‘熱研4號(hào)’王草青貯飼料中優(yōu)良乳酸菌的分離與鑒定

摘要：為探究王草（Pennisetum purpureum×P. americana）青貯飼料中優(yōu)質(zhì)乳酸菌的主要種類及其性質(zhì)，本研究以‘熱研4號(hào)’王草為對(duì)象，用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)、生理生化特征分析與16S r RNA基因序列分析相結(jié)合的方法對(duì)王草青貯飼料上附著的乳酸菌進(jìn)行了分離、培養(yǎng)、篩選和鑒定。研究結(jié)果表明：王草青貯飼料中分離得到了117株乳酸菌，能在8 h內(nèi)快速繁殖和產(chǎn)酸，沒(méi)有遲滯期，培養(yǎng)24 h可使發(fā)酵液pH值降至3.89～4.22的菌株有4株，它們分別為戊糖片球菌（K1和K2）、乳酸片球菌（K3）和糞腸球菌（K4）；但只有K1，K2和K4這3株菌株在培養(yǎng)基的NaCl濃度為3.5%和7.5%，pH值為3.5～8.0，15～45℃的環(huán)境中均能良好生長(zhǎng)，均能利用至少8種碳源；其中K4菌株不但能利用15種碳源，還能耐受50℃高溫。綜合以上考慮，本試驗(yàn)篩選出的戊糖片球菌（K1，K2）和糞腸球菌（K4）具有成為王草青貯飼料生產(chǎn)使用的優(yōu)質(zhì)乳酸菌添加劑的潛力。

關(guān)鍵詞：王草；青貯飼料；乳酸菌；分離鑒定；溫度

中圖分類號(hào)：S816.5+3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-0435（2023）08-2537-08

Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria Strain from

Pennisetum purpureum×P. americanum ‘Reyan No.4’ Silage

DANG Jia-hao1， LONG Shi-he1， LI Xue-feng2， PAN Jun-xin1， WANG Jian1*

（1. College of Animal Science and Technology， Hainan University， Haikou， Hainan Province 570228， China; 2. College of forestry，

Hainan University， Haikou， Hainan Province 570228， China）

Abstract：The objective of this experiment was to explore the main species and properties of excellent lactic acid bacteria in Pennisetum purpureum×P. americanum ‘Reyan No. 4’ silage. Pennisetum purpureum×P. americanum ‘Reyan No. 4’ was taken as the research material，and the lactic acid bacteria attached to Pennisetum purpureum×P. americanum ‘Reyan No. 4’silage were isolated，cultured，screened and identified by the combining methods of traditional microbial culture，physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence analysis. The results showed that one hundred and seventeen strains of lactic acid bacteria were isolated from the Pennisetum purpureum×P. americanum ‘Reyan No. 4’ silage，of which the four strains was able to rapidly multiply and produce acid within 8 hours，no lag period for acidproduction and reduce the pH of the fermentation broth to 3.89～4.22 after 24 hours of culture. The four strains were Pectorococcus pentosus （K1 and K2），Pectorococcus lactis （K3），and Enterococcus faecalis（K4），respectively. The K1，K2 and K4 lactic acid bacteria strains can grow well in MRS medium with NaCl concentration of 3.5% and 7.5%，pH of 3.5～8.0，and temperature of 15～45℃，along with using at least eight types of carbon sources. The K4 strain was not only use fifteen kinds of carbon sources，but also withstand 50℃ high temperature. In conclusion，Pediococcus pentosus （K1，K2） and Enterococcus faecalis （K4） stains had a high potential to be used as excellent silage additives in Pennisetum purpureum×P. americanum ‘Reyan No. 4’ silage making.

