藻菌生物膜處理含鎳廢水及其胞外聚合物變化研究

摘要：為探究藻菌生物膜處理含鎳廢水的可行性，對自然城市水體的藻菌富集掛膜得到藻菌生物膜，并在不同運行參數下對含鎳溶液進行處理，研究鎳的吸附量及藻菌生物膜胞外聚合物（EPS）含量在不同條件下的變化。結果表明，經富集掛膜的藻類屬于綠藻門小球藻屬，其對含鎳廢水有較高的處理效果，在pH為8、溫度為35 ℃時處理效果最佳；且能在3 d內達到鎳吸附平衡，去除率達70%以上，同時，藻菌生物膜多聚糖含量隨時間的變化與鎳吸附量呈一定的正相關，證明其為鎳吸附中的主要作用物質，而ATP含量則更能反映藻菌生物膜受脅迫的過程。藻菌生物膜在鎳的脅迫下，胞外聚合物含量隨脅迫程度升高而減少；從吸附量來看，其對鎳的耐受值為10 mg/L，在此范圍內，吸附量隨鎳濃度的升高而升高，最高達2.358 mg，繼續升高鎳濃度則吸附量明顯下降。

關鍵詞：藻菌生物膜；胞外聚合物（EPS）；鎳（Ni）；吸附量；去除率

中圖分類號：X703" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）03-0135-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.03.022 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on treatment of nickel-containing wastewater by alga-bacteria biofilm and changes of the extracellular polymeric substances

REN Yun-yun1， ZHANG Sha2， PEI Cuo-ping1， ZHANG Zhi-lin1

（1.Tongchuan Vocational and Technical College， Tongchuan" 727031，Shaanxi，China；

2.Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an" 710021，China）

Abstract： To explore the feasibility of algal-bacteria biofilm’s treatment for nickel-containing wastewater， alga-bacteria biofilm was obtained by filming algae and bacteria enrichment in natural urban water， and nickel-containing solution was treated under different operating parameters to study the adsorption amount of nickel and the change of extracellular polymer substance（EPS） content of algal bacteria biofilm under different conditions. The results showed that the algas after enrichment and filming belonged to Chlorella， which had a higher treatment effect on nickel-containing wastewater. The treatment effect was best when pH was 8 and the temperature was 35 ℃. Nickel adsorption equilibrium was reached within 3 days and the removal rate was more than 70%. At the same time， the content of polysaccharides in alga-bacteria biofilm with time was positively correlated with nickel adsorption amount， which proved that it was the main substance in nickel adsorption， while ATP content could reflect the stress process of alga-bacteria biofilm. Under the stress of nickel， the content of extracellular polymer substances in alga-bacteria biofilm decreased with the increase of stress. From the perspective of adsorption amount， its tolerance to nickel was 10 mg/L. Within this range， adsorption amount increased with the increase of the nickel concentration， up to 2.358 mg. However， adsorption amount decreased significantly when the nickel concentration continued to increase.

Key words： algae biofilm； extracellular polymer substance （EPS）； nickel （Ni）； adsorption amount； removal rate

隨著中國工業化的日益進步，由于資源開采及產業排放等原因，所造成的的環境污染也日益增加，其中最引人擔憂的便是各種重金屬污染［1］。而鎳（Ni）作為重金屬污染的八大元素之一，已經引起了各界廣泛的關注［2］。由于鎳被普遍應用于電子行業中，不僅導致制造業產生的鎳污染嚴重，同時也伴隨鎳礦開采對水體的污染［3］，這些鎳污染物通過地表水流沖刷及地下水滲透等方式進入地球水循環，并最終在生物鏈的作用下超量累積于生物體內，并對生物體形成長期毒害作用［4］。因此，對鎳污染水體的處理成為重金屬修復領域的研究重點。

