高效液相色譜法測定代可可脂巧克力中的赤蘚紅色素

摘""""" 要：建立一種簡便快速處理代可可脂巧克力樣品并檢測樣品中赤蘚紅色素含量的高效液相色譜方法。樣品在酸性條件下提取，沉淀蛋白，調節pH至中性，高效液相色譜儀進行檢測。在該方法條件下，赤蘚紅在0.2～10.0 mg·L^-1范圍內呈現良好線性，相關系數gt;0.999，檢出限為0.2 mg·kg^-1，定量限為0.6 mg·kg^-1。在2.0、10.0、50.0 mg·kg^-1的加標濃度水平下回收率為90.1%～95.3%，相對標準偏差RSD為1.03%～3.29%（n=6）。本法操作簡便、基質干擾小、靈敏度高、快速準確，可適用于代可可脂巧克力中赤蘚紅色素的快速檢測。

關" 鍵" 詞：高效液相色譜；赤蘚紅；色素；檢測

中圖分類號：O657.7⁺2"""" "文獻標識碼： A"""" 文章編號： 1004-0935（2023）08-1229-04

食用色素，又稱為著色劑，分為合成色素（焦油色素）、天然色素和其他色素。其中，合成色素因其性質穩定、色彩鮮艷、易于著色、成本低廉等優點而在食品生產過程中得到廣泛使用^[1]。但人工合成色素的過度食用會損害人體健康，研究表明，某些合成色素過度攝入不僅可能引起機能亢進，對甲狀腺等造成傷害，甚至在人體內代謝后還可能產生致癌物質，大量攝入會對人體產生毒害作用，特別是對兒童的生長發育產生不利影響^[2]。因此，世界各國如美國、俄羅斯、歐盟等都對合成色素的使用都有嚴格的規定，盡管它們都經過評估較為安全，但仍存在一定風險^[3]。

赤蘚紅色素（INS 127）屬于人工合成色素的一種，是我國允許使用的11種人工合成色素之一，多用于可可制品、糖果、糕點上彩裝以及果蔬汁飲料等食品中，以提高其產品的鮮艷度，吸引消費者^[4]。根據我國食品安全國家標準GB 2760—2016的規定，赤蘚紅及其鋁色淀在可可制品、巧克力和巧克力制品（包括代可可脂巧克力及制品）的最大使用量不得超過0.05 g·kg^-1。

目前，食品中赤蘚紅色素的檢測方法主要有分光光度法^[5]、高效（超高效）液相色譜法^[6-9]、薄層色譜法^[10]、SERS快速檢測法^[11]、共振瑞利散射法^[12]等。《食品國家安全標準 食品中合成著色劑的測定》（GB 5009.35—2016）^[13]采用高效液相色譜法對飲料、配制酒、硬糖、蜜餞、淀粉軟糖、巧克力豆及著色糖衣制品中合成著色劑進行檢測，其中含赤蘚紅的樣品采用液-液分配法進行檢測，但該方法操作步驟繁瑣，測試過程中待測物損失較大，再加上代可可脂巧克力中含有乳粉、油脂等多種成分，基質比較復雜，采用液-液分配法測試過程中易產生渾濁，有機相與水相間不易分層，前處理效果不理想。本研究擬探究代可可脂巧克力樣品中赤蘚紅色素的前處理方法的簡化，并采用高效液相色譜法進行" 測定。

1" 材料與方法

1.1" 試劑與儀器

試劑：甲醇，色譜純，Fisher公司；鹽酸，優級純，國藥集團；氨水，色譜純，ANPEL公司；無水乙醇，優級純，國藥集團；乙酸銨，色譜純，Fisher公司；赤蘚紅標準品，85.7%，DR。

儀器：高效液相色譜儀，E2695配備2998二極管陣列檢測器及Empower工作站，美國Waters公司；超純水制備系統，Milli-Q，美國Millipore公司；電子天平，SQP，德國賽多利斯公司；超聲波清洗器，KQ-250DB，昆山市超聲儀器有限公司；離心機，H1750R，長沙湘儀離心機儀器有限公司；渦旋混合儀，Vortex Mixer T2，上海Titan Scientific Lab。

1.2" 方法

1.2.1" 樣品前處理

稱取5.000 g樣品于離心管中，加入20 mL 10%鹽酸溶液，渦旋混勻，超聲40 min，轉移至50 mL容量瓶中，加入20 mL無水乙醇，渦旋混合均勻后，用氨水調pH至6.0～7.0，用水定容，-20 ℃冷凍離心，取上清液過0.45 μm濾膜，供液相色譜分析。

1.2.2" 標準溶液配制

稱取預先干燥的赤蘚紅標準物質0.029 2 g于25 mL容量瓶中，用超純水溶解并定容，得到赤蘚紅標準儲備液（1 000 mg·L^-1）。

吸取赤蘚紅標準儲備液（1 000 mg·L^-1），用超純水稀釋成100 mg·L^-1的標準中間液，再依次稀釋成0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg·L^-1的標準系列工作溶液。

