基于非線性光聲的組織熱凝固評估技術

摘" 要：組織的光吸收和通過組織的光通量差異顯著影響了當前基于光吸收原理的光聲技術對組織熱凝固評估的準確性。該研究基于格魯內森參數的溫度依賴性，提出一種消除組織光吸收系數、光通量影響的熱凝固評估光聲技術。該方法首先通過水浴快速加熱組織至41 ℃，采集不同溫度對應的光聲信號，基于格魯內森參數與溫度存在的線性關系得到光聲信號振幅隨組織溫度變化的斜率常數。然后利用初始溫度對應的光聲信號對斜率歸一化，即得到一個僅取決于溫度依賴性的參數。由于含水量是影響信號溫度依賴性的主要因素，而熱凝固過程中的組織脫水會導致信號的溫度依賴性減弱，因此，可根據歸一化斜率減小量來進行組織狀態評估。該文采用2種肌肉組織研究溫升范圍和初始溫度對歸一化斜率的影響，多次重復試驗的結果顯示當初始溫度小于38 ℃時，可根據歸一化斜率將正常與熱凝固后的肌肉組織完全區分開，熱凝固后組織的歸一化斜率相較于正常組織下降了52.81%～63.47%。試驗結果表明所提出的技術具有無損評估組織熱凝固的潛力。

關鍵詞：光聲成像；非線性光聲；格魯內森參數；組織熱凝固；歸一化斜率

中圖分類號：U17" " " 文獻標志碼：A" " " " " 文章編號：2095-2945（2023）19-0001-08

Abstract： The differences in the distribution of light absorption and the light fluence in tissue significantly affect the accuracy of the current light absorption-based photoacoustic techniques for the evaluation of tissue thermal coagulation. In this study， based on the temperature dependence of the Grüneisen parameter， we proposed a thermal coagulation evaluation photoacoustictechnique that eliminates the influence of the inhomogeneous distribution of tissue light absorption coefficient and light fluence. Firstly， the tissue is rapidly heated to 41 °C by a water bath， the photoacoustic signals corresponding to different temperatures are acquired， and the slope constant of the photoacoustic signal amplitude with the temperature of the tissue is obtained based on the linear relationship between Grüneisen parameter and temperature. The photoacoustic signal corresponding to the initial temperature is then used to normalize the slope， then a parameter determined only by its temperature dependence is obtained. Since the water content is the main factor affecting the temperature dependence of the signal， tissue dehydration due to the thermal coagulation will weaken the signal's temperature dependence， therefore， the tissue status can be characterized according to the reduction of the normalized slope. In this paper， two kinds of muscle tissues were used to investigate the influence of the ranges of temperature rise and the initial temperature on the normalized slope. The results of the repeated experiments showed that as the initial temperature was less than 38 ℃， the normal and coagulated muscle tissues could be completely distinguished according to the normalized slope. The normalized slope of the coagulated tissue decreased by 52.81%～63.47% compared to that of the normal tissue. The experimental results indicate the potential of the proposed technique for the non-invasive evaluation of tissue thermal coagulation.

Keywords： photoacoustic imaging; nonlinear photoacoustic; grüneisen parameter; thermal coagulation of tissue; normalized slope

近年來由于熱療可以用微、無創的方式對空間靶組織進行原位治療，具有術后感染率低、手術恢復期短、副作用小及安全性高等優勢，在治療良惡性腫瘤和皮膚美容等方面受到了臨床醫生的廣泛關注[1-2]。例如：高強度聚焦超聲消融[3-4]，激光熱療[5-7]，射頻/微波消融等[8-9]。因為這些熱療方式大多都是通過對組織進行熱消融的方式實現疾病治療，所以只有實現對組織熱凝固狀態的準確評估，才能真正發揮熱療作為一種微、無創治療手段的最大潛力。目前已經有磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）、超聲成像（Ultrasound Imaging，US）、光聲成像（Photoacoustic Imaging，PAI），以及光學成像如相干斷層成像（Optical Coherence Tomography，OCT）、光譜法等多種模態應用到了組織熱凝固的評估應用中。雖然這些技術各有優勢，但是也存在一定的局限性。例如，MRI雖然具有高分辨率和對比度的優點，但是成本高和便攜性差制約了其在熱療應用中的普及[10-11]；雖然US可以實時成像，但是對熱凝固組織的成像對比度低，且熱療過程中產生的空化泡會對熱凝固區域的判斷產生嚴重干擾[12]；傳統光學成像方法具有微米級的分辨率、高靈敏度和高對比度，但是成像深度受到光學散射極限的限制，成像深度僅限于皮下幾毫米[13-14]。PAI結合了光學成像的高對比度和超聲成像在深度成像中良好的空間分辨率的優勢，同時憑借較低的價格、非侵入、無損實時成像能力，有望成為一種在熱療中評估組織熱凝固狀態的理想工具[15]。

