辣木葉提取物對柱花草和象草青貯品質的影響

摘要：為了探究辣木葉提取物（Leaf extracts of Moringa oleifera，MLE）對柱花草（Stylosanthes guianensis）和象草（Pennisetum purpureum）青貯品質的影響，在新鮮柱花草和象草中添加1%和2%辣木葉提取物（MLE1，MLE2），并以不添加提取物作為對照組（CK）。室溫青貯30天后測定樣品青貯發酵品質、細菌多樣性和體外消化率及產氣量。結果表明，與對照組相比，添加MLE極顯著降低柱花草青貯pH值、丁酸含量以及大腸桿菌數量（P＜0.01），極顯著增加乳酸菌數量（P＜0.01）；添加MLE極顯著降低象草青貯pH值、丁酸含量、大腸桿菌數量以及中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量（P＜0.01），極顯著增加了干物質消化率（P＜0.01）。添加MLE增加了柱花草和象草青貯中腸球菌屬的相對豐度，但對氣體組分和產氣量無顯著影響。本研究表明，添加2%MLE對柱花草與象草青貯品質改善效果更好。

關鍵詞：辣木葉提取物；青貯品質；細菌群落；消化率

中圖分類號：S816.5+3 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2023）07-2194-09

Effect of Leaf Extracts of Moringa oleracea on the Quality of Stylosanthes guianensis and Pennisetum purpureum Silages

HUANG Pei-shan， ZHANG Chao， CHEN Dan-dan， ZHANG Qing*

（College of Forestry and Landscape Architecture， South China Agricultural University，Guangdong Research Center of Woody Forage Engineering Technology， Guangzhou， Guangdong Province 510642， China）

Abstract：To investigate the effects of leaf extracts of Moringa oleifera （MLE） on the fermentation quality of Stylosanthes guianensis and Pennisetum purpureum silages，the fermentation quality，bacterial diversity and in vitro digestibility and gas production of the silage were analyzed after ensiled for 30 days at room temperature. The results showed that compared with the control group，the MLE addition treatments significantly reduced the pH value，butyric acid content and the number of coliform bacteria in Stylosanthes guianensis silage （Plt;0.01），and significantly increased the number of lactic acid bacteria （Plt;0.01）. The MLE addition treatments significantly decreased the pH value，butyric acid content，the number of coliform bacteria，neutral detergent fiber content and acid detergent fiber content in Pennisetum purpureum silage （Plt;0.01），and significantly increased the dry matter digestibility （Plt;0.01）. MLE addition increased the relative abundance of Enterococcus spp. of Stylosanthes guianensis and Pennisetum purpureum silages，but had no significant effect on gas fractions or gas production. Among the MLE additions，the 2% MLE addition had a better effect on improving the silage quality of Stylosanthes guianensis and Pennisetum purpureum.

Key words：leaf extracts of Moringa oleracea;Silage quality;Bacterial community;Digestibility

柱花草（Stylosanthes guianensis）與象草（Pennisetum purpureum）是我國南方地區廣泛種植的多年生暖季型牧草，具有高產、優質和營養豐富等特點，在畜牧生產中常被用作粗飼料^[1-2]。柱花草和象草生長具有季節性，為滿足家畜在牧草減產季節的營養需求，通常采用青貯的方式來保存^[3-4]。但柱花草緩沖能值高，加之收割時水分含量高，導致梭菌等有害菌增殖，因而不宜直接青貯^[5]。

植物提取物是指利用物理或化學等方法從植物體內提取出具有生物活性的物質，其中包括多糖、多酚、有機酸等有效成分，用作飼料添加劑時，其耐藥性較小，不容易產生殘留及毒副作用，具有較高的安全性和可靠性^[6]。有研究表明，牛至和百里香的水提取物和乙醇提取物可降低多年生黑麥草（Lolium perenne L.）、紅三葉草（Trifolium pretense）和紫花苜蓿（Medicago sativa L.）青貯樣品中的真菌毒素含量，提高青貯發酵品質^[7]。孫建政等^[8]發現松針精油的添加可對青貯主要有害微生物表現為較強抑制作用，對青貯有益菌（嗜酸乳桿菌）的生長起到一定促進作用。因此，植物提取物是青貯飼料的一種理想添加劑。辣木（Moringa oleifera Lam.），原產于印度，是多年生熱帶落葉喬木，在我廣東、海南、云南和貴州等地種植，其葉子富含氨基酸、蛋白質、維生素礦物質等營養物質與黃酮、多糖等活性成分^[9-10]。研究表明，辣木葉粉能降低蛋雞血清總膽固醇與低密度脂蛋白膽固醇含量，在一定程度上改善動物機體性能^[11]。辣木葉作為蛋白補充劑添加到青貯飼料飼喂奶牛，可使奶牛的采食量、消化率和產奶量提高^[12]。