1.3" 色譜條件

色譜柱為Syncronis C18反相色譜柱（Thermo Scientific，150mm×4.6mm，5 μm）；流動相A為""" 20 mmol·L^-1乙酸銨溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫條件見表1；柱溫為35 ℃；流速為1.0 mL·min^-1；二極管陣列檢測器，檢測波長為530nm；進樣量為10 μL。

2" 結果與討論

2.1" 色譜條件選擇

2.1.1" 檢測波長的選擇

通過在200～800 nm波長下掃描赤蘚紅光譜圖發現，赤蘚紅的最大吸收波長為530.8 nm，見圖1。

因此選擇530 nm為檢測波長，可以有效排除其他雜質干擾，得到峰形清晰對稱的赤蘚紅色譜圖（如圖2所示），保留時間為12.047 min。

2.1.2" 洗脫條件的確認

在表1梯度洗脫條件下，可以看到在530 nm下的代可可脂巧克力樣品中含有的兩種色素成分可以得到有效分離（如圖3所示），且單個樣品分析用時較短，因此選擇該梯度洗脫條件用于本方法測定。

2.2" 微孔濾膜的選擇

在測試過程中發現，由于尼龍材質的微孔濾膜對赤蘚紅的吸附作用，經過微孔濾膜過濾后，濾膜上肉眼可見明顯物質吸附，其色譜峰面積明顯下降，而使用混合纖維素濾膜則可以得到較好的測試"" 結果。

2.3" 標準曲線和檢出限的確定

2.3.1" 標準曲線

按1.2.2配制標準曲線工作液，依次注入高效液相色譜儀進行測定，以峰面積（A）與對應的標準系列工作液質量濃度（C）繪制標準曲線，如圖4所示。由圖4可以看出，赤蘚紅在0.2～10.0 mg·L^-1范圍內呈良好的線性關系，相關系數r大于0.999，線性方程為y=54 737.1x-935.9。

2.3.2" 方法檢出限和定量限的確定

方法檢出限以3倍信噪比來計算，定量限以" 10倍信噪比計算，則本方法檢出限（LOD）為""""" 0.2 mg·kg^-1，定量限（LQD）為0.6 mg·kg^-1。

2.4" 方法重復性試驗

選取同一份含有赤蘚紅的代可可脂巧克力樣品，重復測定6次，其結果見表2。從表2中可以看出，本方法的重復性較好，所測赤蘚紅的RSD為1.08%，小于5%。

2.5" 方法回收率及精密度

本方法采用保留時間定性，外標法定量。分別在不含有待測物質的代可可脂巧克力樣品中添加低（2.0 mg·kg^-1）、中（10.0 mg·kg^-1）、高（50.0 mg·kg^-1）3個質量濃度水平的標準溶液，每個加標水平平行測定6次，結果見表3。

由表3可以看出，經計算得到的赤蘚紅加標回收率在90.1%～95.3%范圍內，相對標準偏差（RSD）分別為1.03%、2.56%、3.29%，RSD均小于5.0%，滿足測試要求。

3" 結 論

本研究簡化了代可可脂巧克力中赤蘚紅色素的前處理方法，建立了快速檢測代可可脂巧克力中赤蘚紅色素的方法，樣品在酸性條件下提取，并用乙醇沉淀樣品中的蛋白質，離心后用C18反相色譜柱分離，注入高效液相色譜儀進行測定。本方法操作簡便、基質干擾小，線性關系良好，檢測靈敏度高，快速準確，可為代可可脂巧克力中赤蘚紅色素的快速檢測提供新的思路。

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Determination of Erythrosine in Cocoa Butter

Substitute Chocolate by HPLC

LIU Ying， YU Jiao-zhu， LI Qiao-lian， LIN Yang

（Shenyang Food and Drug Inspection Institute， Shenyang Liaoning 110122， China）

Abstract： A simple and rapid HPLC method for the treatment of cocoa butter substitute chocolate samples and the determination of erythrosine content in the samples was established. The samples were extracted under acidic conditions， precipitated with ethanol， and then the pH was adjusted to neutral. The samples were detected by HPLC. Under the condition of this method， erythrosine showed good linearity in the range of 0.2～10.0 mg·L^-1， the correlation coefficient was gt;0.999， the detection limit was 0.2 mg·kg^-1， the quantification limit was 0.6 mg·kg^-1. The recoveries were 90.1%～95.3% at 2.0， 10.0，50.0 mg·kg^-1， and the relative standard deviations （RSD） were 1.03%～3.29% （n=6）. The method has the advantages of simple operation， low matrix interference， high sensitivity， rapid and accurate， and can be used for the rapid detection of erythrosine pigment in cocoa butter substitute chocolates.

Key words： "HPLC; Erythrosine; Pigment; Determination