已有多項研究探究了光聲在光熱治療、射頻/微波消融、高強度聚焦超聲消融應用中評估熱凝固的潛力[16]。其中一類方法是基于光聲測溫原理來間接表征組織的熱凝固狀態，此類方法利用光聲信號幅值（格魯內森參數）與組織溫度的線性關系來估計組織的溫度[17]，進而根據溫度來評估組織狀態。首先，光聲測溫的準確性依賴于對被測組織光熱參數先驗信息的準確估計[18]；其次，僅根據溫度信息并不能決定組織是否發生熱凝固，熱凝固還與加熱維持的時間有關，有研究表明用熱劑量評估組織熱凝固比溫度更加準確[19]。另一類方法是基于熱凝固后組織光吸收系數的變化來評估組織狀態[20]。然而，在生物組織中，光聲信號幅值對光吸收系數和光通量極其敏感，同時還與格魯內森參數密切相關[21]。首先，為克服光通量隨著樣品的位置、光學特性改變而改變帶來的影響，基于光吸收的方法都需要對光通量進行精確測量[22]；其次，該方法需要消除光聲信號幅值隨溫度變化帶來的影響[13]；最后，在大多數離體組織的研究中組織熱凝固以后光聲信號會大幅增加，這與熱凝固后組織的光吸收和光散射系數增大有關[23]。然而，在活體研究考慮了血流灌注的影響以后，光聲信號反而由于組織熱凝固失血而大幅減小[24]。綜上，在組織熱凝固后，光吸收的變化規律較為復雜，基于光吸收的方法無法根據光聲信號單純地增大或者減小來區分組織狀態。

針對以上問題，本文提出一種基于單波長非線性光聲的組織熱凝固評估技術，在公式中利用在初始溫度的光聲信號消除光吸收和光通量兩項，得到只取決于溫度依賴性的歸一化斜率，實現在沒有光吸收和光通量的影響下評估組織的熱凝固狀態。本文通過肌肉試驗驗證了該方法在原理上的可行性，探究了溫升范圍和初始溫度對歸一化斜率的影響，旨在為組織熱凝固評估提供一種全新的對比度。

1" 材料與方法

1.1" 原理與方法

在光聲效應中，通過短脈沖激光引起組織內部溫度的變化，發生熱彈性膨脹并產生通過介質傳播的壓力波。因為組織受到激光脈沖的作用時間短，能量低，所以脈沖激光所帶來的熱量擴散以及體積脹縮可以忽略不計，假設組織是一個光吸收均勻的物質，那么激光照射的生物組織中產生的聲壓與溫度的關系可以表示為[21]

其中：P表示組織聲壓；T表示組織溫度；Γ（T）表示組織格魯內森參數，是一個與溫度T相關的函數；F（Φ）表示組織表面的激光通量；μa表示組織的光吸收系數。格魯內森參數可以由組織的熱膨脹系數β，聲速cs，恒壓比熱容cp表示為

為確保提出方法的安全性，如圖1（a）所示，本研究利用水浴通過熱傳導的方式將組織溫度升高到41 ℃即停止加熱，其間實時采集光聲信號（圖1（b））。然后立刻利用水循環系統將組織溫度冷卻到37 ℃以下，人體體表溫度通常在34～37 ℃，因此本研究涉及的溫度范圍是34～41 ℃；其中大于40 ℃的維持時間不超過15 min，遠低于常規熱療使用的43 ℃溫度和持續時間（gt;60 min）[25-26]。在該溫度范圍內，cs略有下降[27]，cp基本不變[28]，因此可以忽略掉這兩者的影響，故格魯內森參數隨溫度的變化率主要受熱膨脹系數的影響，在此溫度范圍內可將公式（2）表示為

