前列腺小體miRNA-146a/TLR-4/NF-κB通路在EAP大鼠慢性炎癥中的作用及大火草干預的研究

【摘要】 背景 目前對慢性前列腺炎（CP）的治療未達到預期的療效，亟需尋找新的治療藥物，本課題組前期研究發現大火草〔Anemone tomentosa （Maxim.）Péi〕對CP有較好的療效，但具體作用機制還有待進一步研究。目的 探討前列腺小體源性微小RNA-146a（miRNA-146a）調控Toll樣受體4（TLR-4）/核轉錄因子κB（NF-κB）通路在自身免疫性前列腺炎（EAP）大鼠慢性炎癥中的作用及大火草干預的可能機制。方法 2021年12月—2022年6月，將42只Wistar大鼠采用隨機數字表法分正常組、模型組、大火草低劑量組、大火草中劑量組、大火草高劑量組、miRNA-146a激動劑（mimics）組、miRNA-146a抑制劑（inhibitor）組，每組6只。藥物干預后，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測前列腺小體miRNA-146a-5p mRNA，采用蛋白質印跡法檢測TLR-4、細胞內抑制性蛋白κB（IκB）、磷酸化細胞內抑制性蛋白κB（p-IκB）、腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6），酶聯免疫吸附劑測定法（ELISA）檢測炎癥因子。結果 與正常組比較，各組前列腺小體miRNA-146a-5p mRNA表達均下調（Plt;0.01）。與模型組比較，大火草中、高劑量組，miRNA-146a mimics組前列腺小體miRNA-146a-5p mRNA表達均上調（Plt;0.01）；miRNA-146a inhibitor組前列腺小體miRNA-146a-5p mRNA表達下調（Plt;0.01）。大火草和miRNA-146a mimics可以顯著降低前列腺組織TLR-4、p-IκBα、TRAF6蛋白表達（Plt;0.01）；促進前列腺組織IκBα蛋白表達上調（Plt;0.01）；降低大鼠血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）、干擾素γ（IFN-γ）水平（Plt;0.05）。大火草和miRNA-146a mimics可以減輕前列腺組織炎癥細胞浸潤，改善前列腺組織病理損傷。結論 前列腺小體源性miRNA-146a可以調節TLR-4/NF-κB通路參與EAP大鼠前列腺局部病理變化。大火草抗EAP大鼠慢性炎癥的作用機制可能與其調控前列腺小體源性miRNA-146a/TLR-4/NF-κB通路有關。

【關鍵詞】 慢性前列腺炎；前列腺小體；微小RNA-146a；Toll 樣受體4；核轉錄因子κB；大鼠；炎癥

【中圖分類號】 R 697.33 【文獻標識碼】 Ａ DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2022.0731

【引用本文】 陸良喜，史宏，黃志敏，等. 前列腺小體miRNA-146a/TLR-4/NF-κB通路在EAP大鼠慢性炎癥中的作用及大火草干預的研究［J］. 中國全科醫學，2023，26（20）：2518-2524. DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2022.0731.［www.chinagp.net］

LU L X，SHI H，HUANG Z M，et al. Role of prostasome-derived miRNA-146a in regulating TLR-4/NF-κB pathway and mechanism of action of Anemone tomentosa in treating chronic inflammation in a rat model of experimental autoimmune prostatitis［J］. Chinese General Practice，2023，26（20）：2518-2524.

