煙草連作病害土壤與連作非病害土壤的細菌群落差異性比較

摘要：通過對煙草連作病害土壤、連作非病害土壤及新墾植煙土壤細菌群落結構間的差異性比較，為以微生物手段減少煙草連作病害提供一定的理論依據。采用宏基因組高通量測序技術，測定分析三類土壤的細菌群落結構。結果表明，連作病害土壤細菌總OTUs與獨有OTUs最多，群落結構相似，同源性高；連作病害土壤中的藍細菌門（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鐵礦沙單孢菌屬（Arenimonas）、厭氧繩菌屬（Bellilinea）、節桿菌屬（Arthrobacter）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）占比顯著高于連作非病害土壤和新墾土壤。連作非病害土壤樣本間細菌群落結構差異較大，同源性較低。新墾土壤細菌慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、酸土單胞菌屬（Aciditerrimonas）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、紅游動菌屬（Rhodoplanes）5個屬所占比例較高，但硝化螺旋菌屬（Nitrospira）占比較低，細菌群落結構各具自身特點。

關鍵詞：煙草；連作植煙土壤；病害土壤；宏基因組；細菌群落

中圖分類號：S154.37；S572" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）03-0047-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.03.009 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Comparison on differences of bacteria community between tobacco continuous cropping diseased soil and continuous cropping non-diseased soil

DI Hui-hui， WANG Rui， TAN Jun， PENG Wu-xing

（Enshi Tobacco Company of Hubei Tobacco Corporation， Enshi" 445000， Hubei， China）

Abstract： The differences of bacteria community structure among tobacco continuous cropping diseased soil， continuous cropping non-diseased soil and newly cultivated soil were compared， so as to provide a theoretical basis for reducing tobacco continuous cropping diseases through microbial means. Metagenome high-throughput sequencing technology was used to compare bacterial communities of three types of soils. The results showed that， the number of total and unique OTUs of bacteria in continuous cropping diseased soil was the highest， and the bacterial community was very similar and had high homology. Proportions of Cyanobacteria， Bacteroides， Pseudomonas， Arenimonas， Bellilinea， Arthrobacter， Flavobacterium and Nocardioids were significantly higher in continuous cropping diseased soil than those in continuous cropping non-diseased soil and newly cultivated soil. The bacterial community structure of continuous cropping non-diseased soil was quite different， and the homology was low. Bradyrhizobium， Aciditerrimonas， Mycobacterium， Sphingomonas， and Rhodoplanes had relatively high proportions， but the proportion of Nitrospira was low in newly cultivated soil， and the bacterial community structure had its own characteristics.

Key words： tobacco； continuous cropping tobacco-growing soil； diseased soil； metagenome； bacteria community

受耕地面積及其他經濟作物發展等因素限制，煙葉生產中連作已經成為一個普遍現象［1-3］。煙草連作常會導致煙田病害暴發或煙株生長發育不良，給煙葉生產和煙農收入造成巨大損失［4-6］。有研究表明，連作可以影響根際土壤微生物區系［7-9］，造成病害暴發的根本原因也在于土壤中微生物區系的失衡，病原物激增［10，11］。土壤微生物對植物健康生長具有重要作用［12-14］，良好的根際微生態可促進煙株根系發育，增強根系活力。國內外對煙草連作障礙土壤的微生物研究報道較多，但多集中于對連作障礙土壤的微生物分布特點研究［15-17］，而將同一土壤類型的連作病害煙田、連作非病害煙田、新墾煙田間細菌群落結構差異進行比較的研究報道較少。探明煙草連作病害土壤與非病害土壤間的細菌群落差異，對通過微生物技術手段調控連作病害的發生具有重要意義。

宏基因組技術可以避免土壤中可培養微生物有限并且培養復雜的難題，而且可以為微生物多樣性研究提供更全面的信息［18-20］。為此，本研究通過土壤宏基因組技術，從土壤中提取微生物基因組，建立基因組文庫，分析同一生態環境、同一土壤條件下連作病害、連作非病害及新墾植煙土壤間的細菌群落結構差異，以期為通過微生物技術手段促進連作煙田的健康發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于湖北省恩施州宣恩縣椒園鎮， 屬于亞熱帶濕潤氣候，土壤為黃棕壤，烤煙品種為當地主栽品種云煙87。選取10塊連續種煙10年以上且土傳病害較為嚴重的煙田，命名為連作病害土壤，編號為CCO1至CCO10；選取8塊連續種煙10年以上且沒有顯著病害發生的煙田，命名為連作非病害土壤，編號為DSH1至DSH8；選取5塊土壤類型一致、地貌相似的地塊開荒種煙，命名為新墾土壤，編號為EN1至EN5。各土壤樣品屬于同一小氣候、同一土壤分類單元。各地塊不進行土傳病害防治，其他按照當地優質煙葉生產技術方案的生產措施進行煙葉生產栽培。