此外，在光聲測溫技術的研究中[29]發現在10～55 ℃的溫度范圍內， 格魯內森參數與溫度成線性關系，由公式（1）和公式（3）可知P和β（T）與T也呈線性關系（圖1（c）），即

式中：a，b均為常量，a表征了熱膨脹系數對溫度的依賴性，a越大表示熱膨脹系數隨溫度的變化越劇烈。b與熱膨脹系數的絕對值大小相關。

假設組織升溫前的初始溫度為T1，則此時聲壓可以表示為

則利用初始溫度處的光聲壓P（T1）對公式（1）進行歸一化，并代入公式（2）、（3）、（4）可得（圖1（d））

公式（6）的歸一化斜率k已經消除了組織的光吸收和光通量的影響

式中：β（T1）是初始溫度T1處的熱膨脹系數，由公式（4）可知，歸一化斜率k初始溫度及熱膨脹系數對溫度的依賴性有關。

由文獻[30]可知，組織含水量是影響β（T）溫度依賴性的主要因素，組織含水量越高，歸一化斜率k越大。本研究提出的方法涉及的34～41 ℃溫度范圍內，組織發生熱凝固前的含水量保持不變，當初始溫度T1確定時，組織發生熱凝固前的歸一化斜率k是一個恒定值knative（T1）。當組織發生熱凝固后，組織脫水后會使k減小到kcoagulation。同樣地，在34～41 ℃溫度范圍內，脫水后的組織含水量也不會發生變化，因此，當確定初始溫度T1以后，kcoagulation（T1）也是一個恒定值。

1.2" 樣品制備

本研究選擇了2種肌肉組織：牛心和牛肉進行驗證性試驗。為避免組織在水浴中吸收水分導致含水量的不可控變化對試驗結果帶來的影響，將新鮮或者熱凝固后的組織樣本切割成1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm的立方體大小，嵌入大小為4 cm×4 cm×4 cm，濃度為1.5%的中空瓊脂仿體中（瓊脂作為生物組織固定物），最后用瓊脂密封仿體上表面。

1.3" 試驗系統

試驗裝置如圖2所示，使用可調諧光參量振蕩（Optical Parametric Oscillators，OPO）激光器（NSOPO-L532HF-200，中科思遠，中國，重復頻率：100 Hz，脈寬：5 ns）作為激勵源，試驗輸出激光波長為720 nm。輸出激光被耦合到一個定制高能光纖束（CeramOptec，德國）中并用3D打印支架固定后照射在試驗組織上，激光能量計測得組織表面的激光能量為4.5 mJ/cm2，遠小于美國國家標準（American National Standards，ANSI）規定的激光安全標準[31]。數字延遲脈沖發生器（DG538，中科思遠，中國）用于同步激光器和數據采集，觸發頻率被設置為100 Hz。光聲信號被一個圓形非聚焦超聲換能器（奧索電子科技，中國，中心頻率：1 MHz，帶寬：0.39～1.61 MHz，晶圓直徑：8 mm）接收，首先經過自制的低噪放大器（放大倍數：40 dB，帶寬：0.05～15 MHz）進行放大，再由示波器（Picoscope5000D，Pico科技，英國，采樣率：62.5 MHz）采集后實時存儲到計算機中。試驗組織被放置在充滿脫氣去離子水的有機玻璃水缸中央的支架上，外接一個控溫水池循環水進行組織加熱，使組織溫度在34～41 ℃范圍內均勻升溫。使用2個測量精度為0.01 ℃的K型熱電偶探針連接到多通道溫度測量儀（TP00-16Q，鉑電科技，中國，重復頻率：10 Hz），一個從包埋試驗組織的仿體下表面插入組織，并使熱電偶熱結節處于接收換能器聲軸下方；另一個放置在水缸中用于監測水溫，保證水缸中脫氣去離子水溫度分布均勻。校準多通道溫度測量儀系統時鐘與計算機系統時鐘，以便于將光聲信號和溫度數據進行同步。