Role of Prostasome-derived miRNA-146a in Regulating TLR-4/NF-κB Pathway and Mechanism of Action of Anemone Tomentosa in Treating Chronic Inflammation in a Rat Model of Experimental Autoimmune Prostatitis LU Liangxi1，SHI Hong1，HUANG Zhimin2，WANG Wenjie1，ZOU Han3，ZHANG Zhiying3，WU Jinyu2*

1.Department of Andrology，Ren'ai Branch of the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China

2.Guangxi Key Laboratory of Molecular Biology of Preventive Medicine of Traditional Chinese Medicine，First School of Clinical Medicine of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530023，China

3.Graduate School，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China

*Corresponding author：WU Jinyu，Professor / Chief physician / Doctoral supervisor；E-mail：wujinyu0109@sina.com

【Abstract】 Background It is urgently necessary to find new drugs for chronic prostatitis （CP） as desired treatment effect is still yet to be achieved. Our previous clinical study has found that Anemone tomentosa（Maxim.）Péi has a good effect on CP，but the specific mechanism of action remains to be further studied. Objective To investigate the role of prostasome-derived miRNA-146a in regulating toll-like receptor 4/nuclear factor-κB （TLR-4/NF-κB） pathway and the mechanism of action of Anemone tomentosa in treating chronic inflammation in experimental autoimmune prostatitis（EAP） rats. Methods This study was conducted between December 2021 and June 2022. Forty-two Wistar rats were equally divided into seven groups using a random number table，including normal group，model group，low-，medium- and high-dose Anemone tomentosa groups，miRNA-146a mimics and inhibitor groups. After drug intervention，miRNA-146a-5p mRNA in prostasome was detected by real-time polymerase chain reaction，and TLR-4，inhibitor of NF-κB（IκB），phosphorylation of IκB（p-IκB） and tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 （TRAF6） protein were detected by western blot，and inflammatory cytokines were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. Results Compared with normal group，the expression level of miRNA-146a-5p mRNA in prostasome was down-regulated in each of the other six groups （Plt;0.01）. Compared with model group，the expression level of miRNA-146a-5p mRNA in prostasome was up-regulated in medium- and high-dose Anemone tomentosa groups，and miRNA-146a mimics group （Plt;0.01），but was down-regulated in miRNA-146a inhibitor group（Plt;0.01）. In Anemone tomentosa and miRNA-146a mimics groups，the expression levels of TLR-4，p-IκBα and TRAF6 proteins in prostate tissues were significantly down-regulated （Plt;0.01），the expression levels of IκBα proteins in prostate tissues were significantly up-regulated （Plt;0.01），and serum levels of TNF-α，interleukin （IL）-6，IL-8 and interferon-γ were significantly down-regulated（Plt;0.05），indicating that Anemone tomentosa and miRNA-146a mimics significantly reduced the inflammatory cell infiltration and improved the pathological injury in prostate tissue. Conclusion Prostasome-derived miRNA-146a can participate in local pathological changes of prostate via regulating the activation of TLR-4/NF-κB pathway in EAP rats. The mechanism of action of Anemone tomentosa inhibiting chronic inflammation in EAP rats may be related to its regulation of prostasome-derived miRNA-146a modulating the TLR-4/NF-κB pathway.

【Key words】 Chronic prostatitis；Prostasome；miRNA-146a；TLR-4；NF-κB；Rats；Znflammation

慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征（CP/CPPS）是泌尿外科、男科常見疾病，與細菌感染沒有明確的聯系，以下尿路癥狀和慢性疼痛障礙為主要征象，占前列腺炎的90%～95%［1］。CP/CPPS涉及復雜的病理生理機制，包括隱性感染、免疫、炎癥、神經、內分泌、前列腺內尿反流、氧化應激和心理因素等，且不同因素之間經常交叉影響［2］。由于其病因不明且復雜，單模式治療在多數情況下療效不佳。因此，CP/CPPS已經過渡到多模式的治療方法，包括藥物和非藥物治療。藥物療法主要包括抗生素、α受體阻滯劑、消炎藥、植物療法等；非藥物治療包括盆底物理治療、肌筋膜觸發點釋放、針灸、心理支持、電身體沖擊波治療、局部熱療等［3］。然而，一項系統回顧和薈萃分析研究表明，現代醫學目前仍然無法明確CP/CPPS具體的發病機制，且對于CP/CPPS的管理和治療未達到預期的療效［4］。近年來，在CP/CPPS的替代療法中，以草藥或草藥提取物等形式的中草藥因其對前列腺疾病治療的積極作用而受到關注，顯示出其特色優勢［5］。本課題組前期研究發現大火草〔Anemone tomentosa （Maxim.）Péi〕能顯著改善CP患者臨床癥狀［6］、調節CP模型大鼠炎性因子水平［7］，從而發揮抗前列腺炎的作用。