Key words：King grass;Silage;Lactic acid bacteria;Isolation and identification;Temperature

青貯飼料是牧草或飼料作物在厭氧環(huán)境條件下發(fā)酵調(diào)制而成的多汁飼料，具有質(zhì)地柔軟、酸甜清香的特性，是反芻動(dòng)物飼料的重要組成部分［1］。在原料青貯過(guò)程中，發(fā)揮主導(dǎo)發(fā)酵作用的乳酸菌種類繁多，其中原料本身附著的乳酸菌主要分屬于7個(gè)屬［2］，它們將可溶性碳水化合物轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸（主要是乳酸），使青貯原料的pH值降低，形成酸性環(huán)境，抑制梭狀芽孢桿菌、腐敗菌和霉菌等有害微生物的繁殖從而能夠較長(zhǎng)時(shí)間保存飼料［1-2］。除此之外，從青貯飼料中分離篩選出的優(yōu)良乳酸菌重新接種至同種原材料后也能在青貯發(fā)酵中發(fā)揮作用，改善青貯發(fā)酵品質(zhì)［3-5］。如：從多花黑麥草（Lolium multiflorum）自然青貯飼料中分離出的5株優(yōu)良乳酸菌回添到原材料青貯時(shí)，能顯著降低青貯飼料的pH值、氨態(tài)氮/總氮、異丁酸含量和干物質(zhì)的損失，提高了多花黑麥草的青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)［3］；從苜蓿（Madicago sativa）的4個(gè)不同品種青貯飼料中篩選出綜合性能較好的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）菌株LP31，接種到含水量為77.55%的苜蓿中青貯，促進(jìn)了乳酸發(fā)酵，有效抑制了青貯原料中產(chǎn)氣莢膜梭菌和酪丁酸梭菌活性，使苜蓿高水分青貯飼料的品質(zhì)得到了不同程度的改善［4］；從優(yōu)質(zhì)的玉米（Zea mays）青貯飼料中分離得到的兩株優(yōu)良乳酸菌玉米乳桿菌（Lactobacillus zeae）和堅(jiān)強(qiáng)腸球菌（Enterococcus durans）接種調(diào)制全株玉米青貯飼料時(shí)，接種乳酸菌后不但縮短了玉米青貯的時(shí)間，還提高了玉米青貯飼料的品質(zhì)［5］。因此篩選青貯飼料中的優(yōu)質(zhì)乳酸菌種質(zhì)資源對(duì)于制作高品質(zhì)青貯飼料具有重要意義。

‘熱研4號(hào)’王草（Pennisetum purpureum×P. americanum ‘Reyan No. 4’），是熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛種植的優(yōu)良雜交禾本科牧草，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)多年試種和適應(yīng)試驗(yàn)培育而成［6］。‘熱研4號(hào)’王草具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)和廣泛的土壤適應(yīng)性，其根系分泌的特異性酸性磷酸酶可活化利用酸性土壤中的有機(jī)磷［7］，使其在酸性土壤生長(zhǎng)迅速，生物產(chǎn)量高，在海南地區(qū)僅6～8月間的鮮草產(chǎn)量可高達(dá)3.92×104～11.31×104 kg·hm-2［8］；‘熱研4號(hào)’王草在黃河灘區(qū)也可以良好生長(zhǎng)，年鮮草產(chǎn)量高達(dá)17.33×104 ～22.28×104 kg·hm-2［9］；此外，‘熱研4號(hào)’王草的嫩莖多汁且略具甜味，葉片柔軟，適口性好，是優(yōu)良的青飼料［10］，因此，在夏秋季節(jié)青刈舍飼飼喂家畜過(guò)剩時(shí)，常將‘熱研4號(hào)’王草調(diào)制為青貯飼料以緩解冬春季節(jié)飼料短缺［10-12］。目前，涉及王草青貯的乳酸菌報(bào)道，主要聚焦于加入商品乳酸菌對(duì)其發(fā)酵品質(zhì)影響的研究，如劉秦華等［13］研究發(fā)現(xiàn)，王草青貯時(shí)添加商用乳酸菌鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus）和布氏乳桿菌（L. buchneri）雖能促進(jìn)乳酸發(fā)酵，在一定程度改善發(fā)酵品質(zhì)，但前者對(duì)高、中水分王草的發(fā)酵品質(zhì)改善效果不明顯，后者對(duì)低水分王草發(fā)酵品質(zhì)改善效果顯著，兩者混合添加到高、中水分含量王草的青貯效果比單獨(dú)添加鼠李糖更差；Sofyan等［14］在王草青貯時(shí)添加商用植物乳桿菌和酵母菌（Saccharomyces cerevisiae），雖能降低青貯飼料丁酸菌的含量，但對(duì)短鏈揮發(fā)性脂肪酸和氨態(tài)氮的產(chǎn)生無(wú)抑制效果，而田媛媛等［15］將商用乳酸菌分別添加到王草中青貯，結(jié)果表明，除丙酸含量外，青貯飼料的pH值，乙酸、丁酸和氨態(tài)氮含量均顯著降低，乳酸含量顯著提高。這些試驗(yàn)結(jié)果表明，商用乳酸菌對(duì)王草青貯利用的改善效用較差且不穩(wěn)定。就王草自身附著乳酸菌的相關(guān)研究方面，Santoso等［16］將王草鮮葉附著乳酸菌制成綠汁發(fā)酵液與金合歡（Acacia farnesiana）浸提液一起添加到王草中青貯，比無(wú)添加組青貯飼料的乳酸含量增多，丁酸含量降低；陳鑫珠等［11］也就不同茬次和高度王草鮮草的乳酸菌分布情況做了相關(guān)研究報(bào)道［11］，但王草青貯飼料中乳酸菌種類組成的分離和鑒定的研究報(bào)道相對(duì)較少，對(duì)其優(yōu)質(zhì)乳酸菌的篩選和再應(yīng)用的研究也相對(duì)薄弱。本研究擬對(duì)自然青貯王草中分離出的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，篩選出優(yōu)良乳酸菌，以期為后續(xù)應(yīng)用乳酸菌調(diào)制優(yōu)質(zhì)王草青貯飼料提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘熱研4號(hào)’王草的種莖于2020年6月5日將其以株行距50 cm×50 cm、與地面成45°角斜插種植在海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院試驗(yàn)基地（20°06′N，110°32′E）。常規(guī)田間管理，僅在苗期澆水2次，除雜草1次。在株體高度大于1.8 m時(shí)（營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期）刈割，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 乳酸菌的分離和優(yōu)良菌株的初步篩選

