò)氧化等方面均比糖苷型高[21]。因此以大豆和奶粉為主要原料經(jīng)過(guò)發(fā)酵制成的雙蛋白豆酸乳可以提高其抗氧化活性。參考文獻(xiàn)

[1]張海生.大豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及功效[J］.大豆科技，2012（1）：51-53.

[2]王艷萍，蔚釧，郗宏波，等.發(fā)酵型酸豆乳工藝條件的研究[J］.中國(guó)乳制品工業(yè)，2013，41（3）：61-63.

[3]Wang YP，Wei C，Xi H B，et al.Study on the process conditions of fermented soybean milk[J］.Chinesey，2013，41（3）：61-63.

[4]H P Batt.Characterization of isoflavones inmembrance-proccessed soy protein concentiate[J］.J Food Sci，2003，68（1）：401-404.

[5]李次力.大豆酸乳發(fā)酵的菌種篩選[J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2008，23（6）：68-71.

[6]P Scalabrinia，M Rossib，P Spettolia，et al. Characterization of Bifidobacterium strains for use in soymilk fermentation[J］.International Jurnal of Food Microbiology，1998（39）：213-219.

[7]Wang YX，Chen Q S.Research progress on the relationship between probiotics and intestinal mucous immunity[J］.Food Science，2007，28（8）：37-42.

[8]Vindl，Rola G，Matar C，et al.Role of intestinal ePithelial cells in immune effects mediated by gram positive probiotic bacteria：involvement of toll-like receptor[J］.Clinical and Diagnostic Laboratory lmmunology，2005，12（9）：1075-1084.

[9]Andrisic L，Dudzik D，Barbas C，et al.Short overview on metabolomics approach to study pathophysiology of oxidative stress in cancer[J］.Redox Biology，2018（14）：47-58.

[10]Réus G Z，Carlessi A S，Silva R H，et al.Relationship of oxidative stress as a link between diabetes mellitus and major depressive disorder[J］.Oxidative Medicine amp; Cellular Longevity，2019（15）：1-6.

[11]Cuzzocrea S，Riley D，Caputi A P，et al.Antioxidant therapy：a new pharmacological approach in shock，in flammation，and ischemia/reperfusion injury[J］.Pharmacol Rev，2011（53）：135-139.

[12]Fang Y，Yang S，Wu G.Free radicals，antioxidant，and nutrients in relation to health[J］.Acta Nutrimenta Sinica，2003，25（4）：337-342.

[13]于春濤，張中興，朱鳳林，等.全大豆豆酸乳制作工藝優(yōu)化及營(yíng)養(yǎng)成分分析[J］.中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2020，26（12）：5-8.

[14]Shixq，Changkc，Schwarajg，et al.Optimizing pectin extraction from sunflower heads by alkaline washing[J］.Bioresoure Technology，1996，58（3）：291-297.

[15]田海娟，王蕾，劉名鑫，等.混菌發(fā)酵紫蘇粕小肽提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性研究[J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2021，47（20）：223-228.

[16]祁紅兵，宋軍霞，倫钖華.市場(chǎng)常見(jiàn)發(fā)酵品的抗氧化活性[J］.食品工業(yè)，2019，40（8）：187-190.

[17]薛山，肖夏，陳舒怡.雙響應(yīng)面法結(jié)合Matlab法優(yōu)化葡萄籽多酚提取工藝及羥自由基清除率評(píng)價(jià)[J］.食品工業(yè)科技，2020，41（3）：160-167.

[18]焦寶利.大豆肽抗氧化性及其協(xié)同作用研究[D］.鄭州：河南工業(yè)大學(xué)，2015.

[19]Amarowicz Ｒ，Shahidi F.Antioxidant activity of broad beanseed extract and its phenolic composition［J］.Journal of Functional Foods，2017，38（38）：656-662.

[20]Xu L，Du B，Xu B.A systematic，comparative study on the beneficial health components and antioxidant activities of commercially fermented soy products marketed in China[J］.Food Chemistry，2015（2）：174-179.

[21]Dejan Z Ori，Neda MMimica-Duki，Marina MFranci-kovi，et al. Antioxidant activity relationship of phenolic compounds in Hypericum perforatum[J］.Chemistry Central Journal，2011，5（1）：34-40.

Preparation Technology Optimization and

Antioxidant Effect Study on Double Protein Soy YoghurtYU Chun-tao，LIU Yu-xia，ZHU Feng-lin，ZHANG Zhong-xing

（Cangzhou Medical College，Cangzhou 061001，China）

Abstract：Objective To optimize the preparation technology of double protein soy yoghurt and detect its antioxidant activity.Method Soybean and skimmed milk powder were used as basic raw materials.Based on single factor test，the process was optimized by Box-Behnken response surface method.The antioxidant activity of double protein soy yoghurt was detected by DPPH radical scavenging，superoxide anion scavenging and hydroxyl radical scavenging.Result The sensory score of the optimized process was 89.91，which was close to the predicted value of 89.85.The effect of fermentation temperature was significant.Antioxidant activity DPPH radical scavenging capacity was 7.919 U/mL，superoxide anion radical scavenging capacity was 10.448 U/mL，hydroxyl radical scavenging capacity was 3.573 U/mL，which increased by 13.31%，9.97% and 2.61% respectively compared with commercial yogurt.Conclusion The double protein soy yogurt optimized by single factor experiment and corresponding surface method has better taste and higher antioxidant activity compared with the same type of dairy products.

Keywords：double protein;soy yogurt;process optimization;antioxidant