基于16S rDNA測序探索食管鱗狀細胞癌患者腸道菌群特征

【摘要】 背景 食管癌是我國的高發腫瘤之一，其發病與死亡人數均為世界平均水平的2倍以上。在我國大多數食管癌發現時已是中晚期，預后較差，所以迫切需要早期診斷及干預治療，目前腸道菌群在食管癌診斷及治療中的作用備受關注。目的 探索食管鱗狀細胞癌患者腸道菌群基本特征。方法 納入2022年4—8月就診于河北醫科大學第四醫院未經任何抗腫瘤治療的食管鱗狀細胞癌患者35例作為食管癌組，健康志愿者35例作為對照組。收集兩組人群糞便標本，應用16S rDNA技術檢測腸道菌群，根據檢測結果物種注釋情況分析兩組人群腸道菌群的Alpha多樣性、Beta多樣性〔主坐標分析（PCoA）〕及菌群物種差異性〔線性判別分析及影響因子（LEfSe）分析〕。結果 兩組人群腸道菌群Alpha多樣性香農（Shannon）、辛普森（Simpson）、Chao1、ACE及Goods_coverage指數比較均無明顯差異（Pgt;0.05）；而PCoA圖顯示兩組樣本整體上相距較遠，群落結構存在差異（t=10.837，Plt;0.001）。兩組人群腸道菌群T-test檢驗結果在屬水平共有16類菌屬的豐度存在明顯差異，相對豐度較高的前8位菌屬中，食管癌組棲糞桿菌屬（Faecalibacterium）、羅斯氏菌屬（Roseburia）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）豐度低于對照組，乳桿菌屬（Lactobacillus）、羅姆布茨菌屬（Romboutsia）、瘤胃球菌屬組（Ruminococcus_torques_group）、腸桿菌屬（Intestinibacter）、土桿菌屬（Turicibacter）豐度高于對照組（Plt;0.05）。LEfSe分析結果顯示14種腸菌豐度存在差異，在屬及種水平上與對照組相比，食管癌組Faeculibacterium及普拉梭菌（Faecalibacterium-prausnitzii）豐度降低，Romboutsia及Rombutsia-ilealis豐度升高（Plt;0.05）。結論 食管鱗狀細胞癌患者具有顯著性差異腸菌，其中Faecalibacterium、Faecalibacterium-prausnitzii、Romboutsia及Rombutsia-ilealis可能是食管癌特異性改變物種，與食管癌發生密切相關。

【關鍵詞】 食管腫瘤；食管鱗狀細胞癌；腸道菌群；16S rDNA測序；Alpha多樣性；Beta多樣性；LEfSe分析

【中圖分類號】 R 735.1 R 378.2 【文獻標識碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2022.0832

【引用本文】 張玉雙，孔令洋，管佳暢，等. 基于16S rDNA測序探索食管鱗狀細胞癌患者腸道菌群特征［J］. 中國全科醫學，2023，26（20）：2496-2502. DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2022.0832.［www.chinagp.net］

ZHANG Y S，KONG L Y，GUAN J C，et al. 16S rDNA sequence analysis of the characteristics of gut flora in patients with esophageal squamous cell carcinoma［J］. Chinese General Practice，2023，26（20）：2496-2502.

16S rDNA Sequence Analysis of the Characteristics of Gut Flora in Patients with Esophageal Squamous Cell Carcinoma ZHANG Yushuang1，KONG Lingyang2，GUAN Jiachang1，LI Jianbo1，WANG Yiran2，WANG Yu2，LI Jing1，2*

1.Department of Traditional Chinese Medicine，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China

2.College of Integrated Chinese and Western Medicine，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China

*Corresponding author：LI Jing，Chief physician/Professor/Doctoral supervisor；E-mail：lijingtiger@126.com