人類前列腺上皮細胞分泌的前列腺小體是第一個被確定的生殖道膜性囊泡，屬于外泌體。前列腺小體的生理病理功能在前列腺疾病中發揮重要作用。基于此，本文采用自身免疫性前列腺炎（EAP）模型大鼠，探討前列腺小體來源的微小RNA-146a（miRNA-146a）/Toll樣受體4（TLR4）/核轉錄因子κB（NF-κB）通路在EAP大鼠前列腺局部慢性炎癥中的作用，并給予大火草干預治療，探討集“清熱祛濕、利尿通淋、益氣補腎”功效于一身的單味中藥治療CP/CPPS的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 研究時間 2021年12月—2022年6月。

1.1.2 實驗動物 5只4月齡SPF級Wistar雄性大鼠，體質量（400±20）g；42只8周齡清潔級Wistar雄性大

鼠，體質量（200±15）g。實驗大鼠均購自長沙市天勤生物技術有限公司（許可證號：SCXK2019-0013），飼養于廣西中醫藥防治醫學分子生物重點實驗室，保持室溫18～25 ℃，全價營養、分籠飼養。實驗通過廣西中醫藥大學倫理委員會審查（動物倫理審批號：DW20220926-202）。

1.1.3 實驗儀器與試劑 實驗儀器：透射電子顯微鏡（HITACHI，HT7800/HT7700），核酸蛋白定量儀（denovix，DS-11），電泳儀（北京六一公司，DYCZ-24DN型），半干轉膜儀系統（ATTO，WSE-4040、AE6675L），熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）儀（BIO-RAD，CFX ConnectTM），生物分光光度計（Eppendorf，BioPhotometer），光學顯微鏡（OLYMPUS，BX43），超速離心機（Hitachi，CP100MX），酶標儀（BIO-TEK，Elx800）。實驗試劑：TLR4抗體（Affinity，AF7017），腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）抗體（Affinity，AF5376），磷酸化細胞內抑制性蛋白κBα（phospho-inhibitor of NF-κBα，p-IκBα）抗體（Affinity，AF5002），細胞內抑制性蛋白κBα（inhibitor of NF-κBα，IκBα）抗體（Affinity，AF2002）；miRcute miRNA isolation kit試劑盒（天根生物科技有限公司，Cat# DP501），miRcute miRNA Detection Kit（SYBR Green）試劑盒（天根生物科技有限公司，Cat# FP411），miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（天根生物科技有限公司，Cat# KR211）；完全弗氏佐劑（Sigma-aldrich），miRNA-146a mimics（吉瑪基因），miRNA-146a inhibitor（吉瑪基因）；白介素6（IL-6）（聯科生物，EK306），白介素8（IL-8）（聯科生物，SEKR-0014），干擾素γ（IFN-γ）（聯科生物，EK380），腫瘤壞死因子α（TNF-α）（聯科生物，EK382）。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠前列腺蛋白提純液的制備［8］ 5只4月齡SPF級Wistar雄性大鼠，體質量（400±20）g，采用1%戊巴比妥鈉注射液全身麻醉，消毒后固定在超凈臺上，從下腹部逐層剪開，并暴露前列腺后將其剪下，用冷的0.9%氯化鈉溶液將剪下的前列腺組織洗凈后剪碎，加入含0.5% TritonX-100等重的0.9%氯化鈉溶液（預先高溫滅菌）制成勻漿，將勻漿液置入高速離心機中離心30 min（離心半徑10 cm，轉速15 000 r/mim），過程保持4 ℃，取上清液0.2 mL，等比稀釋后用酶標儀檢測濃度。取余下的上清液加入0.1 mol/L pH 7.2的磷酸鹽緩沖液（PBS），把蛋白提純液稀釋成60 g/L的濃度，放入冷凍管保存備用（-80 ℃）。