通常使用的重金屬污染水體修復方法包括生物法、化學法及物理法。生物修復法由于其本身環境友好性、無二次污染的優點而受到廣泛關注［5］。其中，利用藻類修復重金屬比植物修復具有繁殖快、回收方便及吸附量大等優點，因此在此領域被寄予厚望［6，7］。范彩彩［8］利用鼠尾藻（Sargassum thunbergii）對重金屬Pb2+、Cd2+、Cu2+及Zn2+進行吸附，發現鼠尾藻對幾種重金屬都具有較好的吸附效果。Mata等［9］使用墨角藻（Fucus vesiculosus）對Pb2+、Cu2+及Cd2+進行吸附，發現其吸附能力表現為Pb2+＞Cu2+＞Cd2+，且吸附能力主要來自于墨角藻細胞壁上的巖藻聚糖。馬艷等［10］利用藻菌生物膜處理鉛鋅尾礦渣中的重金屬，結果表明藻菌生物膜可以通過胞外聚合物（EPS）與重金屬的絡合來吸附重金屬，其中對Pb2+的作用能力最強。以上研究已證明了藻類及藻菌生物膜對部分重金屬的去除效果，但目前使用藻菌生物膜處理鎳的報道仍較為鮮見。本研究擬利用城市自然水體，通過富集培養及掛膜制備藻菌生物膜，并對含鎳溶液進行處理，以驗證藻菌生物膜對鎳的處理效果及其胞外聚合物的變化，以期對鎳污染水體的生物修復提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用包含藻菌的水樣取自西安市長樂公園芙蓉湖。

液體培養基成分：每升培養基包含滅菌米湯水100 mL，Ca（NO3）2·4H2O 0.25 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，KH2PO4 0.05 g，ZnSO4·7H2O 0.05 g，NaHCO3 0.02 g，FeCl3、MnCl2、Na2MoO·H2O、CuSO4·5H2O痕量。

1.2 處理設計

背景重金屬的濃度過高將對微生物產生較強的脅迫毒害作用，因此研究中普遍采用的重金屬濃度為0.5～30.0 mg/L［11，12］。本試驗中采用的鎳濃度及運行參數根據需要具體設計如下。

1.2.1 pH對鎳處理效果的影響 鎳處理濃度為" " 1 mg/L，溫度為室溫，pH設計為5、6、7、8、9共5個梯度，在運行后2 d取樣，并測定鎳濃度。

1.2.2 溫度對鎳處理效果的影響 鎳處理濃度為" 1 mg/L，pH自然，溫度設計為25、30、35、40、45 ℃共 5個梯度，在運行后2 d取樣，并測定鎳濃度。

1.2.3 鎳初始濃度對其處理效果的影響 鎳處理濃度設計為1、5、10、15、20 mg/L共5個梯度，pH自然，溫度為室溫，在運行后3 d取樣，并測定鎳濃度、多聚糖及ATP含量。

1.2.4 生物膜處理含鎳廢水隨時間的變化 鎳處理濃度設計為8 mg/L，pH自然，溫度為室溫，在運行前取樣，并在之后每隔1 d取樣，測定鎳濃度、多聚糖及ATP含量。并設置空白對照（不添加鎳）。

以上試驗中每個處理設置3次重復。

1.3 試驗設計

1.3.1 藻菌富集培養及掛膜 取回一定量水樣后，在容積為20 L的有機玻璃圓桶中進行培養。培養條件：自然光照下室溫（夏季）培養，用空壓機進行曝氣，同時加入滅菌的液體培養基16 L用于培養生物膜，之后每10 d加1次培養基至原水位線。培養30 d后，用半軟性填料掛膜15 d，得到藻菌生物膜備用。

1.3.2 藻類鑒別 用壓滴法［13］制作藻類的標本片，通過顯微鏡（CX41RF型，奧林帕斯有限公司）放大" 1 000倍觀察。載玻片經洗滌劑浸泡24 h后用去離子水清洗再放入15%的硝酸溶液中浸泡24 h，重復2次后用去離子水洗凈備用。為便于采集生物膜樣品，每片填料上平行懸置2片預處理的載玻片。