隨著我國反芻家畜的養殖規模不斷擴大，作為反芻家畜基礎日糧的青貯飼料品質也越來越得到人們的關注。植物提取物作為一種新型飼料添加劑在反芻動物生產方面的研究報道頗為廣泛，而在青貯飼料領域的應用較少。本試驗通過添加不同含量的辣木葉提取物調制柱花草和象草青貯飼料，在青貯30天后開袋，分析不同含量的辣木葉提取物對柱花草和象草青貯飼料營養成分、體外產氣發酵指標與微生物菌群豐度的影響，以期為生產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用柱花草和象草材料種植于華南農業大學躍進北試驗田（23°19′ N，113°34′ E），辣木葉提取物（Leaf extracts of Moringa oleifera，MLE）為實驗室將新鮮辣木葉陰干后粉碎，在60℃，230 W條件下超聲提取1 h，經60℃旋轉蒸發濃縮后凍干獲得的粉狀物。

1.2 試驗設計

在2022年12月將新鮮的開花期的柱花草（CIAT 184）和抽穗期的象草分別用鍘刀切成約2 cm的短段，各自混合均勻用于以下處理：（1）對照組（CK）；（2）1%MLE處理組（MLE1）；（3）2%MLE處理組（MLE2）。添加量按照原材料鮮物質（Fresh matter，FM）的百分比計算。共6組處理，每組3個重復，每袋約100 g，共18袋。用真空封口機密封后于常溫下儲存30天。

1.3 微生物數目及化學指標的測定

青貯開袋后，將90 mL無菌生理鹽水加入到盛裝有10 g樣品的三角瓶中，并逐級稀釋至10^-6倍，得到6個梯度的樣品浸提液，分別用MRS瓊脂培養基、結晶紫中性紅瓊脂培養基和孟加拉紅培養基培養乳酸菌、大腸桿菌、霉菌與酵母菌，采用平板計數法計數^[13]。培養基均購于廣東環凱微生物科技有限公司。取10 g青貯樣品與90 mL純水混合均勻后置于4℃冰箱保存24 h，取出后過濾，用pH計測定濾液pH值。分別隨機取樣70 g，置于65℃恒溫烘箱中烘干48 h后稱重測定其干物質（Dry matter，DM）含量，用微型植物粉碎機對干燥后的樣品進行粉碎處理并過1 mm篩，置與干燥陰涼處用以測定其他營養成分。采用許慶方等^[14]的方法測定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量。按照Broderick等^[15]的方法測定氨態氮（Ammonium nitrogen，NH₃-N）含量。參照李玲等^[16]的方法測定粗蛋白（Crude protein，CP）和真蛋白（True protein，TP）含量，非蛋白氮含量（Non-protein nitrogen，NPN）為粗蛋白與真蛋白之間的差值。中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（Acid detergent fiber，ADF）含量則參照Van soest等^[17]的方法測定。采用蒽酮比色法測定可溶性碳水化合物（Water-soluble carbohydrates，WSC）含量^[18]。

1.4 體外產氣發酵指標

體外產氣發酵指標包括24 h產氣氣體組分，48 h干物質消化率，72 h產氣量。取0.2 g樣品粉末放入經39℃恒溫箱預熱的含30 mL人工瘤胃液體的100 mL質玻璃注射器中，參照張丹丹等^[19]的方法，測定體外干物質消化率與產氣量。產氣量為樣品產氣體積減去空白產氣體積。產氣氣體組分參照Wang等^[20]和Chen等^[21]的方法測定。

1.5 微生物多樣性分析

使用HiPure Soil DNA試劑盒對柱花草和象草青貯樣品進行DNA提取，使用引物341F（5′-ACTCCTACGGGAGWGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′）擴增細菌16SrRNA基因的V3～V4區域。而后進行聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR），用Illumina平臺（Guangzhou Gene Denovo，Guangzhou，China）對純化后的PCR產物進行測序。

