極端環境固氮微生物研究進展

摘要：生物固氮是整個地球氮素循環中的重要環節，是極端環境初始生產力的主要來源，對全球生態系統的影響巨大，長期以來備受國際關注。本研究對近年來有關海洋（包括深海）、南北極地、高山、高原、冰川等極端環境固氮微生物及其作用研究進展進行了簡要綜述，同時就今后相關研究方向提出一些設想與展望。

關鍵詞：極端環境；固氮微生物；研究進展

中圖分類號：Q938" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）03-0213-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.03.033 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Research progress on nitrogen-fixing microorganisms in extreme environments

YUAN Jia-lin， WANG Yu-jing， WANG Long， LIU Jie

（College of Marine Science and Biological Engineering， Qingdao University of Science and Technology， Qingdao" 266042， Shandong， China）

Abstract：Biological nitrogen fixation is an important part of the entire planet’s nitrogen cycle， and is the main source of initial productivity in the extreme environment. It has a great impact on the global ecosystem and has been a hot spot of international concern for a long time. This article briefly reviewed recent research progress on nitrogen-fixing microorganisms and their effects in extreme environments such as oceans（including deep seas）， north and south poles， mountains， plateaus， glaciers and so on， and some ideas and prospects for future research directions were put forward.

Key words：extreme environment； nitrogen-fixing microorganism； research progress

在整個生物地球化學物質氮素循環中，主要由原核生物所引起的固氮作用是極為重要的一環。其固氮形式多種多樣，對全球的生態系統、農林業生產、氣候環境等影響巨大，因此長期備受國際關注。盡管對生物固氮微生物的研究已有一個多世紀，但主要針對極端環境的研究也就近幾十年的事。隨著科技的進步，關于極端環境固氮微生物及其作用的研究也逐漸多起來。本研究僅就近年來有關海洋（包括深海）、南北極地、高山、高原、冰川等極端環境固氮微生物的研究進展進行簡要綜述。

1 海洋（深海）固氮微生物的研究

自從20世紀60年代產氧光合藍細菌束毛藻屬（Trichodesmium）作為海洋中的一類具有最多遍布區域、最大固氮量特點的藍細菌被證實以來，人們對海洋固氮微生物進行了廣泛的研究。40多年的調查表明，海洋中的固氮微生物（包括海洋生物共附生固氮菌）主要包含［1］：藍細菌類（Trichodesmium、Oscillatoria、Pelagothrix、Katagnymene、Cyanothece、Microcystis、Synechococcus、Synechocystis等），光合細菌類（Rhodospirillum、Chromatium、Chromatium、Beggiatoa等），異養固氮細菌類（Azotobacter、Clostridium、Enterobacter、Flavobacterium、Bacillus、Vibrio、Desulfovibrio、Pseudomonas、Klebsiella等）。近十幾年來，人們采用新技術對海洋（包括深海）固氮菌的種類、生態地理分布及作用進行了廣泛的研究。

2011年，Zehr［2］報道顯示，一種具有固氮活性的單細胞藍藻存在于海水中。2012年， Turk-Kubo等［3］采用定量PCR測定了熱帶北大西洋藍藻固氮微生物中固氮酶的表達對鐵、磷、氧、氟、磷的響應，表明固氮微生物受鐵、磷限制。2013年，洪義國［4］對Trichodesmium進行了研究，結果表明，以海洋氮平衡通量為依據，僅憑Trichodesmium的數量來評價海洋中大量氮的固定存在嚴重局限性；同年，Farnelid等［5］采用依據固氮酶基因nifH的454焦磷酸高通量測序和定量PCR技術，研究了波羅的海盆地nifH的多樣性、豐度和轉錄，發現在水面下5 m和200 m缺氧水層以下與α、β、γ原生菌（nifH簇ⅰ）和厭氧菌（nifH簇Ⅲ）相關的nifH多樣性集合，同時發現異養nifH系統型的豐度高達2.1×107，nifH轉錄本（高達3.2×104）在nifH簇Ⅲ內發生N2固定［（0.44±0.26） nmol］。2014年，Wu等［6］通過固氮基因nifH和16S rRNA基因擴增手段，證實西南印度洋深海熱液硫化物區存在生物氮固定過程及相關微生物群落。2015年劉杰等［7］采用16S rRNA基因全序列測定法分析了青島近海沉積物和海水中固氮菌的多樣性；同年，張麗紅等［8］從南海淤泥中成功分離到一種能產芽孢、含有nifH、具有固氮酶活性的固氮菌，并表明固氮類芽孢菌在海洋中確有分布。