1.3.3 鎳處理試驗 根據處理設計，配制含鎳溶液及調節相關參數。含鎳溶液使用NiCl2·6H2O（分析純），配制濃度為1 000 mg/L的濃縮液，在500 mL培養所得菌液中加入相應量的濃縮液，得到不同鎳初始濃度溶液。用1 mol/L NaOH（分析純）和HCl（分析純）調節pH，采用精密pH計（PHS-3C型，北京普析通用儀器有限公司）測定pH，使用水浴加熱鍋調節運行溫度。開始運行時每個處理組加入1片已掛膜且長勢相似的藻菌生物膜。

1.3.4 鎳濃度及胞外聚合物含量測定 從反應器中取100 mL水樣，并用鑷子刮取載玻片上約2 cm3生物膜，將二者一起放入離心機中6 000 r/min、20 ℃條件下離心10 min，取上清液，測定水樣中重金屬離子含量，并將離心后的生物膜分成2份，分別稱取重量并測定生物膜中多聚糖和ATP含量。

鎳濃度測定采用火焰法［14］，取100.0 mL水樣放入150 mL錐形燒杯中，加入硝酸5 mL，在電熱板上加熱消解（不要沸騰），蒸發至10 mL左右，再加入5 mL硝酸和2 mL高氯酸繼續消解，至1 mL左右，取下冷卻，并用水稀釋至100 mL標線，樣品經過針頭過濾器過濾后，用原子吸收光譜儀（AnaLyst 800型，珀金埃爾默儀器有限公司）測定鎳濃度。取0.2%硝酸100 mL，按上述相同的程序操作，以此為空白樣。

多聚糖的測定根據苯酚-硫酸法測定［15］，將離心后的1份生物膜放入10 mL試管中，加入1 mL去離子水并充分混合，加入質量分數為5%的苯酚溶液1 mL，搖勻后迅速加入5 mL質量分數為95%的硫酸溶液，在黑暗中反應10 min，再振蕩10 s。將試管置于30 ℃水浴10 min后，使用紫外分光光度計（Tu-1901型，肇慶市高能達化工有限公司）在" " "490 nm處比色測定吸光度，并根據標準曲線得出多聚糖濃度。

ATP的測定采用間接測定法［16］，即用含磷量測ATP。將離心后的1份生物膜加入裝有1 mL去離子水的試管中，完全混合后加入2.5 mL 95%的硫酸，然后蓋上紗布，用繩扎緊，置于高壓鍋加壓，溫度128 ℃，15 min后取出，室溫下冷卻后，加1～2滴30%過氧化氫溶液，搖勻，用2 mL去離子水稀釋，然后各試管加定磷試劑3 mL，置于45 ℃水浴25 min，取出冷卻至室溫，在紫外分光光度計上660 nm處比色測定，并根據標準曲線得出ATP濃度。

1.4 數據處理

吸附量=（初始濃度-吸附后濃度）×容量

去除率=吸附量/初始總量×100%

利用DPS 7.5軟件進行數據分析，采用Origin Pro 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 藻菌生物膜的培養及鑒別

藻菌富集及掛膜流程如圖1a所示，隨著富集時間的增加，水樣逐漸轉變為深綠色，藻類含量增加明顯，隨后在有機玻璃圓筒中用半軟性填料掛膜，掛膜15 d后，水樣顏色為黃綠色，掛膜30 d后，水樣呈深綠色，此時填料上已明顯附著一層藻菌生物膜。

填料掛膜過程如圖1b所示，取有機玻璃圓筒中水樣，顯微鏡下放大1 000倍，可觀察到淡綠色、球形或橢圓形、單細胞或無一定細胞數目的群體，對比《微生物的鑒別與圖譜》，此類微生物符合綠藻門小球藻屬微生物的典型特征，是一種較為常見的可從溶液中吸附重金屬的微生物。

2.2 處理參數對生物膜處理鎳效果的影響

藻菌生物膜在不同處理條件下對鎳的處理效果如圖2所示，3種參數中，pH對鎳處理效果影響較為明顯，而溫度對鎳處理效果影響較小，生物膜處理Ni2+的效果受Ni2+初始濃度影響明顯。隨著3種參數的升高，鎳處理效果皆表現為先升高后降低的趨勢。