1.6 數據處理

用SPSS 26和Microsoft Office Excel 2016軟件數據進行處理，采用One-way ANOVA進行單因素方差分析，采用Duncan多重極差檢驗進行顯著性差異。采用OriginPro 2023進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 青貯原料

柱花草和象草原料的特性如表1所示。柱花草干物質含量為30.25%，CP含量為8.67% DM，WSC含量為3.35% DM，NDF和ADF含量分別為59.71%DM和49.39% DM，微生物包括乳酸菌、大腸桿菌、酵母菌和霉菌，數量分別為2.97，3.74，4.77和4.77 lg cfu·g ^-1 FM。象草干物質含量為21.70%，CP含量為7.85% DM，WSC含量為3.93% DM，NDF和ADF含量分別為67.68% DM和39.02% DM，微生物包括乳酸菌、大腸桿菌、酵母菌和霉菌，分別為3.45，3.80，4.02和4.58 lg cfu·g ^-1 FM。

2.2 辣木葉提取物對柱花草青貯品質和微生物數量的影響

辣木葉提取物（MLE）對柱花草青貯發酵品質和微生物數量的影響如表2所示。添加2%辣木葉提取物顯著提升柱花草干物質含量（P＜0.05），添加辣木葉提取物極顯著降低了pH值、大腸桿菌數量以及丁酸含量（P＜0.01），同時極顯著提升了乳酸菌數量、乳酸含量和乙酸含量（P＜0.01）。

2.3 辣木葉提取物對柱花草青貯蛋白品質和纖維含量的影響

辣木葉提取物對柱花草青貯蛋白品質和纖維含量的影響如表3所示。添加辣木提取物對柱花草粗蛋白、非蛋白氮和酸性洗滌纖維含量沒有顯著性影響。添加辣木提取物顯著增加了TP的含量（P＜0.05），極顯著地增加了NH₃-N的含量（P＜0.01），顯著降低了NDF的含量（P＜0.05）。

2.4 辣木葉提取物對象草青貯品質和微生物數量的影響

辣木葉提取物對象草青貯發酵品質和微生物數量的影響如表4所示。添加辣木葉提取物極顯著地增加了象草青貯的干物質含量和乙酸含量（P＜0.01），極顯著降低了pH值、大腸桿菌數量以及丁酸含量（P＜0.01），除此之外，添加辣木葉提取物顯著增加了酵母菌數量（P＜0.05）。

2.5 辣木葉提取物對象草青貯蛋白品質和纖維含量的影響

辣木葉提取物對象草青貯蛋白品質和纖維含量的影響如表5所示。添加2%辣木葉提取物顯著增加了CP含量（P＜0.05），添加辣木葉提取物極顯著地增加了NPN含量（P＜0.01），極顯著降低了ADF和NDF含量（P＜0.01）。

2.6 辣木葉提取物對柱花草和象草青貯細菌群落的影響

柱花草和象草青貯中細菌群落主要屬水平相對豐度如圖1所示，在屬的分類下，柱花草CK組以甲基桿菌屬（Methylobacterium）、腸球菌屬（Enterococcus）和乳桿菌屬（Lactobacillus）為優勢菌屬，其相對豐度分別為23.15%，19.01%和6.35%。象草CK組以腸桿菌屬（Enterobacter）、魏斯氏菌屬（Weissella）和乳球菌屬（Lactococcus）為優勢菌屬，其相對豐度分別為32.06%，26.57%和5.16%。與對照組相比，柱花草MLE組腸球菌屬相對豐度更高，分別為69.32%和72.51%。象草MLE組中腸球菌屬為優勢菌屬，腸球菌屬相對豐度分別為29.81%和24.83%。

2.7 辣木葉提取物對柱花草和象草青貯體外消化產氣氣體成分及干物質消化率的影響

辣木葉提取物對柱花草和象草青貯體外消化產氣氣體成分及瘤胃消化率的影響如表6和表7所示。添加辣木葉提取物對各處理組的氫氣、甲烷和二氧化碳含量均無顯著影響。添加1%辣木葉提取物顯著降低柱花草青貯干物質消化率（P＜0.05），添加辣木葉提取物極顯著增加了象草青貯干物質消化率（P＜0.01）。