2017年，Thajudeen等［9］通過構建nifH克隆文庫等方法，從阿拉伯海東南部科欽河口沉積物中鑒定了固氮細菌群落，揭示了超過20種假定的重氮營養物（N2）細菌屬于α、β、γ、δ、ε-變形菌和厚壁菌門，且大多數是潛在的新物種；同年，Cheung等［10］使用454焦磷酸高通量測序法研究了日本東海海峽橫斷面上黑潮及其鄰近水域高度多樣化的固氮菌群落，發現大多數是藍細菌。王聰等［11］通過目測形態學特征、檢測生理生化、16S rDNA、nifH基因，以及還原乙炔法、鉬銻抗顯色法檢測菌株的固氮酶活性和解磷效能等方法，成功從西沙喜鹽草根際沉積物中分離篩選出具有特效固氮和快速解磷功能的菌株，并改良了其發酵條件。2018年，Li等［12］采用高通量測序和實時定量PCR方法，研究了西北太平洋重氮營養菌多樣性和氮利用基因的表達，表明在缺氮狀態下，原綠球菌和假交替單胞菌在屬水平上最豐富，缺氮區的nifH基因分布以藍細菌UCYN-A為主，脲酶和固氮酶比其他區域更豐富。2019年，Farnelid等［13］利用16S rRNA基因和nifH基因擴增子測序方法，對北太平洋副熱帶環流150 m處的下沉顆粒相關細菌群落以及固氮微生物的組成進行了評估，表明與周圍海水相比，顆粒富含固氮藍細菌（包括毛藻、硅藻共生體、單細胞藍細菌和UCYN-A藍細菌）；另外表明顆粒還含有不同非含氰細菌重氮營養物的nifH基因序列，推測可能是異養細菌的固氮位點。2020年，陳家欣等［14］通過目測形態特征、檢測生理生化和比對16S rRNA基因序列、產酶、解磷、解鉀等功能鑒定方法，探究了中國南海、東海島嶼近海固氮細菌的多樣性，以及對陸地作物的促生作用。同年，Kapili等［15］使用15N-DNA穩定同位素探測和nifH序列分析方法，從太平洋沉積物中鑒定到一個豐富的活性固氮微生物多樣性集合（包括嗜酸菌、厚壁菌、硝基螺旋菌、γ蛋白菌和δ蛋白菌），且具有最小nifH序列多樣性。2021年，Wang等［16］采用宏基因組學方法研究了印度洋貧營養表層海水中的微生物群落以及其對氮的獲取代謝潛力，結果顯示，微生物群落主要以變形菌和藍藻為主導，且溫度、磷酸鹽、硅酸鹽和pH是調節微生物分布的重要環境因素。另外，編碼氨代謝相關酶的基因（如尿素酶、谷氨酸脫氫酶、氨轉運蛋白和腈水解酶）豐度高于參與無機氮同化的基因，原綠球藻種群中不存在固氮酶和硝酸鹽還原酶。

2 南、北極地固氮微生物的研究

自20世紀初Halle［17］報道首次從南極分離出微生物以來，各國科學家陸續揭開了對南、北極地微生物研究的序幕。隨著交通和技術的進步，近些年來的相關研究呈快速上升趨勢。曾胤新等［18］研究表明，僅從1996年開始的10年時間里，刊登在IJSEM期刊上與嗜冷菌有關的70多個新種和20多個新屬中，有55個新種和15個新屬的分離源為南、北極地，但有關南、北極地固氮微生物的研究還相對較少。

