甘露糖調控GLUT1/SLIT2通路抑制三陰性乳腺癌增殖的影響及機制研究

摘要：乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤之一。目前認為，腫瘤細胞主要通過糖酵解途徑攝取葡萄糖。甘露糖對腫瘤的影響備受關注，其抗腫瘤機制與癌細胞糖代謝密切相關。文章通過體外體內實驗，觀察甘露糖對乳腺癌增殖以及GLUT1，SLIT2，ROBO1蛋白表達的影響，旨在尋求調控乳腺癌增殖的新靶點，為臨床診斷治療乳腺癌提供理論依據。研究結果表明，甘露糖可抑制三陰性乳腺癌細胞的增殖及遷移能力，其機制可能與甘露糖調控GLUT1/SLIT2/ROBO1信號軸相關。

關鍵詞：甘露糖；三陰性乳腺癌；增殖；糖代謝

中圖分類號：中圖分類號R737.9文獻標志碼：文獻標志碼A

0引言

乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤之一，嚴重影響女性生命健康［1］。代謝重新編輯是腫瘤的標記之一［2］。目前認為，腫瘤細胞主要通過糖酵解途徑使其具備更強的葡萄糖攝取能力，這種現象被稱為“Warburg效應”［3］。為此，研究腫瘤糖代謝機制將為尋找乳腺癌治療新靶點提供依據。近年來，對于單糖對腫瘤的影響越來越受到關注。已有研究表明，甘露糖可抑制癌細胞增殖，甘露糖聯合化療藥物阿霉素或順鉑可促進癌細胞凋亡，增強化療效果［4］。甘露糖的抗腫瘤作用與糖代謝密切相關，一項人群研究表明，將甘露糖混入飲食，受試者出現了葡萄糖吸收下降的癥狀［5］。通過上述研究結果，猜想甘露糖可能對乳腺癌產生類似的效果。

SLIT2/ROBO1是一對保守的配體受體，以細胞類型依賴的方式參與癌細胞增殖、凋亡、遷移和血管生成［6-7］。已有實驗證實SLIT2基因有抑瘤活性，其在乳腺癌組織中表達下調［8］。

本研究通過體外體內實驗，觀察甘露糖對乳腺癌增殖以及GLUT1，SLIT2，ROBO1蛋白表達的影響，探討甘露糖的抗腫瘤機制，旨在尋求調控乳腺癌增殖的新靶點，為臨床診斷治療乳腺癌提供理論依據。

1材料與方法

1.1實驗動物

SPF級C57BL/6雄性小鼠，6周齡，體質量20～22g。

1.2細胞株

人源乳腺癌細胞系MDA-MB-231購自中國科學院細胞庫。

1.3主要試劑

DMEM培養基（Hyclone）、胎牛血清（Gibco）、甘露糖（國藥集團化學試劑有限公司）、兔抗人SLIT2單克隆抗體（CellSignalingTechnology）、兔抗人ROBO1單克隆抗體（CellSignalingTechnology）、兔抗人單克隆抗體GLUT1（CellSignaling）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG的抗體（碧云天），MTT試劑購自美國Promega公司。

1.4MTT檢測乳腺癌細胞增殖能力

將MDA-MB-231細胞接種于96孔板中，2000細胞每孔，嚴格控制細胞數目，每個孔做3個重復，置于37℃，5%CO2培養箱培養24h，細胞融合度達30%左右用于實驗。為獲取最佳甘露糖實驗濃度，將細胞隨機分為對照組（含10%胎牛血清的普通培養基）、甘露糖組（分別為加入10mmol/L，25mmol/L，50mmol/L甘露糖培養基），于48h后加入MTT（5.0g/L）50微升每孔、置入培養箱孵育4h，加入二甲基亞砜200μL，應用酶標儀測定各孔吸光值，計算細胞存活率。酶標儀490nm波長處測定吸光度（OD）值，繪制濃度曲線，確定甘露糖臨界濃度為25mmol/L。為觀察甘露糖作用，細胞隨機分為對照組、甘露糖組，置于37℃，5%CO2培養箱培養，采用MTT法檢測各組細胞培養24h，48h，72h，96h細胞活性，并計算細胞增殖率。

1.5Transwell檢測乳腺癌細胞遷移能力

分別制備對照組和甘露糖組單細胞懸液，以1×105細胞每毫升加至24孔Transwell小室上部孔中，下部腔室中加入50μL含10%胎牛血清的培養液，在37℃，5%CO2培養箱中孵育24h后，結晶紫染色，計數遷移細胞數目，計算遷移率，遷移率（%）=（遷移細胞數/總細胞數×100%）。

1.6培養液葡萄糖消耗量測定

將MDA-MB-231細胞以6×105個每皿分別接種于10cm培養皿，過夜后更換培養液，培養24h，以穩定細胞代謝，之后換用含有25mmol/L甘露糖的低糖（該濃度更接近人體血糖水平［9］）DMEM培養基。分別于24h，48h收集上清，根據試劑盒說明測定其中葡萄糖下降量。

1.7Westernblot檢測蛋白表達水平

對照組及甘露糖組細胞提取蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳2h，轉膜1.5h，轉膜后用5%脫脂奶粉封閉1h，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST洗滌后加二抗孵育1h，GAPDH做內參。

1.8裸鼠皮下移植瘤模型建立及干預

將30只裸鼠適應性喂養1周后，取對數生長期的乳腺癌細胞MDA-MB-231，調整細胞濃度為每200微升3×106個，于每只裸鼠右腋皮下注射細胞懸液200μL。觀察腫瘤生長情況，待腫瘤體積約10mm3時，將裸鼠隨機分成兩組：正常飲食組、甘露糖（Mannose，Man）組，其中，Man組以飲用水配制20%甘露糖水溶液的方式喂養。每5天測量一次腫瘤的大小。4周后將所有小鼠安樂死，并剝離皮下腫瘤。測量每個異種移植腫瘤的體積和質量。將組織樣本固定用于進一步組織學分析。