2.8 辣木葉提取物對柱花草和象草青貯產氣量的影響

如圖2所示，20 h以前，各處理組產氣量快速累積，產氣量無明顯差異。從20 h開始至72 h，象草各處理組的產氣量均高于柱花草各處理組的產氣量。在72 h時，PMLE2組累積產氣量比PCK組多，PMLE1組累積產氣量比PCK組低，SMLE1和SMLE2組累積產氣量均比SCK多，但象草和柱花草組內72 h產氣量沒有顯著差異。

3 討論

3.1 柱花草和象草原料的特點

本試驗中新鮮的柱花草WSC含量（3.35%DM）高于Wang等^[22]的結果，NDF含量低于吳碩等^[23]的研究結果（69.61%DM）。象草DM含量高于田靜等^[24]的研究結果（16.81%DM），ADF含量低于許留興等^[25]的結果。本試驗中原料的營養成分與他人的有差異，可能是不同的生長地區、氣候、品種、作物生長期以及采收期所致^[26-27]。兩種材料中的乳酸菌數量未達到良好青貯飼料標準（gt;5.0 lg cfu·g^-1）^[28]，且不良微生物數目相對較高，直接青貯容易引起不良發酵。

3.2 辣木葉提取物對柱花草青貯發酵品質、營養品質和微生物數量的影響

添加MLE后，乳酸菌數量和乳酸含量顯著升高，pH值顯著降低，從6.06下降至5.11，但沒有達到pH值為4.2的良好發酵標準^[29]。這可能是因為WSC（3.35% DM）的含量比較低，一般認為，青貯原料中的WSC含量須達到5% DM才能發酵良好^[30]。充足的可溶性碳水化合物可以讓乳酸菌快速產生乳酸，從而降低青貯環境pH值，抑制不良微生物的繁殖^[31]。孫洲悅等^[32]的研究表明，辣木葉多酚提取物對大腸桿菌、曲霉菌、枯草芽孢桿菌等均有抑制作用。黃酮、多糖等活性成分通過影響菌體細胞膜通透性而發揮其抑菌作用^[33]。添加辣木葉提取物的處理組未檢測到大腸桿菌，這可能是因為辣木葉中的黃酮類、皂苷類、多糖類、辣木素等成分，能夠抑制大腸桿菌的生長。所有處理組中的霉菌與酵母菌均未檢測出，這可能是因為青貯的厭氧環境使得二者生長受到抑制^[34]。在青貯過程中，植物蛋白的降解是不可避免的，其先是被植物蛋白酶或微生物水解成游離的氨基酸和肽，然后氨基酸進一步被降解成氨和胺等^[35]。氨態氮與總氮的比值反映了青貯飼料中蛋白質和氨基酸分解程度，比值越大，說明氨基酸和蛋白質分解越多^[36]。本研究中添加辣木葉提取物處理組的真蛋白含量與氨態氮含量都顯著增加了，這可能是辣木葉提取物中富含氨基酸^[37]，而當pH值gt;4.2時，由于梭菌等腐敗菌的活動，會將氨基酸進一步分解成氨態氮^[38-39]。優質青貯飼料要求氨態氮與總氮比值小于10%^[40]，本研究中的處理組該比值均小于10%，說明具備成為優質青貯飼料的條件。此外，添加辣木葉提取物的處理組顯著降低了NDF的含量，能在一定程度上改善青貯飼料品質。

3.3 辣木葉提取物對象草青貯發酵品質、營養品質和微生物數量的影響

當青貯原料水分含量超過70%時，腸桿菌、梭狀芽胞桿菌或異型發酵乳酸菌含量增加，使青貯飼料中的乙酸含量增加^[41]。在異型發酵過程中，乳酸會被分解成乙酸和丙二醇^[42]。本研究中象草原料的干物質含量為21.70%，含水量大于70%，因此容易進行異型發酵，添加了MLE處理組的乙酸顯著增加，可能就是異型發酵乳酸菌占優勢所致。同時，酵母菌的存在會代謝青貯中的乳酸和可溶性糖^[43]。這與添加MLE處理組有相對較低的乳酸含量和較高的酵母菌數量相對應。在有氧條件下酵母菌會引起青貯飼料的變質，因此酵母菌數目的增加值得關注。此外，PMLE1和PMLE2處理組的大腸桿菌數目顯著下降，這可能與青貯環境pH值顯著下降抑制其生長有關。PMLE2處理組的粗蛋白顯著增加，兩組PMLE處理組的TP有增加但不顯著，但NPN顯著增加了，這可能與原料高水分含量引起的梭菌活動增加有關^[44]。而氨態氮含量的增加也可能與前文所提的原因一致。飼料的纖維含量對動物的干物質采食量和消化率有著重要的影響，纖維的降解可以為乳酸菌提供額外的發酵底物^[45]。NDF含量與動物采食量有關，NDF含量越低，動物采食量越高^[46]。ADF是一種不易被動物消化利用的營養物質，其含量與飼料消化率有關，含量越低，飼料消化率越高^[47]。添加辣木葉提取物的處理組的NDF與ADF含量顯著降低，說明MLE在一定程度上能提高青貯品質。