將刈割后的王草莖葉用鍘刀切至2～3 cm小段，手工混合均勻莖和葉后，隨機(jī)取樣稱重300 g并裝入規(guī)格為20 cm×30 cm的聚乙烯袋，再用真空封口機(jī)抽出袋內(nèi)空氣后封口，共12袋青貯飼料。室內(nèi)保存，常溫發(fā)酵45天后打開(kāi)青貯袋取樣，用于分離鑒定乳酸菌。

發(fā)酵結(jié)束后，稱取20 g青貯樣品裝入錐形瓶，然后加入無(wú)菌生理鹽水180 mL，在恒溫?fù)u床中以120 r·min-1的速度振蕩60 min，用四層無(wú)菌紗布過(guò)濾后對(duì)濾液進(jìn)行10-1至10-7連續(xù)梯度稀釋。參考袁潔等［3］方法分離和純化乳酸菌（3代），然后將分離純化的乳酸菌菌株活化后接種（3%接種量）至MRS液體培養(yǎng)液中，45℃下培養(yǎng)24 h。每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)。用分光光度計(jì)每隔2 h測(cè)定菌液的OD600 nm（波長(zhǎng)600 nm吸光度），用pH計(jì)（CT-6021A）測(cè)定發(fā)酵上清液的pH值，以此來(lái)初步篩選產(chǎn)酸能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速率快的乳酸菌菌株。

1.3 乳酸菌菌株的初步鑒定

參考陳衛(wèi)［17］的方法，用革蘭氏染色法和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)初步確認(rèn)菌株是否為乳酸菌菌株，對(duì)革蘭氏染色驗(yàn)證為陽(yáng)性的菌株和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)驗(yàn)證為陰性的菌株分別進(jìn)行葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)，37℃厭氧培養(yǎng)12 h后，菌液和50%甘油比例為1∶1，—80℃保存保種。

