芹菜素對二肽基肽酶IV的抑制作用及其機制

摘要：目的：探究芹菜素降血糖作用的機制。方法：考察不同濃度的芹菜素對糖尿病治療靶點二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）的抑制活性，并進一步利用酶動力學、熒光光譜、分子對接等實驗手段明確了芹菜素對DPP-4的抑制類型以及作用機制。結果：芹菜素對DPP-4具有可逆的非競爭性抑制作用，其半數抑制濃度為（62.45±1.22）μg/mL；芹菜素主要通過氫鍵和范德華力作用與DPP-4形成基態復合物，造成DPP-4內在熒光的猝滅；芹菜素可與DPP-4分子中VAL-207、ARG-358、TYR-662殘基形成較強的氫鍵，并與周圍眾多的疏水殘基存在疏水作用，共同維持該復合物的結構。結論：本試驗結果可為芹菜及芹菜素類降血糖產品的開發提供科學依據。

關鍵詞：芹菜素；二肽基肽酶IV；抑制；互作；分子對接二肽基肽酶IV（DPP-4）是哺乳動物的一種重要絲氨酸水解酶，可分解胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）和葡萄糖依賴性促胰島素肽（GIP）等腸促胰島素，從而阻斷其對胰島素分泌的促進作用，因此被認為是治療2型糖尿病的重要靶點[1-2]。芹菜素是人類日常飲食中重要的類黃酮之一，廣泛存在于多種水果、蔬菜以及茶葉中，其中尤以芹菜中含量較高，是芹菜中最主要的生物活性成分之一[3-6]。研究表明，芹菜素具有明顯的降血糖作用[7]。劉俊法[8]對糖尿病大鼠連續4 w進行芹菜素腹腔注射給藥治療，發現可顯著降低糖尿病大鼠血糖水平。Mao等[9]研究表明，糖尿病大鼠在連續給藥3 w后，40 mg/kg芹菜素治療組血糖可較對照組降低50%以上。芹菜素可減輕高脂飲食誘導肥胖小鼠的胰島素抵抗（IR）[10-11]、改善葡萄糖耐量減低（IGT）[11-12]、保護胰島β細胞免受氧化損傷[13-14]、抑制α-葡萄糖苷酶活性[15-16]，從而起到調節血糖作用。Kalivarathan 等[17-18]對高脂高糖飲食大鼠進行芹菜素腹腔注射給藥處理，發現芹菜素處理組大鼠血漿及海馬組織中DPP-4的活性均顯著低于對照組，而血漿GLP-1水平顯著提高，提示DPP-4活性可能得到抑制。本研究通過體外試驗方法結合分子模擬，明確芹菜素對DPP-4的抑制作用及其分子機制，以進一步闡釋芹菜素降血糖作用的機制。

1材料與方法

1.1材料與試劑

芹菜素（純度≥98%）;Tris-HCl（pH 8.0，1.0 mol/L），北京索萊寶科技有限公司；二肽基肽酶IV（人，EC 3.4.14.5）、Gly-Pro-7-amido-4-甲基香豆素氫溴酸鹽（Gly-Pro-AMC）、二甲基亞砜（DMSO），美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

SpectraMax i3X酶標儀，美國Molecular Devices；F7000熒光分光光度計，日本Hitachi。

1.3方法

1.3.1芹菜素對DPP-4的抑制能力芹菜素對DPP-4的抑制評價方法參考Proenca等[19]的方法，并稍加修改。先用50 mmol/L的緩沖液配置濃度為1.73 mU/mL的DPP-4溶液和濃度為200 mmol/L的底物Gly-Pro-AMC溶液。準確移取24 μL的DPP-4溶液，分別加入26 μL的待測樣品溶液，在37℃反應15 min后，再加入50 μL的Gly-Pro-AMC溶液。放置37℃下反應15 min后，酶標儀在λex=360 nm、λem=460 nm下進行熒光測定。空白組為不加樣品溶液，樣品空白組為不加酶，每次試驗3次重復。芹菜素對DPP-4抑制率按式（1）計算。

1.3.2芹菜素對DPP-4的抑制類型判斷根據酶促反應動力學判斷抑制類型，具體方法參照Morikawa等[20]的方法。選擇不同濃度的芹菜素（0、50、100 μg/mL），首先固定Gly-Pro-AMC（最終濃度100 μmol/L），通過改變酶的濃度（0.21、0.42、0.63、0.84 mU/mL），以酶反應速率為縱坐標，酶濃度為橫坐標判斷反應是否可逆。然后再固定酶濃度，設定底物Gly-Pro-AMC濃度（50、100、150、200 μmol/L）繪制Lineweaver-Burk雙倒數曲線，從而確定抑制類型，計算公式為式（2）：