【Abstract】 Background In China，esophageal cancer is one of the most common cancers，and its incidence and mortality are more than twice the global average. However，most esophageal cancers in China are not detected until they are at moderate and advanced stages with poor prognosis，so early diagnosis and treatment are urgently needed. At present，the role of gut flora in the diagnosis and treatment of esophageal cancer has attracted much attention. Objective To explore the basic characteristics of gut flora in patients with esophageal squamous cell carcinoma. Methods From the Fourth Hospital of Hebei Medical University from April to August 2022，35 patients with esophageal squamous cell carcinoma with no previous anti-cancer treatments were included as esophageal cancer group（EC group），and 35 healthy volunteers as control group. Stool samples of the two groups were collected to detect the gut flora using 16S rDNA sequence. Then an analysis was performed on the Alpha diversity，Beta diversity〔using the principal coordinate analysis（PCoA）〕 and differential species of gut flora 〔using the linear discriminant analysis Effect Size（LEfSe）〕 of two groups according to the species annotation of the test results. Results The Alpha diversity indices，such as Shannon index，Simpson index，Chao1 index，ACE index and Goods_coverage index demonstrated no significant differences between the two groups（Pgt;0.05），while PCoA graph showed that the Beta diversity differed significantly between the two groups on the whole，and the community structures were different（t=10.837，Plt;0.001）. T-test results showed that there were significant intergroup differences in the abundance of 16 genera at the genus level. Among the top eight genera with relatively high abundance，the abundance of Faecalibacterium，Roseburia and Citrobacter notably decreased，while that of Lactobacillus，Romboutsia，Ruminococcus_torques_group，Intestinibacter and Turicibacter notably increased in EC group（Plt;0.05）. LEfSe analysis showed that two groups had differences in the abundance of 14 different species of gut flora. The abundance of Faecalibacterium and Faecalbacterium-prausnitzii declined significantly，and that of Romboutsia and Romboutsia-ilealis increased significantly in EC group at the genus and species levels（Plt;0.05）. Conclusion Esophageal squamous cell carcinoma patients have significantly differential gut flora，among which Faecalibacterium，Faecalibacterium -prausnitzii，Romboutsia and Romboutsia-ilealis may be specific altered species of esophageal cancer，which are closely related to the occurrence of esophageal cancer.

【Key words】 Esophageal neoplasms；Esophageal squamous cell carcinoma；Gut flora；16S rDNA sequencing；Alpha diversity；Beta diversity；LEfSe analysis

食管癌發病地域性差異明顯，據最新統計我國食管癌發病與死亡病例數均占全球食管癌總發病及死亡病例數的50%以上，是世界平均水平的2倍多［1-2］，其中我國河北省磁縣、涉縣地區食管癌高發。食管鱗狀細胞癌患者在我國食管癌患者中占90%以上［3］，雖然早期行根治術后預后較好，但多數就診時已無手術機會，這使我國食管癌患者5年生存率僅為20%左右［4］，因此食管鱗狀細胞癌的早期診斷及治療具有重要意義。在長期的臨床實踐中發現大多數食管癌患者大便干燥，甚至十余日一行，這種腸道環境勢必存在菌群的改變。目前已有大量研究證實腸道菌群與結直腸癌、胃癌、肝癌等多種腫瘤密切相關，可作為診斷、治療及預后的參考評估指標［5-9］，但關于食管癌患者腸道菌群特征的研究較少。本研究旨在探索食管鱗狀細胞癌患者腸道菌群特征，期望篩選出有統計學差異的特異性腸道菌群，為食管鱗狀細胞癌的早期診斷及治療提供循證依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2022年4—8月就診于河北醫科大學第四醫院的食管鱗狀細胞癌患者35例作為食管癌組，招募同時期在醫院體檢的健康志愿者35例作為對照組。本研究已通過河北醫科大學第四醫院醫學倫理委員會審核（倫理審批號：2022KY057）。

1.2 納入、排除標準 食管癌組納入標準：（1）經組織病理學診斷為食管鱗狀細胞癌，診斷標準參照中國臨床腫瘤學會（Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO）制訂的《中國臨床腫瘤學會（CSCO）食管癌診療指南-2022》［10］；（2）年齡18～75歲；（3）無其他惡性腫瘤病史；（4）未經任何抗腫瘤治療（如手術、放化療、免疫治療等）；（5）簽署知情同意書。對照組納入標準：（1）年齡18～75歲；（2）無惡性腫瘤史；（3）簽署知情同意書。排除標準：（1）入組前2周內有感染性疾病、抗生素治療史及益生菌服用史；（2）有精神疾病或無完全民事行為能力；（3）有嚴重心血管疾病及腸道疾病等（如炎癥性腸病、腸易激綜合征等）。