1.4 乳酸菌菌株生理生化特征分析

參考陳衛(wèi)［17］的方法，將初篩得到的乳酸菌菌株活化，在溫度為5，15，25，35，45和50℃條件下，觀察各菌株的耐溫性；在pH值為3.0，3.5，4.0，4.5，5.5，6.0，7.5和8.0的MRS（deMan-Rogosa-Sharpe）肉湯培養(yǎng)基中檢測(cè)菌株的耐酸性；在含3%和7.5%（W/V）NaCl濃度的MRS肉湯培養(yǎng)基中測(cè)定菌株的耐鹽性；通過(guò)細(xì)菌微量生化反應(yīng)管（型號(hào)J2210，杭州微生物試劑有限公司）來(lái)檢測(cè)不同菌株對(duì)18種碳源的利用情況。以上各檢測(cè)內(nèi)容均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.5 乳酸菌菌株16S rRNA基因測(cè)序

對(duì)初篩乳酸菌菌株的DNA使用細(xì)菌DNA提取試劑盒按說(shuō)明步驟（DNA試劑盒購(gòu)自北京天根生化試劑公司）提取。采用原核生物通用引物進(jìn)行16S rRNA基因片段擴(kuò)增，引物序列為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′［18］。PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1，陰性對(duì)照組為水。PCR反應(yīng)的具體程序參考楊曉丹等［18］的方法，循環(huán)35次。將得到的PCR純化產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較（Plt;0.05），用GraphPad Prism8.0（加利福尼亞，美國(guó)）繪圖。根據(jù)初篩菌株在45℃時(shí)的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)繪制各菌株的生長(zhǎng)速率曲線和產(chǎn)酸速率曲線。將所測(cè)菌株得到的16S rRNA序列在NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。根據(jù)BLAST結(jié)果，用MEGA 11.0軟件中的M-L法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，通過(guò)Bootstrap對(duì)分支聚類的穩(wěn)定性進(jìn)行1 000次隨機(jī)重復(fù)取樣評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌菌株的分離與初篩

本試驗(yàn)從王草青貯飼料中共分離獲得了117株乳酸菌菌株，將它們分別編號(hào)為L(zhǎng)AB1～LAB117。如圖1所示，這117株乳酸菌菌株在45℃下培養(yǎng)24 h后OD600 nm≥1.4且pH值＜4.0的菌株只有4株，將其分別命名為菌株K1，K2，K3和K4，作為初篩獲得的優(yōu)良乳酸菌菌株。

2.2 優(yōu)良乳酸菌菌株的生長(zhǎng)特性及產(chǎn)酸速率

4株初篩乳酸菌在45℃條件下培養(yǎng)24 h的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)酸速率曲線見(jiàn)圖2和圖3。前12 h內(nèi)，各乳酸菌的生長(zhǎng)速率均快速增加，12 h后生長(zhǎng)速率變慢，隨后一直到24 h生長(zhǎng)速率基本維持不變。K1，K2和K4的生長(zhǎng)速率始終顯著高于K3的生長(zhǎng)速率（P＜0.05），但K1，K2和K4的生長(zhǎng)速率差異不顯著。

4株乳酸菌培養(yǎng)液的pH值在前12 h均呈現(xiàn)較大幅度下降，12 h后各培養(yǎng)液的pH值分別為4.01（K1）、4.00（K2）、4.43（K3）和4.29（K4）。在12～24 h后各乳酸菌培養(yǎng)液的pH值波動(dòng)不明顯，在24 h發(fā)酵結(jié)束后K1，K2，K3和K4最終的pH值分別為4.02，3.89，4.23和4.12。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，K3培養(yǎng)液的pH值除在2 h比K4低外，其余培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的pH值均高于K1，K2和K4。

2.3 優(yōu)良乳酸菌菌株的生理生化特性比較

根據(jù)表2的試驗(yàn)結(jié)果，4株初篩得到的乳酸菌菌株的革蘭氏染色均為陽(yáng)性，菌株形態(tài)均為球菌，過(guò)氧化氫觸酶試驗(yàn)和葡萄糖產(chǎn)氣結(jié)果均為陰性。在5℃～45℃下4株乳酸菌菌株均可生長(zhǎng)，但5℃時(shí)生長(zhǎng)較差，15℃～45℃時(shí)生長(zhǎng)良好；溫度升高至50℃時(shí)，K1，K2和K3菌株均不能生長(zhǎng)，K4菌株雖能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)狀況一般。4株乳酸菌菌株在含3%NaCl的MRS肉湯培養(yǎng)基中均可良好生長(zhǎng)，在含7.5%NaCl的MRS肉湯培養(yǎng)基中K3菌株完全不能生長(zhǎng)，K1，K2和K4菌株雖能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)情況較差。在pH值≤3.5的MRS液體培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)的菌株是K3菌株，而在pH值為3.0的培養(yǎng)基中4株菌株都不能生長(zhǎng)，K1，K2和K4菌株在pH值為3.5的培養(yǎng)基生長(zhǎng)不良，但4株菌株均可在pH值為4.0～8.0的培養(yǎng)基中良好生長(zhǎng)。