1.3.3熒光光譜測定在298K和310K溫度下，分別測定DPP-4的發射光譜，隨后加入不同濃度的芹菜素，保持終濃度為0～28 μg/mL，濃度間隔為4 μg/mL，混合并靜置3 min后進行樣品測量。激發波長為280 nm，發射波長范圍為290～400 nm，狹縫寬度為5 nm，掃描速度為1 200 nm/min。利用Stern-Vlomer方程判斷芹菜素對DPP-4的猝滅機理[21]，公式如式（3）：

1.3.4分子對接通過Pubchem數據庫下載Apigenin化合物（520-36-5）數據的sdf格式，通過Chem3D中的MM2模塊對所下載的化合物進行幾何優化以及能量最小化，并轉化為pdb格式，將小分子化合物導入AutoDock Tools-1.5.6軟件刪除水分子并添加原子電荷、分配原子類型，將所有柔性鍵默認可旋轉，最后保存為pdbqt文件。從PDB數據庫下載二肽基肽酶IV的晶體結構PDB格式文件，采用Pymol 2.1軟件刪除蛋白分子中的無關小分子后，將蛋白分子導入AutoDock Tools-1.5.6軟件刪除水分子、添加氫原子以及設置原子類型，最后保存為pdbqt文件。將處理后的Apigenin化合物作為小分子配體，DPP4蛋白靶點作為受體，根據小分子與靶點的作用位點確定的Grid Box的中心位置（x=40.85，y=51.23，z=35.57）以及長寬高（50×50×50），最后通過AutoDock 進行分子對接，對結果進行分析，化合物與蛋白的結合模式可視化采用Pymol 2.1軟件。

1.3.5數據處理數據分析使用SPSS統計軟件，不同質量濃度測量3次，數據表示為平均值±標準差，統計顯著性差異由P＜0.05判斷。

2結果與分析

2.1芹菜素對DPP-4的抑制效果

如圖1所示，隨著質量濃度的增加，對DPP-4的抑制效果逐漸增強，呈濃度依賴性抑制，表現出了很好的DPP-4抑制能力，通過曲線擬合計算可以確定出其半數抑制濃度（IC₅₀）值為（62.45±1.22）μg/mL。

2.2芹菜素對DPP-4的抑制類型

由圖2（A）可知，不同質量濃度下的直線都過原點，并且隨之濃度的增加，斜率逐漸降低，說明芹菜素能可逆性地抑制DPP-4的活性[23]。進一步采用Lineweaver-Burk雙倒數圖法確定出芹菜素對DPP-4的抑制類型。由圖2（B）可知，不同濃度下芹菜素對DPP-4的抑制動力曲線交于X軸，根據式（2），表現為隨著芹菜素濃度的增加，最大反應速率V_max依次減少，米氏常數K_m保持不變，因此芹菜素對DPP-4的抑制類型為典型的非競爭性抑制。

2.3芹菜素對DPP-4的熒光淬滅效應

熒光光譜是研究小分子和蛋白質作用的常見方法，可以確定其相互作用的方式、作用力等[24]。DPP-4中含有色氨酸和酪氨酸殘基，在一定激發波長下，可以發生較強的熒光。由圖3可以看出，當激發波長在280 nm時，DPP-4的最大發射波長為332 nm。隨著芹菜素質量濃度的增加，DPP-4的熒光強度呈規律性下降，說明芹菜素與DPP-4酶之間存在相互作用。隨著芹菜素濃度的增加，發射峰發生藍移現象（332～328 nm），表明此時DPP-4發色基團周圍的微環境發生了變化，芹菜素與DPP-4之間存在著相互作用，向疏水的環境中轉變[25]。

采用Stern-Volmer方程分析不同溫度下的熒光數據，從圖4（A）可以看出，芹菜素對DPP-4的Stern-Volmer曲線具有良好的線性，說明其猝滅過程為單一的動態或者靜態。隨著溫度的升高，其K_sv值降低，并且K_q遠大于生物大分子最大散射碰撞猝滅常數2×10¹⁰L/（mol·s）。結果表明，芹菜素對DPP-4的猝滅過程為靜態猝滅。通過靜態猝滅公式，得到芹菜素對DPP-4的雙對數曲線圖，如圖4（B）。根據直線的斜率和截距計算出K_b和n值。由附表中芹菜素對應的K_b值都隨之溫度的升高而降低，說明抑制劑-酶復合物的穩定性隨著溫度的升高而降低。另外，不同溫度下的n值接近于1，表明芹菜素與DPP-4只存在一個結合位點。