1.2.2 大火草煎劑制備 適量大火草置于煎煮容器內，加相當于藥材量5～8倍的冷水浸泡1 h，煮沸30 min，過濾；藥渣加3～6倍量水繼續煎煮，煮沸30 min，過濾。合并兩次煎出藥液，離心10 min（離心半徑10 cm，轉速5 000 r/min），取上清液，利用旋轉蒸發器在水浴上濃縮至含生藥量5.84 g/mL。灌胃前用蒸餾水配置濃度為1.46 g/mL，相當于人和動物間按體表面積折算的等效劑量的1倍。

1.2.3 EAP大鼠模型制備［8］ 42只8周齡雄性Wistar大鼠，采用隨機數字表法分為正常組、模型組、miRNA-146a mimics組、miRNA-146a inhibitor組、大火草低劑量組、大火草中劑量組、大火草高劑量組，每組6只。除正常組外，其他各組分別于第0、30天，在大鼠多處皮下注入大鼠前列腺蛋白提純液與弗氏完全佐劑等比混勻的混懸液1 mL，同時腹腔注射百白破疫苗0.5 mL。

前列腺組織可見大量炎癥細胞浸潤，腔內黏膜皺襞消失，腺泡破壞，間質腫脹明顯，表明模型成功［9］。

1.2.4 干預措施 造模成功后，正常組與模型組給予0.9%氯化鈉溶液4 mL·kg-1·d-1灌胃；大火草低、中、高劑量組予濃度1.46 g/mL、2.92 g/mL、5.84 g/mL大火草煎液4 mL·kg-1·d-1灌胃。給藥1次/d，連續給藥4周。miRNA-146a mimics組給予0.9%氯化鈉溶液4 mL·kg-1·d-1灌胃4周，并于實驗取材前72 h于鼠尾靜脈內注射miRNA-146a mimics 0.2 μL/g；miRNA-146a inhibitor組給予0.9%的氯化鈉溶液4 mL·kg-1·d-1灌胃4周，并于實驗取材前72 h鼠尾靜脈內注射miRNA-146a inhibitor 0.2 μL/g［10］。

1.2.5 前列腺組織病理的蘇木素 — 伊紅染液（HE）染色 手術取干預處理后大鼠前列腺組織，使用10%甲醛溶液固定好前列腺組織，石蠟包埋、切片，HE染色后，封片，在光學顯微鏡下觀察前列腺組織病理改變。

1.2.6 前列腺液中前列腺小體電鏡觀察 制備干預處理后大鼠前列腺蛋白提純液，采用超速離心法提取前列腺液中前列腺小體，超速離心過程：在37 ℃中速融樣本，將樣本移動至一個新的離心管內，4 ℃離心30 min（離心半徑8.1 cm、轉速4 700 r/min）；將上清液移至新的離心管中，4 ℃離心45 min（離心半徑8.1 cm、轉速10 000 r/min），以去除較大的囊泡；取上清液，經0.45 μm濾膜過濾，收集過濾液；將過濾液移至新的離心管中，選擇超速轉子，4 ℃超速離心70 min（離心半徑7.2 cm、轉速112 000 r/min）；去除上清，用10 mL預冷的1×PBS重懸后，選擇超速轉子，4 ℃超速離心70 min（離心半徑7.2 cm、轉速112 000 r/min）；去除上清，用100 μL預冷的1×PBS重懸，取10 μL電鏡備用，剩余外泌體于-80 ℃保存。吸取備用樣品10 μL滴加于銅網上沉淀1 min，濾紙吸去浮液；醋酸雙氧鈾10 μL滴加于銅網上沉淀1 min，濾紙吸去浮液；常溫干燥5 min后，透射電鏡下觀察。