1.9統計學處理

數據均采用均數±標準差（x±s）表示，采用SPSS19.0和GraphpadPrism6.0軟件進行數據分析，采用兩獨立樣本t檢驗。

2結果

2.1甘露糖對MDA-MB-231細胞增殖的影響

MTT結果顯示，對照組、甘露糖組（10mmol/L，25mmol/L，50mmol/L）MDA-MB-231細胞96h的OD值分別為0.872±0.012，0.791±0.028，0.514±0.011，0.312±0.006，增殖率比較有顯著差異性（Plt;0.05），如圖1A所示。在不影響細胞滲透壓的情況下，選用25mmol/L作為甘露糖實驗濃度，MTT結果顯示，對照組MDA-MB-231細胞在24h，48h，72h，96h的OD值分別為0.421±0.009，0.659±0.007，0.786±0.029，0.952±0.031，甘露糖組MDA-MB-231細胞在24h，48h，72h，96h的OD值分別為0.316±0.005，0.489±0.002，0.576±0.026，0.773±0.01。與對照組相比，甘露糖組MDA-MB-231細胞增殖率下降，差異有統計學意義（Plt;0.05），如圖1B所示。

2.2甘露糖對乳腺癌細胞遷移的影響

甘露糖組MDA-MB-231細胞在48h的遷移率為38.41%，低于對照組遷移率64.37%（Plt;0.05），如圖2所示。

2.3甘露糖對乳腺癌細胞葡萄糖攝取量的影響

測定MDA-MB-231細胞系培養基中葡萄糖消耗量，結果如表1所示，甘露糖可以降低培養液中葡萄糖的消耗量，以25mmol/L劑量為例，與對照組相比，相對葡萄糖攝取量在24h，48h分別降低了（18.01±1.67）%和（68.40±3.43）%。

2.4甘露糖對乳腺癌細胞葡萄糖轉運蛋白GLUT1表達的影響

觀察到甘露糖可以降低三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231的葡萄糖攝取量。因此，進一步探究甘露糖是否影響乳腺癌細胞中葡萄糖轉運蛋白GLUT1，SLIT2和ROBO1的表達。通過WesternBlot和免疫組化分析，發現甘露糖的存在能夠降低MDA-MB-231細胞的GLUT1表達，增加SLIT2和ROBO1的表達（Plt;0.05），如表2、圖3所示。

2.5甘露糖對乳腺癌移植瘤生長的影響

癌細胞接種3周后，30只裸鼠移植瘤長徑增至1.0cm左右（見圖4）。藥物處理后，兩組移植瘤繼續生長，其中甘露糖組生長較慢，與正常飲食組之間移植瘤生長抑制率均有顯著差異（P＜0.05）。

3討論

基于癌細胞的代謝特點與正常細胞存在明顯不同，近年來出現了一種新興的腫瘤治療方法即營養代謝療法。該方法主要是通過能量限制等方式干擾腫瘤的代謝，從而達到抑制腫瘤生長或提高抗腫瘤療效的目的［10］。

甘露糖屬于單糖，其分布廣泛，與葡萄糖在2號碳位互為差向異構體［11］，轉運載體蛋白GLUT1是甘露糖和葡萄糖的共同轉運載體。GLUT1的主要作用是將葡萄糖運輸到紅細胞中，使血糖維持在一定濃度［9］。GLUT1是葡萄糖代謝過程中的第一個限速酶［12］，其在乳腺癌細胞中的表達顯著提高［13］。因此，有研究認為GLUT1可作為腫瘤治療的一個潛在靶點，降低GLUT1的表達可抑制腫瘤細胞的增殖［14］。一項關于口腔癌的研究表明，抑制人類口腔鱗狀癌細胞的GLUT1表達后，口腔癌細胞活力及增殖能力顯著降低［15］。本研究表明，在受到甘露糖影響后，體內外實驗結果顯示，乳腺癌細胞的GLUT1表達水平均有所下調，認為甘露糖降低MDA-MB-231細胞葡萄糖攝取能力與GLUT1的調控密切相關，這也是甘露糖抑制三陰性乳腺癌細胞增殖的一個重要因素。

SLIT是由SLITs基因編碼的一組相對分子質量為（170～190）×103的分泌型蛋白質，目前已發現的家族成員有SLIT1，SLIT2以及SLIT3。其中，SLIT2是近年來發現的一個新的腫瘤抑制因子，該基因位于4P15.2［6］。SLITs主要通過Roundabout（ROBO）受體傳遞信號，進而介導個體在發育過程中與環境之間的相互作用［16］。SLIT/ROBO信號通路具有增強或減弱癌細胞增殖的作用，例如先前研究發現SLIT/ROBO信號通路在食管鱗癌［17］、乳腺癌［8］等腫瘤組織中表達下調，而在宮頸癌組織中表達升高［18］。此外，還有研究表明，SLIT2/ROBO1可以促進骨肉瘤細胞中的Warburg效應［19］。在本研究中，發現乳腺癌細胞用甘露糖處理后，SLIT2，ROBO1的表達水平升高。因此，認為甘露糖不僅影響乳腺癌細胞中GLUT1的表達水平，而且對SLIT2/ROBO1信號軸有調控作用。

本研究初步證明甘露糖通過調控GLUT1/SLIT2通路進而抑制三陰性乳腺癌細胞增殖，這將為尋找三陰性乳腺癌治療新靶點提供理論依據。

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（編輯：何琳）