1.2 土樣的采集與制備

在煙葉采收結束后，以人工多點混合的方式取樣，取土鉆統一采用管形不銹鋼土鉆，取樣層次為耕作層，深度0～20 cm，采用“S”形采樣，每個地塊取15～20個樣點，制成一個混合樣。土樣裝入保鮮袋放入低溫冷藏箱（-20 ℃）中保存備用，以提取土壤微生物基因組DNA。

1.3 土壤宏基因組測序

土壤樣品送至北京諾禾致源科技有限公司進行宏基因組測序，DNA提取采用DNA抽提試劑盒Fast DNA? SPIN Kit for Soil（Qbiogene，Inc. USA）進行；16S rRNA的V3和V4區擴增采用338F（5′-ACTCCT ACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物對；采用Illumina-miseq平臺（Illumina Inc.，美國）進行擴增測序；使用FASTX Toolkit 0.0.13軟件包對原始序列數據進行初步過濾，將序列相似性達97%的序列聚類生成操作分類單元OTU。

1.4 數據分析

運用Mothur軟件進行測序序列去重，以數據庫GreenGene、Silva進行篩選比對，再利用Mothur軟件做Rarefaction分析、計算Chao1指數、香農指數等常用的多樣性指數。

利用SPSS 20.0軟件進行數據的統計分析，采用Duncan新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 土壤細菌α-多樣性研究

利用宏基因組技術對3類土壤樣品進行高通量測序，由圖1可知，測序深度已達到飽和，結果能真實反映樣本條件。分別將細菌的OTUs、香農指數和Chao1指數在不同土壤類型中進行多重比較，由表1可知，土壤樣品3個指標的平均值均為連作病害土壤最高，新墾土壤最低，連作非病害土壤居中，且各土壤類型變化幅度相似，均為連作病害土壤變幅最小，連作非病害土壤變幅最大，表明連作病害土壤的細菌群落數量、多樣性具有較高的相似性，而連作非病害土壤樣本間細菌群落數量、多樣性差異較大。連作病害土壤的OTUs、香農指數與連作非病害土壤差異達顯著水平（Plt;0.05），與新墾土壤差異達極顯著水平（Plt;0.01）；連作非病害土壤OTUs、香農指數與新墾土壤無顯著差異。Chao 1指數各樣本間無顯著差異。

2.2 土壤細菌門水平群落組成

如表2所示，在3類土壤樣品中占比較大的細菌門類是變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）。比較同一門類細菌在不同土壤中的差異，結果表明，連作病害土壤中藍細菌門（Cyanobacteria）所占比例極顯著高于連作非病害及新墾土壤，擬桿菌門（Bacteroidetes）顯著高于連作非病害土壤；新墾土壤中浮霉菌門（Planctomycetes）比例極顯著高于連作病害土壤和連作非病害土壤，而硝化螺旋菌門（Nitrospirae）比例則極顯著低于二者。

2.3 土壤細菌屬水平群落組成

連作病害、連作非病害、新墾土壤三類土壤中共有的細菌屬類超過500種，比較土壤樣品中豐富度前20的菌屬在不同土壤類型中的差異。從表3可以看出，連作病害土壤中假單胞菌屬（Pseudomonas）、鐵礦沙單孢菌屬（Arenimonas）、厭氧繩菌屬（Bellilinea）3個屬的豐富度與連作非病害土壤及新墾土壤差異極顯著；節桿菌屬（Arthrobacter）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）3個屬豐富度與連作非病害土壤及新墾土壤差異顯著；假單胞菌屬、鐵礦沙單孢菌屬、厭氧繩菌屬、節桿菌屬、黃桿菌屬（Flavobacterium）、類諾卡氏菌屬豐富度在連作非病害土壤及新墾土壤中均無顯著差異，表明這6個屬豐富度增加是連作病害土壤的獨有現象。新墾土壤中慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、酸土單胞菌屬（Aciditerrimonas）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）3個菌屬豐富度極顯著高于煙草連作的土壤，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、紅游動菌屬（Rhodoplanes）2個菌屬豐富度顯著高于煙草連作的土壤，由此可見煙草連作可顯著降低以上5個菌屬數量。