1.2.7 前列腺小體miRNA-146a-5p mRNA表達的檢測 采用超速離心法提取大鼠前列腺小體，吸取樣品200 μL，加入等體積裂解液MZ，按照miRcute miRNA isolation kit試劑盒說明書提取總RNA，引物見表1。參照miRcute miRNA Detection Kit（SYBR Green）試劑盒說明書操作進行反轉錄（反應條件：37 ℃條件下反應60 min，37 ℃條件下反應60 min）。RT-PCR儀擴增，以U6作內參對照，采用2-△△CT法進行數據的相對定量分析。PCR反應條件：94 ℃預變性2 min，1個循環，94 ℃變性20 s，40個循環，60 ℃退火34 s，40個循環。

1.2.8 前列腺組織TLR-4、IκB、p-IκB、TRAF6蛋白表達的檢測 取50 mg大鼠前列腺組織剪碎后于液氮中研磨至細粉末狀，分裝于離心管中，加入500 μL的RIPA裂解液，提取總蛋白。按蛋白質免疫印跡法（Western Blot）操作步驟進行電泳、轉膜，并進行TLR4抗體（1∶1 000）、TRAF6抗體（1∶1 000）、p-IκBα抗體（1∶1 000）、IκBα（1∶1 200）免疫檢測，成像儀中曝光、拍照。蛋白表達量=目的蛋白灰度值/內參灰度值。

1.2.9 酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-γ水平 按照ELISA試劑盒說明書測定血清中TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-γ水平。

1.3 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件作統計分析。符合正態分布并且方差齊的計量資料以（x-±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（QR）表示，組間比較采用非參數檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠前列腺組織HE染色結果 光學顯微鏡下觀察，與正常組比較，模型組前列腺組織損傷嚴重，腺腔形狀極其不規則，變形嚴重；部分腺泡上皮細胞胞核固縮、壞死；腺泡間質出血嚴重，有輕度炎癥細胞浸潤。與模型組比較，miRNA-146a mimics組前列腺組織結構輕度損傷，腺體結構略顯紊亂；部分前列腺上皮細胞壞死、脫落；無明顯炎癥細胞浸潤。miRNA-146a inhibitor組前列腺組織結構損傷嚴重，腺體結構紊亂，腺腔區域變小，部分上皮細胞脫落至管腔；間質有大量紅細胞、少量炎癥細胞浸潤。大火草低劑量組前列腺組織結構有較明顯損傷，腺體結構紊亂，腺腔形態不規則，部分上皮細胞壞死；腺泡間質結締組織有明顯出血及中度炎癥細胞浸潤。大火草中劑量組前列腺組織有較明顯損傷，腺體結構紊亂，腺腔形態不規則、變小；腺泡間質少量炎癥細胞浸潤；大火草高劑量組前列腺組織有輕度損傷，大部分腺泡上皮細胞排列整齊，腺腔形狀規則，少量上皮細胞增生；腺泡間質有疏松的結締組織，其間有成纖維細胞等，無炎癥細胞浸潤，見圖1。

2.2 各組大鼠前列腺液中前列腺小體電鏡觀察 大鼠前列腺小體為直徑30～150 nm的膜性囊泡，電鏡下可觀察到典型的“杯盤”形態。各組大鼠前列腺液中均觀察到前列腺小體，見圖2。

2.3 各組大鼠前列腺小體miRNA-146a-5p mRNA表達的結果 結果顯示，與正常組比較，各組前列腺小體miRNA-146a-5p mRNA表達均下調，差異有統計學意義（Plt;0.01）。與模型組比較，大火草中、高劑量組，miRNA-146a mimics組前列腺小體miRNA-146a-5p mRNA表達均上調，差異有統計學意義（Plt;0.01）；miRNA-146a inhibitor組前列腺小體miRNA-146a-5p mRNA表達下調（Plt;0.01），見表2。