3.4 辣木葉提取物對柱花草和象草青貯體外消化產氣量、氣體成分及干物質消化率的影響

在人為產生的溫室氣體中，畜牧生產排放的溫室氣體約占全球溫室氣體排放的15%，CH₄約占37%^[48]。一般來說，CO₂和H₂的轉化是瘤胃中CH₄產生的主要途徑。瘤胃中CH₄的產生會造成能量損失和飼料效率降低^[49]。為了實現可持續生產和提高飼料轉化效率，需尋找新的有效的飼料添加劑來減少瘤胃中CH₄的產生。此外，消化率是衡量飼料利用效率的重要指標，反芻動物飼料消化率低會導致溫室氣體產量的增加^[50]。在一些研究中，一些植物提取物添加劑雖然具有減少CH₄的作用，但對提高消化率沒有作用，甚至有負作用，抑制CH₄生成可能導致消化效率降低^[51-52]。消化率越高，瘤胃微生物可利用的營養物質越多，飼料的價值也就也高^[53]。本研究中，柱花草和象草中的MLE處理組沒有顯著降低CH₄，H₂以及CO₂的產氣量，但象草中MLE處理組的干物質消化率相比于對照組顯著提高，MLE1組提高了7.60%，MLE2組提高了16.70%。這說明添加MLE可提高象草青貯飼料的營養價值。體外發酵產氣量可以在一定程度上反映飼料在動物體內的消化程度，體現青貯飼料飼用價值，產氣量越高說明飼料中可發酵有機物含量高^[54]。象草青貯組的產氣量比柱花草青貯組的高，可能是因為象草是禾本科飼草，而柱花草是豆科飼草，禾本科飼草相對于豆科飼草含有更多易于發酵的可溶性碳水化合物^[55]。所有處理組均表現為在20 h內產氣較快，20 h后產氣變慢而后平緩，這與體外產氣基本規律大體一致^[56]。

3.5 辣木葉提取物對柱花草和象草青貯細菌群落的影響

青貯30天后，腸球菌屬為柱花草青貯發酵的優勢菌屬。腸球菌屬和魏斯氏菌屬為象草青貯發酵的優勢菌屬。從青貯微生物相對豐度變化來看，柱花草添加辣木葉處理組的乳酸桿菌屬豐度相較于CK有所減少，象草各處理組間乳酸桿菌屬豐度沒有顯著差異。MLE處理降低了柱花草青貯中甲基桿菌屬微生物的相對豐度，增加了腸球菌屬微生物的相對豐度，降低了象草青貯中腸桿菌屬微生物的相對豐度，增加了腸球菌屬和魏斯氏菌屬微生物的相對豐度，表明MLE通過改變柱花草和象草青貯的微生物相對豐度，從而進一步影響微生物的群落組成。田靜等^[57]的研究表明，柱花草表面附著較多的腸球菌屬乳酸菌，我們推測本試驗用到的柱花草和象草材料表面可能附著更多的腸球菌，而添加辣木提取物使其在相應的青貯環境中大量增殖，因而菌落相對豐度更高。但辣木葉提取物增加腸球菌屬的作用機制尚未明確，未來需要做進一步的探討。本研究中添加MLE的象草處理組乙酸含量顯著增加可能與魏斯氏菌有關，魏斯氏菌是一種會導致青貯過程中乙酸型發酵的異型發酵乳酸菌^[58]。

4 結論

本研究表明，在柱花草青貯中添加MLE可以降低pH值、大腸桿菌數量、丁酸和中性洗滌纖維含量，增加乳酸和真蛋白含量。在象草青貯中添加MLE可以降低pH值、大腸桿菌數量、丁酸含量、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量，增加乙酸含量和干物質消化率。綜合來看以2%MLE的添加量對柱花草和象草青貯品質的改善效果更為明顯，但最適添加量有待進一步考究。

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（責任編輯 閔芝智）