早在1981年，Allnutt等［19］利用還原乙炔的方法對南極湖泊的6個樣品進行處理，以檢測樣品的固氮酶活性。1988年Vincent［20］調查了南極不同區域固氮細菌的固氮酶活性，這些區域包括冰雪、海底、海水、湖水、溪流、泥土、巖石等。1995年肖昌松等［21］調查了南極長城站周圍土壤固氮菌，結果顯示，105～107 cells/g是固氮細菌的菌量特征，并篩選出隸屬于Azotobacter屬的固氮菌。2000年Burkins等［22］研究了南極McMurdo Dry Valleys（MDV干谷）垂直斷面中有機物的來源和遍布特征，結果表明，此區域黏土中的碳、氮有機物大部分是自養微生物提供的。2012年Niederberger等［23］利用nifH基因測序、乙炔還原法和定量PCR法研究了南極MDV干谷黏土樣品，結果表明nifH基因多樣性水平在1.8～2.6范圍。其中藍細菌，α、β、γ和δ變形桿菌均為固氮微生物種類。同年Gesheva等［24］的調查地點為南極Haswell島的鳥類聚集區，并在環境溫度4 ℃和16 ℃條件下對土壤樣品進行稀釋和涂覆，最終篩選出固氮藍細菌等微藻。2017年劉杰等［25］從南極菲爾德斯半島不同區域土壤檢測到動物活動區土壤的固氮菌群數量要比苔蘚覆蓋區土壤高1～2個數量級。2020年Coyne等［26］在調查整個MDV干谷自養和異養固氮菌中發現，固氮菌僅存在于含有墊的樣品中，自養和異養固氮菌之間存在代謝偶聯，固氮菌與更廣泛的細菌群落顯著相關。

對北極地區固氮微生物近年來也有一些研究報道。2012年Díez等［27］報道了北極弗拉姆海峽和格陵蘭海的藍藻nifH基因具有高度多樣性，北緯65°～81°之間海冰鹽水和海水中存在自養和異養細菌群落；同時鑒定了藍細菌樣色球藻等多種藻類，證實了活的絲狀和單細胞藍細菌的存在，且具有在北冰洋固定N2O的潛力。2017年劉杰等［28］分離獲取48株固氮菌，其分離樣品源來自北極斯瓦爾巴群島冰川流域的土壤或冰水；同年Gradoville等［29］使用16S rRNA和nifH基因高通量測序法、碳和氮固定分析法以及宏基因組學法，描述了北太平洋副熱帶環流（NPSG）毛絲藻菌落及其表面附著固氮微生物組的多樣性與功能潛力（主要由擬桿菌屬、α變形菌屬和γ原生菌屬組成）。2021年Jabir等［30］利用nifH基因實時定量PCR法、nifH靶向克隆文庫與新一代序列分析技術，研究了北極峽灣Kongsfjorden沉積物中固氮菌的豐度和多樣性，發現 δ-變形菌綱固氮菌為優勢菌群（占總序列的 71%），同時闡明了環境因素對固氮菌分布的作用。

3 高原、高山、冰川、熱泉等固氮微生物的研究

一些高海拔嚴寒地帶（如高山、高原、冰川等）極易受氣候變化的影響，其主要特征是可以造成大氣氮沉降增加和改變降水分布格局，從而促進凍土活動層的擴張和土壤環境的變化，對土壤微生物多樣性影響巨大［31］。近些年來，從生態學角度對高寒生態系統氮循環微生物的研究多有報道［32-37］，但針對固氮微生物的研究卻相對較少。

