調節性B淋巴細胞在視神經脊髓炎譜系疾病患者外周血中的表達和意義

【摘要】 背景 調節性B淋巴細胞（Breg）是一類具有負向免疫調節作用的細胞，在多種自身免疫性疾病中表達異常，視神經脊髓炎譜系疾病（NMOSD）系自身免疫性疾病，目前關于Breg在NMOSD患者外周血中的表達和意義的研究較少。目的 研究Breg在NMOSD患者外周血中的表達和意義。方法 選取2019年6月—2021年12月新疆醫科大學第一附屬醫院神經內科收治的NMOSD患者55例作為NMOSD組，選取同期本院體檢正常的健康志愿者50例作為對照組。運用流式細胞儀檢測兩組研究對象外周血中CD19+CD24hiCD38hi Breg、CD19+CD24hiCD27+ Breg的表達。采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測和比較兩組研究對象血清中白介素10（IL-10）、白介素35（IL-35）和轉化生長因子β1（TGF-β1）的水平。結果 NMOSD組患者CD19+CD24hiCD38hi Breg、CD19+CD24hiCD27+ Breg細胞表型比例低于對照組（t=6.235、12.131，Plt;0.05）。NMOSD組患者IL-10、IL-35、TGF-β1水平均低于對照組（t=4.249、7.316、2.057，Plt;0.05）。結論 Breg及其細胞因子在NMOSD患者中表達下降，提示負性免疫調節在NMOSD疾病的發生和進展中發揮作用。

【關鍵詞】 視神經脊髓炎；視神經脊髓炎譜系疾病；B淋巴細胞，調節性；細胞因子類；免疫調節；白細胞介素類；淋巴細胞表型；酶聯免疫吸附測定

【中圖分類號】 R 744.52 【文獻標識碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0031

【引用本文】 何丹，馬建華，馬娟，等. 調節性B淋巴細胞在視神經脊髓炎譜系疾病患者外周血中的表達和意義［J］. 中國全科醫學，2023，26（20）：2513-2517. DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0031.［www.chinagp.net］

HE D，MA J H，MA J，et al. Expression and significance of regulatory B-lymphocytes in peripheral blood of patients with neuromyelitis optica spectrum disorders［J］. Chinese General Practice，2023，26（20）：2513-2517.

Expression and Significance of Regulatory B-lymphocytes in Peripheral Blood of Patients with Neuromyelitis Optica Spectrum Disorders HE Dan，MA Jianhua，MA Juan，DU Lei，ZHANG Yan，HAO Chenguang*

Department of Neurology，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China

*Corresponding author：HAO Chenguang，Chief physician；E-mail：haoqiang123321@sina.com

【Abstract】 Background Regulatory B-lymphocytes（Breg）are a group of cells with negative immunoregulatory effect，which have been detected of abnormal expression in the researches of various autoimmune diseases. Neuromyelitis optica spectrum disorders（NMOSD）belong to the category of autoimmune diseases，there are few studies on the expression and significance of Breg in the peripheral blood of patients with NMOSD. Objective To explore the expression and significance of Breg in peripheral blood of patients with NMOSD. Methods A total of 55 patients with NMOSD admitted to the Department of Neurology of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University from June 2019 to December 2021 were selected as the NMOSD group，and 50 healthy volunteers in the same period were selected as the control group. The expression of CD19+CD24hiCD38hi Breg and CD19+CD24hiCD27+ Breg in peripheral blood of patients in the two groups was detected using flow cytometry，the levels of interleukin 10（IL-10），interleukin 35（IL-35）and transforming growth factor β1（TGF-β1）in the serum of patients in the two groups were compared and measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. Results The proportions of CD19+CD24hiCD38hi Breg and CD19+CD24hiCD27+ Breg cell phenotypes were lower in patients in the NMOSD group than in the control group（t=6.235，12.131，Plt;0.05）. The levels of IL-10，IL-35 and TGF-β1 were lower in patients in the NMOSD group than in the control group（t=4.249，7.316，2.057，Plt;0.05）. Conclusion The reduced expression of Breg and their cytokines in patients with NMOSD suggests a role for negative immune regulation in the development and progression of NMOSD disease.