4株初篩乳酸菌菌株對(duì)碳源的利用情況如表3所示。18種碳源中，4株菌株均可利用的碳源共8種，分別為葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、菊糖、七葉苷、果糖、蕈糖和甘露醇，4株菌株均不能利用的碳源為棉子糖。K1，K2與K3菌株均不能利用的碳源還有乳糖、蔗糖、山梨醇、鼠李糖和蜜二糖，K3菌株也不能利用纖維二糖和水楊苷中的碳源，對(duì)木糖中碳源的利用性也相對(duì)較弱。而K4菌株不能利用的碳源除棉子糖外，還有鼠李糖和松三糖。

2.4 優(yōu)良乳酸菌菌株16S rRNA基因序列分析

對(duì)4株優(yōu)良乳酸菌菌株的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，拼接后得到的16S rRNA基因序列用于進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建（圖4）以及各菌株的16S rRNA基因序列分析（表4）。篩選出的K1和K2菌株與戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）在基因庫(kù)中比對(duì)相似度分別為99.57%和99.78%，它們?cè)跇?gòu)建的進(jìn)化樹(shù)中處于同一進(jìn)化分支，將它們鑒定為戊糖片球菌；K3菌株與乳酸片球菌（P. acidilactici）在基因庫(kù)中比對(duì)相似度達(dá)到99.71%，在構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)中處于同一進(jìn)化分支，將其鑒定為乳酸片球菌；K4與糞腸球菌（Enterococcus faecalis）處于同一進(jìn)化分支，它在基因庫(kù)中比對(duì)基因相似度達(dá)到100%，將其鑒定為糞腸球菌。

3 討論

青貯原料表面附著的乳酸菌在青貯發(fā)酵過(guò)程中能夠適應(yīng)環(huán)境條件的改變，在青貯發(fā)酵過(guò)程中扮演著重要角色［19-20］，青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)受原料表面附著的乳酸菌的種類和特性影響［21］，優(yōu)良乳酸菌的一個(gè)重要參數(shù)是它的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)酸能力，快速的繁殖和較強(qiáng)產(chǎn)酸能力使得青貯很快進(jìn)入發(fā)酵階段，對(duì)丁酸菌、腐敗菌、霉菌等有害微生物的生長(zhǎng)起著抑制作用［22］。從自然發(fā)酵的青貯飼料中分離篩選出優(yōu)良乳酸菌，再回接至原料中更有利于調(diào)控原料的青貯發(fā)酵進(jìn)程，獲得品質(zhì)優(yōu)良的青貯飼料［23］。鑒于此，本研究首先對(duì)熱帶亞熱帶地區(qū)優(yōu)良禾本科牧草‘熱研4號(hào)’王草青貯后的優(yōu)良乳酸菌菌株進(jìn)行分離，采用目前常用的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)、生理生化特征分析進(jìn)行篩選。通過(guò)產(chǎn)酸效率和生長(zhǎng)速率初步篩選得到的4株乳酸菌菌株K1，K2，K3和K4均能在8 h內(nèi)快速繁殖和產(chǎn)酸，在發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有遲滯期，在24 h培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)酵液pH值在3.89～4.22之間，說(shuō)明這4株菌株具有成為王草青貯飼料乳酸菌添加劑潛力。研究已證明大多數(shù)乳酸菌生長(zhǎng)最適宜的溫度是30℃［24］。熱帶地區(qū)的高溫使普通乳酸菌菌株的活性降低，生長(zhǎng)受到限制，青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)較差［25］，使用耐熱乳酸菌調(diào)制青貯飼料是有效提高熱帶地區(qū)青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)的必要途徑［26］。本研究對(duì)初篩得到的乳酸菌菌株進(jìn)行的耐熱試驗(yàn)結(jié)果表明4株分離出的乳酸菌菌株都能在45℃下良好生長(zhǎng)，但K3菌株的耐酸性和耐鹽性相對(duì)較差，培養(yǎng)基的pH值≤3.5和NaCl含量達(dá)7.5%時(shí)均不能生長(zhǎng)，其余3株的耐酸性和耐鹽性均相對(duì)較強(qiáng)，因此K1，K2和K4菌株具有成為高溫條件下青貯飼料乳酸菌添加劑的潛質(zhì)。

在傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)、生理生化特征分析的基礎(chǔ)上，在分子水平采用16S r RNA基因序列分析手段對(duì)初篩得到的菌株可進(jìn)行屬種鑒定［27］，4株菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中3種微生物的基因相似度在99%以上，鑒定得到K1，K2菌株均為戊糖片球菌，K3為乳酸片球菌，K4為糞腸球菌。片球菌屬與腸球菌屬均是植物青貯原料本身附著乳酸菌的主要種屬之一［2］，但與陳鑫珠等［11］研究得到的王草鮮草附著的主要乳酸菌為植物乳桿菌和融合乳桿菌（Weissella confuse）這一結(jié)論不一致，原因可能在于本研究主要考察的是45℃高溫條件下能夠良好生長(zhǎng)繁殖的乳酸菌，而陳鑫珠等是在37℃下分離培養(yǎng)，培養(yǎng)條件的差異和青貯過(guò)程的變化使乳酸菌種類發(fā)生了較大的變化。Cai等人［19］的研究指出，飼料作物和青貯飼料中的優(yōu)勢(shì)微生物種群為乳桿菌和片球菌；如Kamga等人［28］在熱帶牧草象草（Pennisetum purpureum）和危地馬拉草（Trypsacum laxum）的青貯飼料中分離篩選得到的主要乳酸菌是干酪乳桿菌（L. casei），Pitiwittayakul等［29］在象草、臂形草（Brachiaria ruziziensis）、堅(jiān)尼草（Panicum maximum）、柱花草（Stylosanthes guianensis）和銀合歡（Leucaena leucocephala）這5種熱帶牧草綠汁發(fā)酵液中分離得到的乳酸菌主要是戊糖片球菌、發(fā)酵粘液乳桿菌（Limosilactobacillus fermentum）和植物乳桿菌，關(guān)皓等［30］在西南高溫高濕地區(qū)玉米和雜交象草［（P. purpureum ‘Mott’） × （P. americanum×P. purureum）］青貯飼料中分離得到的乳酸菌主要是植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和副干酪乳桿菌（L. paracasei），而片球菌和腸球菌是本試驗(yàn)王草自然青貯飼料中分離得到的優(yōu)良乳酸菌，與上述研究結(jié)果有所不同，可能是原材料種類和來(lái)源不同造成的，調(diào)制青貯飼料的區(qū)域溫度也可能影響青貯飼料發(fā)酵乳酸桿菌的類型［28］。Kung等［31］指出，乳酸菌作為青貯接種劑應(yīng)具有的特點(diǎn)是：在青貯發(fā)酵中占主導(dǎo)地位，具有同型發(fā)酵途徑且在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量乳酸，耐酸，能廣泛利用可溶性糖，不具有降解有機(jī)酸和蛋白水解的活性，能在廣泛的條件和溫度下生長(zhǎng)。本試驗(yàn)已驗(yàn)證篩選得到的4株菌株均能利用至少8種不同碳源，特別是糞腸球菌（K4菌株）能利用除棉子糖、鼠李糖和松三糖外的15種碳源生長(zhǎng)；4株菌株均能在15℃～45℃生長(zhǎng)，特別是糞腸球菌（K4菌株）能在50℃生長(zhǎng)，戊糖片球菌K1，K2菌株和糞腸球菌K4菌株有較強(qiáng)的耐酸、耐鹽能力，因此K1，K2和K4菌株可考慮作為熱帶地區(qū)飼料青貯的乳酸菌添加劑使用，其中K4菌株相對(duì)最佳，但這3株乳酸菌在青貯飼料中的具體應(yīng)用效果還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