仿體溫度提升范圍設置為34～41 ℃（該溫度下組織性質不變），每隔0.25 ℃采集一組該溫度下的光聲信號。為避免隨機噪聲干擾，在每一個溫度記錄點共采集100次光聲信號取平均值作為該溫度點的光聲信號，每2個信號點的間隔時間為0.01 s。為了更好地探索光聲信號與溫度之間的關系，水浴加熱的升溫速率為15 min/℃以保持仿體溫度分布的均勻性，因此，光聲信號取平均過程中采集的每個光聲信號可視為在同一溫度值下所采集的。

2" 結果與分析

2.1" 試驗驗證基于非線性光聲評估組織熱凝固的原理

為了驗證熱凝固前后的不同組織格魯內森參數具有不同溫度依賴性，本試驗在720 nm波長下，采用溫度可控的水浴法精確調整樣品溫度，對熱凝固前后的牛心和牛肉組織進行了試驗。

在34～41 ℃溫度變化范圍內，采集了牛心組織和牛肉組織熱凝固前后的光聲信號并在每個溫度點進行了平均處理，最后在34 ℃的位置對光聲信號幅值進行歸一化，并在整個試驗溫度范圍內用線性函數進行了最小二乘擬合。其中圖3（a）和圖3（c）分別表示牛心和牛肉熱凝固前后的仿體實物圖，圖3（b）和圖3（d）分別表示不同狀態下牛心、牛肉組織的光聲信號峰峰值與溫度關系。從圖3（b）和圖3（d）中可以看出，不同狀態（性質）下組織的光聲信號峰峰值與溫度呈線性相關，R2均大于0.9。根據圖3（b）牛心組織的試驗結果表明，雖然熱凝固前后組織的光聲信號峰峰值均隨溫度的升高而增加，但是熱凝固前的新鮮牛心組織斜率明顯大于熱凝固后的牛心組織，新鮮牛心組織的歸一化斜率為0.057 09，而將這塊組織熱凝固后的歸一化斜率為0.029 63，熱凝固后的歸一化斜率表現為熱凝固前組織的51.9%，這是格魯內森參數與溫度關系體現出來組織狀態特異性的結果。根據圖3（d）牛肉組織的試驗結果表示，熱凝固前的新鮮牛肉組織斜率明顯大于熱凝固后的牛肉組織，新鮮的牛肉組織的歸一化斜率為0.064 86，而將這塊組織熱凝固后的歸一化斜率為0.033 04，熱凝固后的歸一化斜率表現為熱凝固前組織的50.94%，與牛心組織的試驗結果具有相似的規律性。試驗結果表明，2種肌肉熱凝固后比熱凝固前的歸一化斜率顯著減小，歸一化斜率的減小量有望用于區分熱凝固前后的組織狀態。

2.2" 溫升范圍對于組織狀態評估準確性的影響

為了探究人體表初始溫度一定溫升范圍對于組織狀態評估準確性的影響，對36 ℃和37 ℃溫度下的不同組織，分別用3 ℃和4 ℃兩種升溫進行了10組的重復性試驗，如圖4所示。

由圖4（a）和圖4（b）結果顯示，在升溫為3 ℃，初始溫度為36 ℃和37 ℃時，正常與熱凝固后的牛心和牛肉組織試驗結果整體規律符合試驗預期，即熱凝固后的組織歸一化斜率小于正常組織，結果表明，在升溫為3 ℃，初始溫度為37 ℃時，歸一化斜率可以區分組織狀態。由圖4（c）和圖4（d）結果顯示，初始溫度為36 ℃和37 ℃時，升溫4 ℃能夠區分出正常與熱凝固后的牛心組織和牛肉組織。

2.3" 初始溫度對于組織狀態評估準確性的影響

為了驗證上述試驗規律的魯棒性，探索初始溫度的適用范圍，本研究控制溫度升高的截止溫度為41 ℃且保持恒定，探究初始溫度變化對正常與熱凝固后組織歸一化斜率的影響，對正常與熱凝固后牛心和牛肉組織做了10組的重復性試驗，如圖5所示。