2.4 各組大鼠前列腺組織TLR-4、TRAF6、IκBα、p-IκBα蛋白表達的結果 研究結果提示，與正常組比較，各組前列腺組織TLR-4蛋白表達均上調，差異有統計學意義（Plt;0.05）。與模型組比較，miRNA-146a mimics組，大火草低、中、高劑量組前列腺組織TLR-4蛋白表達均降低（Plt;0.01），且大火草高劑量組降低最顯著；miRNA-146a inhibitor組升高（Plt;0.05）。與正常組比較，各組前列腺組織TRAF6蛋白表達均上調（Plt;0.01）。與模型組比較，miRNA-146a mimics組、大火草低、中、高劑量組前列腺組織TRAF6蛋白表達均降低（Plt;0.01），且大火草高劑量組降低最顯著；miRNA-146a inhibitor組TRAF6蛋白表達升高，無統計學意義（Pgt;0.05）。與正常組比較，miRNA-146a mimics組前列腺組織IκBα蛋白表達無差異（Pgt;0.05），其余各組前列腺組織IκBα蛋白表達均下調（Plt;0.05）。與模型組比較，miRNA-146a mimics組、大火草高劑量組前列腺組織IκBα蛋白表達均上調（Plt;0.01）。與正常組比較，各組前列腺組織p-IκBα蛋白表達均上調（Plt;0.01）。與模型組比較，miRNA-146a mimics組、大火草低、中、高劑量組前列腺組織p-IκBα蛋白表達均降低（Plt;0.01），且大火草高劑量組降低最顯著；miRNA-146a inhibitor組前列腺組織p-IκBα蛋白表達升高（Plt;0.01），詳見表3、圖3。

2.5 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-γ水平比較 研究結果提示，與正常組比較，各組大鼠血清TNF-α水平均升高（Plt;0.05）；與模型組比較，除miRNA-146a inhibitor組外，其余各組大鼠血清TNF-α水平均降低（Plt;0.05）。與正常組比較，除大火草高劑量組外，其余各組大鼠血清IL-6含量均升高（Plt;0.01）；與模型組比較，大火草低、中、高劑量組和miRNA-146a mimics組IL-6水平降低（Plt;0.05）。與正常組比較，除大火草高劑量組外，其余各組大鼠血清IL-8水平均升高（Plt;0.01）；與模型組比較，除miRNA-146a inhibitor組外，其余各組大鼠血清IL-8水平均降低（Plt;0.05）。與正常組比較，各組大鼠血清IFN-γ水平均升高（Plt;0.05）；與模型組比較，miRNA-146a inhibitor組IFN-γ水平升高（Plt;0.05），miRNA-146a mimics組，大火草中、高劑量組IFN-γ水平降低（Plt;0.01），見表4。

3 討論

CP/CPPS癥狀包括不同程度的慢性盆腔疼痛（如前列腺、會陰、尿道疼痛）和排尿功能障礙，可顯著影響患者的生活質量。據估計中國男性人群中CP/CPPS的患病率為8.4%～25.0%［11］，并且隨著年齡的增長其復發率上升到50%［12］。一項基于循證醫學的系統性綜述表明，可能輕微減輕CP/CPPS癥狀的主要療法是：植物療法、α-阻滯劑、消炎藥和抗生素，循證醫學證據質量中低，說明目前治療手段的療效常不滿意［13］。病因多變、機制復雜導致的高發病率、難治性、復發性，是CP/CPPS的主要特點。中草藥治療作為一種有效的替代治療方法已被廣泛應用于CP/CPPS的管理，并因其副作用小和多模態效應而引起了研究人員和臨床醫生的關注［5］。中醫學沒有明確的CP/CPPS相對應病名。醫家普遍認為本病本虛標實的病變本質，并認為其發病與“腎虛、濕熱、瘀阻”有關［14］。大火草系毛茛科銀蓮花屬多年生草本植物，主要分布于廣西、云南等地區，性味辛微苦、平，有“清熱祛濕、利尿通淋、益氣補腎”的功效［15］。大火草的功效與CP/CPPS“腎虛濕熱”的基本病機高度切合。本研究旨在解析CP/CPPS發生和發展中嶄新的分子機制，解釋大火草防治CP/CPPS的有效性和科學內涵，發掘民族醫藥治療CP/CPPS優勢，為降低該病的復發率和提高該病的治愈率提供理論支持。