經(jīng)對(duì)從王草青貯飼料中分離得到的4株優(yōu)良乳酸菌進(jìn)行生理、生化特征試驗(yàn)和16S rRNA序列分析，所篩菌株包括2株戊糖片球菌（K1和K2）、1株乳酸片球菌（K3）和1株糞腸球菌（K4），這4株菌株在15℃～45℃的MRS液體基質(zhì)中均能良好生長(zhǎng)，其中戊糖片球菌（K1和K2）和糞腸球菌（K4）在NaCl濃度為7.5%及pH值為3.5～8.0范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，能廣泛利用至少8種碳源，特別是糞腸球菌不但可以在50℃生長(zhǎng)，還能利用15種碳源作為發(fā)酵底物；K1，K2和K4具有耐鹽、耐酸、產(chǎn)酸能力強(qiáng)、良好的高溫適應(yīng)性和廣泛的發(fā)酵底物利用性等特點(diǎn)，是熱帶牧草王草青貯用乳酸菌添加劑可推薦菌株。

參考文獻(xiàn)

［1］李忠秋，劉春龍. 青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］. 家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，31（3）：95-98

［2］田靜，張建國(guó). 植物表面乳酸菌分布研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)通報(bào)，2021，37（9）：3-10

［3］袁潔，馬冉冉，張文潔，等. 自然青貯多花黑麥草優(yōu)良乳酸菌的篩選及對(duì)多花黑麥草青貯品質(zhì)的影響［J］. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2021，30（11）：132-143

［4］李榮榮，鄭猛虎，崔欣雨，等. 優(yōu)良乳酸菌的篩選及對(duì)苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響［J］. 中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2021，43（11）：69-75

［5］劉飛. 青貯飼料中優(yōu)良乳酸菌的分離鑒定及其應(yīng)用［D］. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005：34-51

［6］劉國(guó)道，白昌軍，王東勁，等. 熱研4號(hào)王草選育［J］. 草地學(xué)報(bào)，2002，10（2）：92-96

［7］黃睿，趙興坤，虞道耿，等. 熱研4號(hào)王草對(duì)不同有機(jī)磷活化利用能力的評(píng)價(jià)［J］. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2019，40（5）：850-856

［8］曹啟民，張永北，王博，等. 刈割和施肥對(duì)熱研4號(hào)王草生物量影響初報(bào)［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，45（10）：50-54

［9］郭孝，鄧紅雨，白昌軍，等. 黃河灘區(qū)不同刈割期對(duì)熱研4號(hào)王草生產(chǎn)性能和品質(zhì)的影響［J］. 草地學(xué)報(bào)，2017，25（3）：639-645

［10］龍仕和，李雪楓，潘俊歆，等. 不同生長(zhǎng)天數(shù)‘熱研4號(hào)’王草青貯品質(zhì)和微生物群落多樣性研究［J］. 草地學(xué)報(bào)，2022，30（7）：1900-1908

［11］陳鑫珠，張建國(guó). 不同茬次和高度熱研四號(hào)王草的乳酸菌分布及青貯發(fā)酵品質(zhì)［J］. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2021，30（1）：150-158

［12］梁龍飛，王飛，董祥，等. ‘熱研4號(hào)’王草替代紫花苜蓿對(duì)TMR發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性的影響［J］. 草地學(xué)報(bào)，2020，28（3）：703-711

［13］劉秦華，張建國(guó)，盧小良. 乳酸菌添加劑對(duì)王草青貯發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性的影響［J］. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18（4）：131-137

［14］SOFYAN A，YUSIATI L M，WIDYASTUTI Y，et al. Microbiological characteristic and ferment ability of king grass （Pennisetum hybrid） silage treated by lactic acid bacteria yeast inoculants consortium combined with bran addition［J］. Journal of the Indonesian Tropical Animal Agriculture，2011，36（4）：265-272

［15］蔣媛媛，田逢博，字學(xué)娟，等. 添加乳酸菌和糖蜜對(duì)王草青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響［J］. 家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2022，43（10）：67-70