1.3 臨床資料及標本收集 臨床資料收集：收集研究對象的一般資料，包括性別、年齡、飲酒史（經常飲酒：每周飲酒1次以上但達不到每天飲酒；偶爾飲酒：每周飲酒少于等于1次；從不飲酒：從來不飲酒）、吸煙史（經常吸煙：每天吸卷煙1支以上，連續或累計6個月；偶爾吸煙：每周吸卷煙超過4次，但平均每天不足1支；從未吸煙：從來不吸煙）及臨床分期（Ⅰ期：T1N0-1M0；Ⅱ期：T2N0-1M0、T3N0M0；Ⅲ期：T3N1M0、T1-3N2M0；Ⅳ期：T4N0-2M0、任何TN3M0、任何T任何NM1）［10］。標本采集：收集研究對象的新鮮糞便標本，囑受試者將糞便排泄到干凈的容器中，避免尿液、馬桶壁等對糞便樣本的污染，用無菌勺挖取排泄中后部的糞便1 g左右，放入做好標記的凍存管中，立即置于液氮中猝滅約1 min，后將凍存管放入-80 ℃冰箱保存，兩組各收集35例受試者糞便標本。

1.4 腸道菌群檢測與分析 將收集的70例糞便樣本提取基因組DNA，應用16SV34區域特異引物進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增（上游引物CCTAYGGGRBGCASCAG，下游引物GGACTACNNGGGTATCTAAT）。將磁珠純化的PCR產物根據濃度進行等量混樣，混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，然后對目的條帶用TianGen公司凝膠回收試劑盒（型號：DP214）回收純化產物。使用Illumina公司建庫試劑盒（型號：TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit）構建文庫，文庫定量檢查合格后，使用NovaSeq6000進行上機測序。通過對測序序列進行拼接，同時對序列質量進行質控和過濾，以97%的一致性將序列聚類成為分類操作單元（operational taxonomic units，OTUs），然后對OTUs序列與Silva138數據庫進行物種注釋。根據物種注釋情況，進一步分析Alpha多樣性與Beta多樣性，并進行組間差異的比較，揭示兩組群落結構的差異特征。

1.4.1 OTUs分析 基于OTUs注釋結果比較兩組樣本腸道菌群結構的差異。選擇兩組在門水平和屬水平上最大豐度排名前10的物種，繪制物種相對豐度柱形累加圖。

1.4.2 物種累積箱形圖分析 物種累積箱形圖是描述隨著樣本量的增加物種多樣性是否增加的分析，其結果反映持續抽樣下新OTUs出現的速率，主要用于判斷樣本量的選擇是否充分合理。

1.4.3 Alpha多樣性分析 Alpha多樣性主要與豐富度及多樣性有關，香農（Shannon）指數和辛普森（Simpson）指數用于描述菌群多樣性，Chao1指數和ACE指數用于描述菌群豐富度，Goods_coverage指數描述測序深度。選取以上指數分析兩組樣本物種分布的多樣性和豐富度，并直觀展示測序深度。

1.4.4 Beta多樣性分析 Beta多樣性分析是對兩組樣本菌群構成情況進行比較分析。主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）是常用的Beta多樣性分析方法，是通過一系列的特征值和特征向量排序從多維數據中提取出最主要的元素和結構。基于Unweighted Unifrac距離來進行分析，樣本間距離越遠代表樣本間群落結構差異越大。

1.4.5 線性判別分析及影響因子（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析 LEfSe分析可展現不同組中豐度有顯著差異的物種，用于分析每個物種豐度對差異效果影響的大小。

1.5 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以（x-±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以相對數表示，兩組間比較采用χ2檢驗。非參數檢驗Anosim分析用于檢驗組間差異是否大于組內，判斷研究分組是否存在意義。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基本特征 35例食管鱗狀細胞癌患者臨床分期為Ⅰ期3例、Ⅱ期6例、Ⅲ期17例、Ⅳ期9例。兩組人群性別、年齡、吸煙史、飲酒史比較，差異均無統計學意義（Pgt;0.05），見表1。

2.2 腸道菌群OUTs分析 對獲得的有效數據進行分析共得到3 602個OTUs，再對OTUs序列進行物種注釋，共有52個OTUs注釋到物種門水平（Phylum），756個OTUs注釋到物種屬水平（Genus）。門水平上兩組人群以厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）、疣微菌門（Verrucomicrobiota）為主；與對照組相比，食管癌組Bacteroidota及Actinobacteriota豐度比例升高，而Firmicutes、Verrucomicrobiota豐度比例明顯降低（圖1A）。屬水平上兩組人群以雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、大腸桿菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、棲糞桿菌屬（Faecalibacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、普雷沃菌屬（Prevotella）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、鏈球菌屬（Streptococcus）、經黏液真桿菌屬（Blautia）、艾克曼菌屬（Akkermansia）、戴阿利斯特桿菌屬（Dialister）為主；與對照組相比，食管癌組Faecalibacterium豐度比例明顯降低（圖1B）。