2005年張于光等［38］采用nifH-PCR-RFLP、測序分析的方法，分析了青藏高原腹地不同區域及其植被類型土壤的固氮微生物群落組成。這些區域包括三江源自然保護區高寒草甸、草原、高山森林等，發現許多新的潛在固氮微生物株系。2006年尚占環等［39］在青藏高原江河源區域用常規培養的方法對退化程度不同的高寒草地的土壤微生物進行了實驗研究，以探究此區域土壤微生物的數量特征。結果顯示，在已參與研究的微生物類群里，隨著草地的逐步退化，固氮微生物（諸如硝化細菌、嫌氣性固氮菌、好氣性固氮菌和好氣性纖維分解菌）的數量逐漸下降，草地退化和非退化、甚至不同退化程度間的固氮微生物數量差別巨大。2013年康文龍等［40］探究了祁連山高寒草原上堿土中可培養固氮菌的數量、固氮細菌基因（nifH）群落組成結構及其理化性質，結果顯示，土壤深度的加大會導致固氮菌數量降低；固氮菌數量和地下生物量之間的關系保持直觀的同向改變，其與有機碳、有機氮、速效磷和速效鉀也保持同等程度增加的趨勢，而與pH、全鹽之間存在反向一致變化的關系。2016年Liu等［41］的研究表明，青藏高原扎當冰川終端10年冰消期土壤中，藍藻在總有機碳和總氮積累方面起著重要作用。同年，Zeng等［42］評估了冰川前陸中固氮基因（nifH）、硝化基因（amoA）和反硝化基因（nirK/S和nosZ）等功能基因的數量與豐度，發現這些基因的豐度隨土壤發育顯著增加，其中藍藻nifH基因序列是最主要的固氮菌（相對豐度從56.8%增加到93.2%）。2017年Kumar等［43］比較描述了邁爾霍芬高山地區和北極基爾皮什爾維、Ny-lesund高山氣候區中與兩種先鋒植物山酢漿草和虎耳草（藍虎耳草）相關的潛在固氮細菌群落，闡明了氣候區域對主要固氮菌的強烈影響。2021年Wang等［44］應用nifH定量 PCR和靶向擴增子測序方法，研究了海螺溝冰川前陸N2固定微生物群落的演替，發現nifH豐度沿時間序列的初級演替而增加，并與pH、乙炔還原活性、水、有機碳、總氮和有效氮以及有效磷含量呈正相關；差異豐富屬之間的變化可能是由于植物覆蓋度和物種組成的變化所引起。

除此之外，針對溫泉、熱源地固氮菌的研究也有零星報道。2013年Wang等［45］采用16S rRNA基因高通量測序法研究了西藏溫泉中的微生物多樣性和群落組成（包括固氮藍藻細菌），表明藍藻和氯氟菌含量豐富且與溫度有關，低溫時（55～43 ℃）呈正相關，中溫時（75～55 ℃）呈負相關。2018年馮燦等［46］分析了云南騰沖地熱區的兩個熱泉及其溪流三者的nifH基因的系統發育多樣性，討論了水體理化性質和固氮微生物群落組成的多樣性兩者間的關聯。結果顯示，固氮微生物群落多樣性在不同樣點之間的差異性特別微弱，表明溫度在云南騰沖熱泉的固氮微生物群落結構組成的多樣性變化中起關鍵作用。

4 小結

本研究對近年來有關海洋、極地、冰川、溫泉等極端環境固氮微生物的研究進展進行了簡要綜述。盡管內容涵蓋了物種、生態、生理生化、分子等多個方面，然而從現有為數不多的報道來看，大多數研究局限于較為單一的層面，還缺乏將固氮微生物各層面研究之間、以及與極端環境等因子結合起來的綜合報道。隨著國際上對極端環境碳、氮等重要元素循環的重視度不斷提高，相信今后人們會越來越多地采用宏基因組、轉錄組、代謝組等更先進的方法，對極端環境氮素循環微生物的作用過程（包括固氮、氨化、硝化、反硝化等）、代謝機理、分子遺傳、生態響應等進行更深入的研究；同時也會不斷發掘出更多新的氮循環功能微生物物種和基因，為相關的應用開發提供寶貴的低溫菌種與基因資源。

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