【Key words】 Neuromyelitis optica；Neuromyelitis optica spectrum disorders；B-lymphocytes，regulatory；Cytokines；Immunomodulation；Interleukins；Lymphocyte phenotypings；Enzyme-linked immunosorbent assay

視神經脊髓炎譜系疾病（NMOSD）是近年來神經系統炎性脫髓鞘疾病領域研究和探索的重點，某發病機制主要與自身免疫介導有關，臨床癥狀多表現為長節段橫貫性脊髓炎（LETM）和視神經炎（ON）等，因該病脫髓鞘的特點導致其較高的致殘率和復發率［1］。從目前的流行病學數據來看，NMOSD好發于青壯年尤其是女性，其全球患病率為（0.5～10.0）/10萬人年，根據2020年住院登記系統的數據，中國的NMOSD發病率約為0.278/10萬人年，其中成人發病率略高為0.347/10萬人年［2］。目前發現NMOSD的發病機制主要與水通道蛋白4（AQP4）抗體有關，該抗體由外周血中的B淋巴細胞產生，可以透過血腦屏障（BBB）選擇性地與中樞部分的靶抗原AQP4結合，特別是與存在于BBB和腦-腦脊液屏障（CSF-BB）處的星形膠質細胞足突中突觸末端的AQP4結合，因此免疫調節尤其是B淋巴細胞免疫在NMOSD疾病發生和發展中發揮著重要的作用［3-4］。目前的研究提示，B淋巴細胞除了引起體液免疫反應外，部分亞群調節性B淋巴細胞（Breg）在多種不同的自身免疫性疾病中均可能存在負向的免疫調節作用，考慮與其分泌細胞因子參與炎性反應的發生有關，如白介素10（IL-10）、白介素35（IL-35）、轉化生長因子β1（TGF-β1）等［5］，探索B淋巴細胞亞群在免疫性脫髓鞘性脊髓炎的疾病中的表達和功能有助于NMOSD的機制研究。因此，本研究重點是檢測NMOSD患者的外周血中Breg亞群和其細胞因子的水平，研究其在NMOSD疾病發生過程中的作用，提高對NMOSD患者免疫機制的認識。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2019年6月—2021年12月新疆醫科大學第一附屬醫院神經內科診治的NMOSD成人住院患者55例作為NMOSD組，其中女43例、男12例；年齡為21～77歲，平均年齡為（44.9±12.7）歲，病程3 d～16年。納入標準：NMOSD患者的診斷標準參照2016年公布的《中國視神經脊髓炎譜系疾病診斷與治療指南》［6］，由兩位主治以上職稱醫師確認。排除標準：患有其他自身免疫性疾病以及其他惡性腫瘤、急性感染、器官移植術后、人類免疫缺陷病毒感染者等；入院前3個月內已經接受免疫球蛋白、大劑量糖皮質激素或嗎替麥考酚酯/利妥昔單抗/硫唑嘌呤等其他免疫調節藥物治療的患者。另選擇同時期本院體檢正常的健康志愿者50例作為對照組，其中女30例、男20例，年齡為20～70歲，平均年齡為（46.8±14.3）歲。本研究獲得新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會審批（院K201910-06），患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 流式細胞術檢測外周血中Breg計數 （1）NMOSD組患者在入院后的次日清晨空腹及對照組志愿者在空腹體檢時各取肘靜脈血70 mL置于乙二胺四乙酸（EDTA）管，分別標記為A和B。（2）首先在A中依次加入異硫氰酸熒光素（FITC）-單克隆鼠抗人CD19抗體、人藻紅蛋白（PE）-單克隆鼠抗人CD24抗體、別藻藍蛋白（APC）-單克隆鼠抗人CD38抗體，其次在B中依次加入FITC-單克隆鼠抗人CD19抗體、PE-單克隆鼠抗人CD24抗體和APC-單克隆鼠抗人CD27抗體（抗體均購自新疆華康潤博生物科技有限公司）。在室溫下混勻并避光孵育18 min。（3）加入紅細胞裂解液2 mL，室溫避光裂解5 min，然后放置于臺式離心機（上海安亭科學儀器廠，型號：EDL-80-2C），離心速度：2 000 r/min，離心時間：5 min，棄去離心管上清液，使用1 mL磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌，再次2 000 r/min速度離心5 min，棄去上清液加PBS 3 mL重懸。室溫下避光后上流式細胞儀（Becton Dickinson公司，型號：Apriall型）檢測Breg。

1.2.2 外周血清中細胞因子水平測定 （1）NMOSD組患者和對照組志愿者在空腹狀態下分別采外周靜脈血

5 mL，離心機速度：1 000 r/min，離心時間：20 min，離心半徑為10 cm，離心后分離出血清，置于-80 ℃冰箱后續待測。（2）使用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測兩組研究對象血清中IL-10、IL-35和TGF-β1細胞因子水平。嚴格按照試劑盒說明書進行實驗操作，記錄IL-10、IL-35和TGF-β1的測定值。