［16］SANTOSO B，HARIADIA B T，MANIK H，et al. Silage quality of king grass （Pennisetum purpureophoides） treated with epiphytic lactic acid bacteria and tannin of acacia［J］. Media Peternakan，2011，9（34）：140-145

［17］陳衛(wèi). 乳酸菌科學(xué)與技術(shù)［M］. 北京：科學(xué)出版社，2018：841-911

［18］楊曉丹，原現(xiàn)軍，郭剛，等. 西藏豆科牧草青貯飼料中耐低溫優(yōu)良乳酸菌的篩選［J］. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2015，24（6）：99-107

［19］CAI Y，KUMAI S，OGAWA M，et al. Characterization and identification of pediococcus species isolated from forage crops and their application for silage preparation［J］. Applied and Environmental Microbiology，1999，65（7）：2901-2906

［20］CAI Y，KUMAI S，OGAWA M，et al. Influence of Lactobacillus spp. from an inoculant and of Weissella and Leuconostoc spp. from forage crops on silage fermentation［J］. Applied and Environmental Microbiology，1998，64（8）：2982-2987

［21］LIN C，BOLSEN K K，BRENT B E，et al. Epiphytic lactic acid bacteria succession during the pre-ensiling and ensiling periods of alfalfa and maize［J］. Journal of Applied Bacteriology，1992，73（5）：375-387

［22］張紅梅，段珍，李霞，等. 青貯飼料乳酸菌添加劑的應(yīng)用現(xiàn)狀［J］. 草業(yè)科學(xué)，2017，34（12）：2575-2583

［23］何軼群，雷趙民，吳潤(rùn)，等. 青貯飼料中優(yōu)良乳酸菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究［J］. 生物技術(shù)通報(bào)，2013（5）：177-183

［24］MCDONALD P，HENDERSON A R，HERON S J E. The biochemistry of silage［M］. 2nd Edition.Chalcombe Publications，Marlow，UK，1991：81-151

［25］BERNARDES T F，DANIEL J L P，ADESOGAN A T，et al. Silage review：Unique challenges of silages made in hot and cold regions［J］. Journal of Dairy Science，2018，101（5）：4001-4019

［26］CHEN M，LIU Q，XIN G，et al. Characteristics of lactic acid bacteria isolates and their inoculating effects on the silage fermentation at high temperature［J］. Letters in Applied Microbiology，2013，56（1）：71-78

［27］MCALLISTER T A，DUNIERE L，DROUIN P，et al. Silage review：Using molecular approaches to define the microbial ecology of silage［J］. Journal of Dairy Science，2018，101（5）：4060-4074

［28］KAMGA P，KAMGA P B. Isolation and identification of the predominant lactobacilli in elephant grass （Pennisetum purpureum） and Guatemala grass （Trypsacum laxum） silage from Bambui，Cameroon［J］. World Journal of Applied Microbiology and Biotechnology，1988，4（2）：209-213

［29］PITIWITTAYAKUL N，BUREENOK S，SCHONEWILLE J T. Selective thermotolerant lactic acid bacteria isolated from fermented juice of epiphytic lactic acid bacteria and their effects on fermentation quality of stylo silages［J］. Frontiers in Microbiology，2021（12）：673946

［30］關(guān)皓，曾泰儒，帥楊，等. 西南高溫高濕地區(qū)青貯中天然乳酸菌群落結(jié)構(gòu)特征及優(yōu)質(zhì)乳酸菌的篩選［J］. 草業(yè)科學(xué)，2019，36（12）：3203-3213

［31］KUNG L J R，STOKES M R，LIN C J. Silage additives［C］// BUXTON D R，MUCK R E，HARRISON J H. Silage Science and Technology. Wisconsin：American Society of Agronomy. Press，2003：305-360

（責(zé)任編輯 閔芝智）

收稿日期：2023-01-04；修回日期：2023-02-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31860682）；海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（321RC471，317054）資助

作者簡(jiǎn)介：黨佳皓（2000-），男，漢族，山西運(yùn)城人，碩士研究生，主要從事飼草料調(diào)制與加工利用研究，E-mail：1003449925@qq.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：wangjian901@163.com