miRNA是一類具有多重功能的非編碼RNA，能夠在轉錄后水平調控基因的表達。TLR選擇性識別病原相關分子模式，構成免疫系統的第一道防線，其信號通路過度激活會導致炎癥和相關免疫性疾病的發生，miRNA可以精細調節TLRs信號通路起始、終止、反應強度，參與免疫炎癥的發生發展［16］。TRAF6具有增強促炎性細胞因子基因轉錄，從而啟動炎癥級聯反應的生物作用，是TNF超家族和TLR受體超家族的重要結合蛋白［17］。TRAF6可通過激活IκB激酶，促進IκB磷酸化及其降解，從而激活NF-κB信號通路，是具有正性調節和特異性調控NF-κB信號轉導的關鍵因子［18］。已有報道證實miR-146a通過靶向TRAF6在炎癥中發揮作用。研究表明miRNA-146a通過抑制TLR-4/NF-κB通路的關鍵分子TRAF6的表達，來抑制NK-κB的轉錄活性，并降低其下游炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的釋放，最終起到抑制炎癥反應的作用［19］。楊永祥等［20］研究外泌體源性miR-146a在N9型小膠質細胞內表達升高，并通過調控TLR4信號通路中TRAF6分子的表達負反饋抑制N9型小膠質細胞介導的炎性反應，明顯降低干擾素β（IFN-β）、TNF-α、IL-1β的表達水平。

本研究探討了EAP大鼠前列腺小體源性的miRNA-146a對TLR-4/NF-κB通路的調控作用，結果表明miRNA-146a可以通過抑制TRAF6的表達，來抑制TLR-4、NK-κB的轉錄活性，抑制NF-κB過度磷酸化，并降低其下游炎癥因子IL-6、IL-8、IFN-γ和TNF-α的釋放，減輕前列腺局部炎癥反應。通過大火草干預后，可以促進前列腺小體源性miRNA-146a-5p mRNA的表達，從而抑制TRAF6的表達，進而抑制TLR-4/NK-κB通路活化，降低其下游炎癥因子的釋放，減輕前列腺局部炎癥反應。隨著大火草劑量濃度增加，對前列腺小體源性miRNA-146a/ TLR-4/NK-κB通路調控越顯著。本研究結果為大火草臨床治療CP/CPPS患者提供有力的科學依據。本實驗結果初步論證了前列腺小體源性miRNA-146a可以調節TLR-4/NF-κB通路活化參與EAP大鼠前列腺局部病理變化，大火草通過干預上述途徑發揮抗前列腺炎的作用。提示前列腺小體在CP/CPPS發生、發展中具有較好的潛在研究價值，可以作為未來研究的新方向。

作者貢獻：陸良喜、吳金玉、黃志敏提出研究的構思與設計，負責研究的實施推進，并進行結果的分析與解釋；陸良喜負責論文起草；史宏負責研究設計的可行性分析和實驗過程指導；陸良喜、黃志敏負責動物模型的制備、實驗指標的檢測；王文杰負責統計分析和繪制圖表；鄒涵、張知英負責數據收集和整理；陸良喜、吳金玉負責最終版本修訂，對論文負責。所有作者確認論文終稿。

本文無利益沖突。

數據可用性聲明：支撐本研究的科學數據已在中國科學院數據銀行ScienceDB公開發布，訪問地址為DOI：10.57760/sciencedb.j00150.00034，CSTR：31253.11.sciencedb.j00150. 00034.

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（收稿日期：2022-10-11；修回日期：2022-12-02）

（本文編輯：徐真）