1.3 統計學方法 使用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以（x-±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組研究對象細胞表型比較 NMOSD組患者CD19+CD24hiCD38hi Breg、CD19+CD24hiCD27+ Breg細胞表型比例低于對照組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表1。兩組研究對象外周血CD19+CD24hiCD38hi Breg、CD19+CD24hiCD27+ Breg的表達見圖1。

2.2 兩組研究對象細胞因子水平比較 NMOSD組患者IL-10、IL-35、TGF-β1水平均低于對照組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表2。

3 討論

NMOSD是一組由自身免疫介導的中樞神經系統（CNS）炎性脫髓鞘性疾病，多數學者認為其與B淋巴細胞介導的體液免疫有關，可能的發病機制是AQP4-IgG高度聚集在CNS脊髓的灰質、中腦導水管腦室周圍等處，尤其是BBB和CSF-BB的星形膠質細胞的足突中，繼而引起了NMOSD的發病［3，7］。隨著對其發病機制的不斷深入研究發現，免疫耐受異常可能也是AQP4-IgG產生的重要因素。

既往研究表明，體液免疫中B淋巴細胞主要通過分泌抗體和抗原提呈作用來激活免疫反應從而發揮正向免疫調節作用，而近年來對于B淋巴細胞亞群研究的熱點是一類具有負性免疫調節功能的B淋巴細胞——Breg，其對維持機體的免疫耐受和穩態同樣發揮著重要作用。自20世紀90年代以來，越來越多的關于Breg與自身免疫性疾病關系的實驗和研究結果發表，逐漸揭開了這個B淋巴細胞亞群在免疫性疾病中的作用。在實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）的動物模型中，WOLF等［8］首次發現，由于遺傳性B淋巴細胞缺陷的實驗小鼠體內誘導的EAE更易發生病情惡化，而野生型小鼠卻有自愈的傾向，提示小鼠體內存在一種抑制免疫炎性反應的B淋巴細胞亞群，而隨后的研究證實，Breg參與調節炎癥免疫反應、維持/誘導調節T淋巴細胞（Treg）和預防自身免疫等病理過程［9］。

與天然Treg不同，目前的人類和動物研究模型發現，任何B淋巴細胞都可能在適當的環境刺激下分化為Breg，包括幼稚B淋巴細胞、未成熟B淋巴細胞和漿細胞等。雖然在介導炎性反應中，Breg不直接調節T淋巴細胞的增殖，但通過分泌以IL-10為主的細胞因子，對輔助T淋巴細胞（Th）1和Th17的分化進行抑制，降低樹突狀細胞（DC）的抗原提呈作用，減少其致炎因子的分泌作用，從而間接影響T淋巴細胞的增殖和分化從而發揮負向免疫調節作用［10］。

截至目前，Breg的表型尚沒有統一的標準，而在不同的疾病模型中，有多種不同的表型和交叉重疊的表型被報道和證實。盡管動物實驗發現其表型多樣，但目前研究發現與人體內負向免疫調節功能有關的Breg細胞表型主要是CD19+CD24hiCD38hi和CD19+CD24hiCD27+［10］，通過產生細胞因子抑制CD4+ T淋巴細胞增殖以及干擾素g（IFN-g）/IL-17的表達，并且CD24hiCD27+ B淋巴細胞在抑制CD4+ T淋巴細胞增殖和IFN-g/IL-17表達方面比過渡性B淋巴細胞（TBs）更有效［11］。本研究結果顯示，通過流式細胞術檢測，分析NMOSD組和對照組的Breg亞群發現，NMOSD組患者的CD19+CD24hiCD38hi Breg、CD19+CD24hiCD27+ Breg

比例均低于對照組，提示以上Breg可能也參與了NMOSD患者的疾病發生和發展進程。同樣，在其他自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡的研究中，對試驗組患者的外周血Breg表型的計數分析討論后，可見Breg的表達下降對疾病的活動度、疾病特征和進展有一定的提示意義［12］。但在LUNDQVIST等［13］的研究中，對于單純ON患者淋巴細胞表型的分析中，CD19+CD24hiCD38hi Breg較對照組更高，且CD19+CD24hiCD38hi Breg和CD19+CD24hiCD27+ Breg表達水平存在一定的差異，因此，對于免疫疾病中Breg兩種表型的有效性仍有待于進一步研究。