2.3 腸道菌群物種累積箱形圖分析 物種累積箱形圖位置趨于平緩，兩組樣本量充分，測序數據量合理，隨著樣本量的增加腸道菌群物種并不會顯著增多，見圖2。

2.4 腸道菌群Alpha多樣性分析 兩組Shannon、Simpson、Chao1、ACE、Goods_coverage指數比較，差異均無統計學意義（Pgt;0.05），見表2；Goods_coverage指數兩組測序深度均達99%以上，數據量充足。

2.5 腸道菌群Beta多樣性分析 PCoA圖結果顯示，食管癌組與對照組樣本整體上相距較遠，兩組樣本間群落結構差異較大，見圖3。食管癌組與對照組腸道菌群群落結構比較，差異有統計學意義（t=10.837，Plt;0.001）。

2.6 腸道菌群物種差異分析

2.6.1 組間與組內差異性分析 兩組腸道菌群物種差異組間大于組內，差異有統計學意義（R=0.158，Plt;0.05），見圖4。

2.6.2 屬水平腸道菌群物種差異分析 在屬水平上，兩組腸道菌群中16類菌屬的豐度比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）。兩組腸道菌群相對豐度較高的前8位菌屬中，食管癌組Faecalibacterium、羅斯氏菌屬（Roseburia）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）的豐度低于對照組，乳桿菌屬（Lactobacillus）、羅姆布茨菌屬（Romboutsia）、瘤胃球菌屬組（Ruminococcus_torques_group）、腸桿菌屬（Intestinibacter）、土桿菌屬（Turicibacter）的豐度高于對照組（Plt;0.05），見圖5。食管癌組中Lactobacillus豐度高于對照組，經詢問采樣前2周時補充過腸道益生菌者要多于對照組（食管癌組11例，對照組6例），所以本研究將乳酸桿菌作為干擾因素，不納入組間物種差異分析。

2.6.3 腸道菌群LEfSe分析 柱狀圖及進化分支圖結果顯示，兩組腸道菌群中14種腸菌的豐度比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）。其中食管癌組乳桿菌目（Lactobacillales）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）、Peptostreptococcales-Tissierellales、Romboutsia、Rombutsia-ilealis豐度高于對照組（Plt;0.05）；對照組韋榮球菌科（Veillonellaceae）、厚壁菌綱（Negativicutes）、月形單胞菌目（Veillonellales-selenomonadales）、Firmicutes、普氏棲糞桿菌（又名普拉梭菌Faecalibacterium-prausnitzii）、顫螺旋菌目（Oscillospirales）、瘤胃菌科（Ruminococcaccaceae）、Faeculibacterium豐度高于食管癌組（Plt;0.05）。在屬及種水平上與對照組相比，食管癌組中Faeculibacterium及Faecalibacterium-prausnitzii豐度降低，Romboutsia及Rombutsia-ilealis豐度升高，是具有重要鑒別意義的生物標志物（Plt;0.05），見圖6。

3 討論

正常人體腸道內約有100萬億個腸菌，總重為1～2 kg，被稱為最大共生體［11］。這些共生腸菌在人體內發揮了重要作用，如消化吸收、免疫調控、維持腸道黏膜屏障及腸道穩態等［12］。已知正常人體內腸菌在門水平上Firmicutes和Bacteroidota約占90%，Actinobacteriota、Proteobacteria和梭桿菌門（Fusobacteriota）等約占10%［13］。既往大量研究發現腸道菌群通過多種方式影響多種腫瘤的發生和發展［5-9］。

本研究結果顯示，食管癌組與對照組人群腸道菌群Alpha多樣性即菌群物種豐富度未見明顯差異，而Beta多樣性即兩組菌群群落結構存在明顯差異。兩組腸道菌群以Firmicutes、Actinobacteriota、Proteobacteria、Bacteroidota、Verrucomicrobiota為主。與對照組相比，食管癌組Bacteroidota及Actinobacteriota豐度比例升高，而Firmicutes、Verrucomicrobiota比例明顯降低。兩組人群腸道菌群T-test檢驗結果在屬水平共有16類菌屬的豐度存在明顯差異，相對豐度較高的前8位菌屬中，食管癌組Faecalibacterium、Roseburia、Citrobacter豐度低于對照組；Lactobacillus、Romboutsia、Ruminococcus_torques_group、Intestinibacter、Turicibacter豐度明顯高于對照組。LEfSe分析結果顯示14種腸菌豐度存在差異，在屬及種水平上與對照組相比，食管癌組Faeculibacterium及Faecalibacterium-prausnitzii豐度明顯降低，Romboutsia及Rombutsia-ilealis豐度明顯升高。