通過公式計算出焓變ΔH、熵變ΔS、吉布斯自由能ΔG的變化，進而判斷出芹菜素對DPP-4的相互作用力。當ΔH＞0且ΔS＞0時，主要作用力為疏水作用力；當ΔH＜0且ΔS＞0時，作用力為靜電相互作用；當ΔH＜0且ΔS＜0時，主要作用力為范德華力和氫鍵。由附表可見，吉布斯自由能ΔG均為負值，說明芹菜素與DPP-4的結合是自發進行的，且ΔH、ΔS均為負值，表明芹菜素與DPP-4的結合主要為氫鍵和范德華力[26]。

2.4分子對接

分子模擬對接是研究小分子和蛋白質作用的重要工具，可以確定二者的結合位點[27]。芹菜素與DPP4靶點蛋白的分子對接結果表明，芹菜素與DPP4存在很好的結合作用且匹配度高（結合能小于-5 kcal/mol）。將對接后芹菜素與DPP-4形成的復合物利用Pymol 2.1軟件進行可視化，得到芹菜素與DPP-4的結合模式，根據結合模式可以很清晰地看到芹菜素與DPP-4口袋的相結合的氨基酸殘基。如圖5所示，芹菜素與DPP4結合位點存在相互作用的氨基酸有ARG-358、PHE-357、TYR-666、TYR-547、TYR-662、ASN-710、GLU-206、SER-209、VAL-207等。芹菜素屬于黃酮類化合物，具有一定的疏水性，能夠與PHE-357、TYR-666、TYR-547、TYR-662、VAL-207氨基酸形成很強的疏水相互作用，特別是PHE-357、TYR-547氨基酸的苯環部分與該化合物形成很強的π-π共軛相互作用，對錨定蛋白口袋中的小分子有著重要作用；另外，該化合物的酚羥基還能夠與VAL-207、ARG-358、TYR-662氨基酸形成很強的氫鍵相互作用，氫鍵距離分別為1.9、3.5、1.9，這對穩定小分子也有著重要貢獻。結合圖5可以看到，該芹菜素分子一部分深入到DPP4口袋深處，另一部分也與DPP4的凹槽有很好的匹配。綜上，芹菜素與DPP4的位點匹配較好，能夠與DPP4蛋白形成穩定的復合物，與蛋白有著很好的關聯性，是潛在的活性化合物。

3結論

本研究系統考察了芹菜素對DPP-4的抑制及互作情況，借助分子模擬對接，更加精準地揭示出芹菜素抑制DPP-4的分子機制。結果表明，芹菜素呈劑量依賴性抑制DPP-4的活性，并且具有明顯可逆的非競爭性抑制作用。芹菜素可在氫鍵和范德華力作用力驅動下，與DPP-4形成復合物，使蛋白質發生熒光猝滅效應，結合位點數為1。分子對接結果進一步表明，芹菜素位于酶的疏水口袋中，與殘基VAL-207、ARG-358、TYR-662形成較強的氫鍵，并與周圍眾多的疏水殘基存在疏水作用，共同促進了小分子和蛋白口袋的結合。綜上，芹菜素能夠與DPP-4高效結合，是潛在的對DPP-4有較好抑制活性的化合物。本研究結果可為芹菜及芹菜素類降血糖產品的開發提供理論依據。參考文獻

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Inhibitory Effect of Apigenin on DPP-4 and Its Interaction MechanismPAN Jun-kun，ZHANG Qiang，JIAO Zhong-gao

（Zhengzhou Fruit Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450009，China）

Abstract：ObjectiveTo elucidate the mechanisms for the hypoglycemic effect of apigenin.MethodThe inhibitory activity of apigenin on dipeptidyl peptidase-4 （DPP-4） at different concentrations was evaluated，and then the inhibition type and interaction mechanism were investigated by using kinetic analysis，fluorescence quenching experiment as well as molecular docking.ResultApigenin inhibited DPP-4 in a reversible and non-competitive mode with a half maximal inhibitory concentration （IC50） of （62.45±1.22） μg/mL. During interaction，they formed a ground-state complex with DPP-4 under the action of hydrogen bonds and van der Waals forces，and there was only one binding site on DPP-4 for apigenin. Apigenin could form strong hydrogen bonds with the residues VAL-207，ARG-358 and TYR-662 of DPP-4，and thus maintain the structure of the complex together with numerous hydrophobic residues.ConclusionThe results can provide scientific basis for the development of hypoglycemic products related to celery or apigenin.

Keywords： apigenin; dipeptidyl peptidase-4（DPP-4）; inhibition; interaction; molecular docking