由圖2a可以看出，當Ni2+初始濃度為1 mg/L、溫度為35 ℃的條件下處理1 d時，隨著pH的升高，Ni2+的去除率增大；當pH為8時，Ni2+的去除率達到最大，為38.07%，吸附量為0.190 mg；當pH為9時，其去除率迅速下降到31.01%。當pH為6～8時，去除效果較好。由圖2b可以看出，在Ni2+初始濃度為1 mg/L，pH為7的條件下處理1 d，隨著溫度的升高，去除率緩慢升高，并在溫度為35 ℃時達到最高值，為36.43%，吸附量為0.182 mg，之后隨著溫度的升高而迅速降低。由圖2c可以看出，處理2 d后，去除率隨著Ni2+初始濃度的升高，由Ni2+初始濃度為1 mg/L時的71.26%下降至Ni2+初始濃度為20 mg/L時的5.62%；但吸附量卻由Ni2+初始濃度為1 mg/L時的0.356 mg升高至Ni2+初始濃度為10 mg/L時的2.358 mg，并最終在Ni2+初始濃度為20 mg/L時下降至0.562 mg。

2.3 生物膜處理含鎳廢水的動力學擬合

由圖3可以看出，廢水中鎳含量持續減少，去除率持續增加。廢水中鎳濃度在反應器運行后1 d達4.879 mg/L，去除率達39.01%；在運行后3 d基本達到穩定，鎳濃度達2.308 mg/L，去除率達71.15%；在運行后6 d鎳濃度降至最低，為1.802 mg/L，去除率達最高，為77.48%。

對藻菌生物膜處理含鎳廢水的過程進行動力學擬合，結果如圖4所示，一級動力學模型和二級動力學模型都能較好地驗證數據。動力學模型用方程式表示，如表1所示，一級動力學模型和二級動力學模型的回歸系數（R2）分別為0.955 2和0.955 0，擬合效果較好。結果表明，藻菌生物膜在反應器運行后3 d能較高效地處理含鎳廢水。

2.4 含鎳廢水對生物膜胞外聚合物的影響

由圖5a可以看出，處理含鎳廢水的反應器中生物膜多聚糖含量比空白水樣中高，空白水樣中的多聚糖隨時間的延長而穩步上升，而處理含鎳廢水的反應器中生物膜多聚糖含量從0 d的0.53 mg/（mL·g）增加到4 d的1.42 mg/（mL·g）（最大值），并最終在" "6 d下降至0.87 mg/（mL·g）。

生物膜ATP的變化如圖5b所示，與多聚糖不同，處理含鎳廢水的反應器中生物膜ATP含量總是低于空白水樣，并在24 h內從2.81 mg/（mL·g）急劇下降至1.23 mg/（mL·g），并最終上升，在4 d時達5.16 mg/（mL·g），隨后趨于穩定。

不同鎳初始濃度對藻菌生物膜胞外聚合物含量的影響如圖6所示，隨著鎳初始濃度的增加，生物膜多聚糖含量和ATP含量都呈下降的趨勢。分別從鎳初始濃度1 mg/L時的1.20 mg/（mL·g）和4.03 mg/（mL·g），下降至鎳初始濃度為20 mg/L時的0.56 mg/（mL·g）和0.37 mg/（mL·g）。

縱觀藻菌生物膜處理含鎳廢水中生物膜胞外聚合物含量的變化，整體而言，隨處理含鎳廢水時間的延長，多聚糖含量和ATP含量都呈升高的趨勢，而隨著處理鎳初始濃度的增加，二者都呈下降的趨勢。