Faeculibacterium是本研究中表達豐度較高且變化最明顯的菌屬，可能是對食管癌發生具有重要意義的差異菌屬。有研究發現Faeculibacterium在乳腺癌患者中表達豐度明顯降低，與代謝物磷膽堿結合，可能成為乳腺癌檢測的新方法［14］。另外發表在Science上的一項研究也發現，Faeculibacterium在PD-L1治療無效的黑色素瘤患者中豐度較低，可能與上調CD8+ T淋巴細胞等免疫細胞和抗原呈遞相關分子促進抗PD-1腫瘤治療有關［15］。Faeculibacterium中最著名的Faecalibacterium-prausnitzii占正常人體糞便菌群總數的5%～15%，是人體最重要的腸菌之一，也是丁酸的重要生產者之一［16-17］。

有研究發現，與健康人群相比，在結腸癌患者糞便中Faecalibacterium-prausnitzii含量顯著降低，該研究還推測可能與其產生的丁酸鹽減少有關［18］。同時體外研究發現Faecalibacterium-prausnitzii及其培養上清液具有抑制結腸癌細胞增殖及促進凋亡等作用［19］。Faecalibacterium-prausnitzii還能夠抑制乳腺癌細胞中白介素6的分泌和Janus激酶2/信號轉導和轉錄激活因子3的磷酸化，從而抑制乳腺癌增殖和侵襲，促進其凋亡［14］。本研究Faeculibacterium及Faecalibacterium-prausnitzii的變化均與上述研究一致。

ZHANG等［20］及SEOL等［21］研究發現Romboutsia在結直腸癌及胃癌患者中豐度明顯升高，本研究結果與之一致。其分類中的Romboutsia-ilealis被認為是葡萄糖代謝的潛在惡化劑，是2型糖尿病的危險因素［22］，但與腫瘤的關系研究很少。WANG等［23］研究發現，Roseburia在結腸癌患者中大量減少，可能通過其產生的丁酸鹽阻斷核因子κB通路的活化。ZHENG等［24］發現瘤胃球菌屬（Ruminococcus）在肺癌患者腸道中含量較高。腫瘤壞死因子可以直接殺傷和抑制腫瘤細胞；IIDA等［25］研究發現Ruminococcus與腫瘤壞死因子分泌呈正相關，以上研究結果均表明腸道菌群的改變與腫瘤的發生、發展及治療密切相關。其中Ruminococcus的變化趨勢與本題組之前研究的食管癌原位模型小鼠的腸道菌群改變相同［26］，可以相互驗證。但其中部分差異菌屬不同，因為人類腸道菌群受飲食、疾病、藥物等外界影響因素較多，如以往研究表明乳酸桿菌屬于益生菌［27］，而本次研究中乳酸桿菌在食管癌患者中要高于對照組人群，這與以往研究結果不太一致，通過詢問受試者生活飲食，雖近2周未服用益生菌，但有11例食管癌患者有長期服用乳酸菌奶制品史，數量多于對照組，提示需要進一步研究證實，并在今后研究腸道菌群時要延長停用益生菌的時間。

綜上，食管鱗狀細胞癌患者與正常人群之間存在顯著性差異腸菌，其中部分特異性改變菌群可能與食管癌發生密切相關，并可能為食管癌的診斷及治療提供參考依據。本研究局限性：首先，食管鱗狀細胞癌患者均為本院就診患者，地域性單一，樣本量偏小，可能結果需要多地區大樣本的臨床研究驗證；其次，本研究應用的16S rDNA測序主要研究群落的多樣性、物種構成及其之間的進化關系，但該測序分析不是宏基因組測序，所以不能進行基因和功能等層面的深入研究；再次，目前研究只是揭示了食管鱗狀細胞癌患者與正常人群腸道菌群的變化，但并未從機制上進行深入的研究驗證；最后，對于標本采樣前抗生素、益生菌的停用時間目前無統一標準，但根據本研究結果建議應適度延長，具體時限有待進一步研究確認。

作者貢獻：李晶提出研究思路、負責文章的質量控制，對論文負責；張玉雙設計研究方案、進行文章的構思與設計，論文撰寫；張玉雙、孔令洋、管佳暢、王一然負責試驗實施、樣本收集及檢測；李建波、王瑜收集整理數據，進行統計學分析。

本文無利益沖突。

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（收稿日期：2022-11-22；修回日期：2023-01-14）

（本文編輯：康艷輝）