2.4 韋恩圖分析

如圖2所示，各土壤樣本細菌總OTUs與獨有OTUs均以連作病害土壤最多，連作非病害土壤次之，新墾土壤最低；連作病害土壤獨有OTUs分別較連作非病害土壤、新墾土壤高出14.45%和245.45%；連作病害土壤與新墾土壤二者共有細菌的OTUs為2 342，連作非病害土壤與新墾土壤二者共有細菌的OTUs為1 556，前者較后者高出50.51%；新墾土壤細菌的總OTUs與獨有OTUs均為最低。

2.5 細菌PCoA分析

圖3為土壤樣品的PCoA分析（Unweighted），從圖3可以看出，三類土壤已經產生了明顯的區分度，連作病害土壤的10個樣品更具有聚集性，少數樣本有部分重疊；連作非病害土壤8個樣品彼此分散性較大，樣品DSH08距離最遠；新墾土壤的5個樣品彼此稍微分離。

3 小結與討論

試驗結果表明，連作病害土壤細菌的總OTUs與獨有OTUs均最多，連作非病害土壤次之，新墾土壤最低；連作病害土壤中藍細菌門、擬桿菌門2個門類及假單胞菌屬、鐵礦沙單孢菌屬、厭氧繩菌屬、節桿菌屬、黃桿菌屬、類諾卡氏菌屬6個菌屬所占比例顯著高于其他兩類土壤。煙草連作可顯著降低土壤慢生根瘤菌屬、酸土單胞菌屬、分枝桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、紅游動菌屬5個屬所占比例，明顯提高硝化螺旋菌屬（Nitrospira）比例。連作病害土壤的細菌群落組成更具有相似性，同源性更高；連作非病害土壤樣本間細菌群落差異性較大；新墾土壤由于未受到人類長期耕作的影響，其土壤細菌群落環境更具有自身特點。

Yuan等［21］對8個國家758個病害或健康的土壤樣本進行微生物群落分析，并建立了土壤枯萎病預測模型，研究結果表明，病害土壤比健康土壤具有更多的獨有OTUs，這與本研究中連作病害土壤樣本細菌總OTUs與獨有OTUs最多相一致。連作病害土壤中的細菌群落數量、多樣性、豐富度均較連作非病害土壤和新墾土壤增加，這可能是由于連作病害土壤的典型表現是細菌性土傳病害青枯病暴發嚴重，從而造成土壤微生物群落改變，使其相對連作非病害土壤中相關的細菌數量、多樣性及豐富度增加；國內外關于施肥對土壤微生物群落影響研究較多，Marschnera等［22］研究表明，施用肥料能顯著影響土壤微生物的生長，改變土壤微生物群落結構；侯曉杰等［23］研究表明，一定條件下合理配施肥料可顯著增加微生物多樣性；樊曉剛等［24］研究表明，短期施肥對土壤微生物影響較小。新墾土壤僅在試驗開展當年施用了肥料，其細菌群落多樣性較長期施用肥料的連作土壤相對單一，這與已有研究結論一致。高林等［25］研究認為，連續種植造成土壤細菌群落多樣性、豐富度降低，其種植年限是主要差異，而本研究比較的是已無種植年限差異的連作病害土壤與連作非病害土壤，是否發病是主要差異，因此結論并不矛盾。連作病害土壤中含有較高數量的藍細菌門和擬桿菌門，以及假單胞菌屬、鐵礦沙單孢菌屬、厭氧繩菌屬、節桿菌屬、黃桿菌屬和類諾卡氏菌屬。藍細菌門具有固氮作用，擬桿菌門則包含大量的病原菌，厭氧繩菌屬適宜在無氧環境生存，節桿菌屬和類諾卡氏菌屬具有降解煙堿的功能，可見連作病害土壤中不僅含有大量的病原菌，而且土壤環境適宜固氮菌、厭氧細菌及煙堿降解細菌生存。在煙區土地輪作較難實現的狀況下，采取有針對性的技術手段［26-29］降低連作病害土壤與連作非病害土壤間的微生物群落差異是解決煙草連作病害發生的一項重要措施。

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