IL-10是一種非常經典的具有抗炎作用的細胞因子，在抑制疾病的活動、發生和預防方面均發揮作用，IL-10可降低DC在抗原提呈過程中促炎細胞的細胞因子和分子主要組織相容性復合體（MHC）Ⅰ、MHCⅡ、黏附分子等的表達［14］。近年來，在其他神經系統自身免疫性疾病（如多發性硬化、重癥肌無力、吉蘭巴雷綜合征［9，15-16］）等疾病中，均發現IL-10不同程度的介導和參與了負向免疫的炎性反應過程，同樣在本研究中，NMOSD組患者的IL-10水平較對照組下降，考慮與負向免疫調節功能下調有關。

IL-35是近年來發現的IL-12細胞因子的新家族成員，主要作用是調節T淋巴細胞的動態平衡，其可以抑制Th2和Th17的產生，抑制CD4+ T淋巴細胞的增殖和分化效應，可作用于IL-35受體激活信號傳感器和轉錄激活物（STAT）1/STAT3通路，誘導人B淋巴細胞分化為IL-10和產生IL-35的Breg，抑制自身免疫性疾病的過度炎性反應，從而發揮負向免疫調節作用［9］。本研究對兩組研究對象的IL-35水平測定后發現，與對照組相比，NMOSD組患者的IL-35水平明顯下降。上述研究結果表明在NMOSD患者中，IL-35參與了負向的免疫反應和調節。

TGF-β1及其家族成員具有多效性，其作用與細胞類型和環境有關。TGF-β參與調節B淋巴細胞發育的各個階段，在控制自身耐受和自身免疫中起著重要作用。目前已被證實在Breg的負向免疫調節中發揮重要功能，在對促進移植耐受的機制研究中發現，通過過繼轉移，能夠產生TGF-β的Breg誘導CD4+CD25 T淋巴細胞中叉頭框蛋白P3（Foxp3）的表達，促進Treg的增加，進而誘導免疫耐受［17］。B淋巴細胞中特異性缺乏TGF-β1的轉基因小鼠與野生型對照相比，EAE的發展速度加快，這與CNS中DC活化頻率的增加和致病干擾素γ（IFN-γ）+IL-17+CD4+ T淋巴細胞的增加有關，提示TGF-β+Breg對炎癥性T淋巴細胞的間接控制［18］。本研究NMOSD組患者TGF-β1水平的下降考慮與NMOSD疾病的負向免疫調節減弱有關，NMOSD患者的TGF-β1表達下降是否直接影響B淋巴細胞免疫中抗原提呈功能和具體的調節機制仍需進一步研究證實。

本研究旨在分析NMOSD患者和健康對照組的Breg的表型比例，同時使用ELISA法對其主要的細胞因子IL-10、IL-35、TGF-β1水平進行檢測，通過比較發現CD19+CD24hiCD38hi Breg、CD19+CD24hiCD27+ Breg的計數與NMOSD相關，且NMOSD組患者三種細胞因子的水平均下降，進一步說明負向免疫調節有關的細胞因子在其疾病的發生過程中發揮作用。

綜上所述，免疫系統的動態平穩是維持免疫穩定的重要因素，且當前NMOSD的發病機制仍未闡明，通過本研究發現，在NMOSD組患者中，CD19+CD24hiCD38hi Breg、CD19+CD24hiCD27+ Breg及其主要細胞因子IL-10、IL-35、TGF-β1的水平均下降，提示Breg在NMOSD的發生、發展環節中發揮了重要作用。目前自身免疫性疾病中更多的研究和診療方向在Treg。因此，發現更多的免疫靶點并進行動態的檢測和復查有望為NMOSD患者提供更多的診療方向。另外，由于本研究為單中心研究，NMOSD發病率低，因此整體樣本量較少，期待未來有多中心、大樣本或前瞻性隨機對照試驗對本研究結果進行證實及補充。

作者貢獻：何丹、馬建華、郝晨光進行文章的構思與設計；何丹進行研究的實施與可行性分析，統計學處理，結果的分析與解釋，撰寫論文并修訂論文；何丹、馬娟、張艷進行數據整理；杜磊、郝晨光負責文章的質量控制及審校；何丹、郝晨光對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。

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（收稿日期：2022-11-21；修回日期：2023-02-05）

（本文編輯：康艷輝）