3 小結與討論

運行參數如pH、溫度及離子濃度都會對藻菌生物膜處理重金屬的效果造成明顯的影響［17］。研究表明，藻類細胞表面的自由位點數量是由pH控制的［18］，同時，對于胞外聚合物，強酸性和強堿性條件都會抑制其對重金屬的處理效果［19］。當pH升高至8時，鎳處理效果上升至最高，并隨著pH進一步升高而明顯下降。這主要是由于當溶液pH為酸性時，溶液中的H+與帶正電的鎳離子對目標位點產生競爭吸附，不利于水中鎳離子的去除；而且由于細胞壁上的羧基、磷酸基團、羥基、胺基等表面官能團在pH較小時是質子化的［20］，與鎳離子靜電相斥，不利于水中鎳離子的去除；且酸性條件也不利于藻類正常生存代謝［21］。當pH增大時，減弱了H+的競爭及官能團與鎳離子的靜電斥力，有利于藻類正常代謝及對水中鎳離子的去除。當pH過高時，藻類死亡率升高，將減少胞外多聚物的釋放，削弱對鎳的處理效果。

溫度是影響微生物生長的重要因素之一［22］，在處理含鎳廢水過程中，溫度為25～35 ℃時去除率較高，其隨溫度變化波動不大，最適溫度為35 ℃左右，這是因為在此溫度區間，微生物能較好地生長代謝，且由于重金屬吸附屬于放熱反應［23］，所以隨溫度的升高去除率有微小的上升。但當溫度過高時，藻菌生物膜代謝生長會受到嚴重影響，此時這種影響在整個作用系統中占據負面的主導地位，處理重金屬的效果將明顯減弱。

重金屬初始濃度不僅主導著生物膜的吸附量、去除率，同時也明顯影響微生物的生長代謝［24］。隨著鎳初始濃度的升高，生物膜吸附量先升高后下降，吸附量的升高是由于溶液中離子總量增加導致的富集增加，而隨后的減小則主要是由于過量的鎳離子已經對藻菌生物膜產生了明顯的毒害作用。在較高的重金屬背景下，藻類生物活性降低，死亡率上升，同時藻菌共生體分泌的胞外聚合物減少，影響去除效率［25］，不同鎳濃度下的胞外聚合物含量變化也證明了這一點；同時，在DLVO理論中，當離子濃度過高時，則會出現抗凝聚作用，也會導致吸附能力降低［26］。

在動力學研究中，除了發現藻菌生物膜表現出在3 d左右達到吸附平衡外，藻菌生物膜的胞外聚合物含量變化更能體現生物膜對鎳脅迫的響應。與空白水樣相比，由于鎳離子的刺激，生物膜分泌出更多的多聚糖，而隨著時間的變化，生物膜中多聚糖在運行后4 d達到最大值，而后開始緩慢下降，一方面說明由于鎳離子的刺激使得生物膜分泌更多的多聚糖等胞外聚合物以保護細胞在不利環境下的活性，大量微生物及植物都具備這樣的響應機制［27］；另一方面，生物膜分泌的多聚糖含量與鎳的去除率呈正相關，這可能的原因是多聚糖中的羥基等官能團能夠直接結合水中的重金屬離子［28］，因此多聚糖在鎳去除中扮演著重要角色。含鎳水樣中生物膜ATP含量整體比空白水樣小，這是由于鎳對微生物有一定的毒害作用，在加入鎳離子24 h內，ATP含量明顯減少，隨后由于生物膜分泌的胞外聚合物又提供了能緩沖重金屬毒性的微環境，導致生物膜微生物增多，活性增強，ATP含量逐漸升高。

由于微生物修復處理重金屬污染所具備的獨特優勢，其已逐漸成為污染修復領域的研究熱點。本研究結果表明，通過城市湖水水樣中藻類的富集掛膜得到藻菌生物膜，其對含鎳廢水具有良好的處理效果。通過不同處理參數下的運行，得出在pH為8、溫度為35 ℃左右時對鎳的去除效果較好，可在" "3 d左右達到吸附平衡，且生物膜對鎳的耐受值為10 mg/L。同時通過研究胞外聚合物含量的變化，鎳離子去除率在4 d時基本達到最高，多聚糖含量也在4 d時達到最高，結合鎳離子去除率和多聚糖含量隨處理時間的變化，可以得出二者呈一定程度的正相關關系。本研究證明了藻菌生物膜在重金屬處理中的應用價值。

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