對于圖5（a）所示的牛心組織而言，可以看出在截止溫度為41 ℃時，當初始溫度在37 ℃及以下時，即控制溫度區間大于等于4 ℃，本方法能夠有效區別正常與熱凝固后的牛心組織。由于存在系統噪聲，當初始溫度從37 ℃逐漸增高時，用于計算的數據集越來越小，導致歸一化斜率的抖動范圍越來越大，正常與熱凝固后組織的歸一化斜率開始重合。從圖中可以看到，當初始溫度從34 ℃逐漸增加到40 ℃時，熱凝固后組織的歸一化斜率比正常組織分別降低了55.36%、53.34%、53.26%、58.21%、63.47%、52.81%及-41.71%。

對于圖5（b）所示的牛肉組織而言，可以看出在截止溫度為41 ℃時，當初始溫度在38 ℃及以下時，即溫度區間大于3 ℃，正常組織斜率大于熱凝固后的組織，且在大于3 ℃區間范圍內歸一化斜率能夠區分正常與熱凝固后的組織。本方法在牛心和牛肉兩種組織上呈現出相似的試驗規律，即在34～37 ℃溫度范圍內，通過將組織升溫至41 ℃，利用光聲的非線性原理，將光聲信號幅值與溫度的歸一化斜率作為一個評估指標能夠有效且準確地評估組織是否發生熱凝固。同樣，當初始溫度從34 ℃逐漸增加到40 ℃時，熱凝固后的組織歸一化斜率比正常組織分別降低了55.31%、55.35%、54.72%、54.76%、62.69%、61.92%及13.64%。

3" 討論

已提出的光聲評估組織熱凝固狀態的方法中，大多是基于光吸收的原理，但是組織熱凝固前后的光吸收規律還未研究清楚，且光通量的校準一直是長期存在的問題[22]。針對以上問題，本文提出的基于格魯內森參數的溫度依賴性評估熱凝固的方法，可獲得一個只與組織熱膨脹系數溫度依賴性有關的參數：歸一化斜率。熱凝固前后的兩種肌肉組織的研究表明，熱凝固后組織的歸一化斜率均出現了顯著下降，與本文利用的組織熱凝固脫水導致溫度依賴性下降的原理相符[30]。因此，歸一化斜率有望作為一種新的對比度用于熱凝固的評估。

不同溫升和初始溫度的試驗驗證了本文采用的系統的溫度適用范圍，結果表明當溫升截止溫度為41 ℃，初始溫度小于38 ℃（溫升超過3 ℃）時，可根據歸一化斜率將正常與熱凝固后的組織狀態完全區分開，根據熱療的相關文獻[25-26]可知，溫升到41 ℃對于人體是安全的，同時初始溫度小于38 ℃也符合實際人體皮膚的溫度范圍。因此，本文提出的方法具有在臨床應用的潛力。此外，試驗結果顯示肌肉組織發生熱凝固后，歸一化斜率相較于正常組織下降了52.81%～63.47%，這提示本文提出的方法在溫升范圍小于3 ℃時，若已知正常組織的歸一化斜率，可根據歸一化斜率的減小量來評估組織狀態。

綜上，本文通過多次重復試驗驗證了提出的基于非線性光聲的組織熱凝固評估技術原理具有可行性。該技術原理有望應用于非侵入性地評估激光治療、聚焦超聲治療后是否產生熱凝固組織，未來在臨床上還可以擴展為組織含水量評估等更多組織狀態評估。同時本文中采取的加熱方式對淺表組織的成分評估的適用性更強，對于不同的應用需求可采用不同的加熱方式，例如對更深層次的組織進行性質評估，可采取中強度聚焦超聲等穿透更深的加熱方式，將在今后的工作中進行進一步的研究。

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基金項目：國家自然科學基金青年科學基金項目（62201103，62101083）；重慶自然科學基金面上項目（cstc2021jcyj-msxmX0739，cstc2021jcyj-msxmX0104）；中國博士后科學基金（2020M683260）

第一作者簡介：劉柯岑（1998-），女，碩士研究生。研究方向為光聲測溫。

*通信作者：單天琪（1990-），女，博士，副教授。研究主向為光聲成像。