牛乳質量檢測方法的研究進展及其對乳品安全的意義

王歆遠，劉 燕，布日額

（內蒙古民族大學 生命科學與食品學院，內蒙古通遼 028000）

牛乳質量檢測與人類健康及疾病防控有著密切的關系，為了讓民眾喝上“安全奶”“放心奶”，乳品企業及衛生部門要對乳品的新鮮度、營養成分、致病菌污染情況進行全面檢測。感官檢測適合對乳品的新鮮度和被接受度進行初步判斷，后續可以通過對其理化指標的檢測來分析乳品營養成分的含量是否存在異常，以及通過微生物檢測手段來判斷乳源是否被致病菌感染[1]。

1 感官指標檢測

感官評定是牛乳質量評估最簡單的方式，是將乳品通過評價者的視覺、嗅覺和味覺來對乳品的色、香、味、質地等指標作出評判并進行分析和解釋[2]。主要通過看、聞、嘗3 個步驟進行感官指標檢測[3]，可以直觀地反映出牛乳的新鮮程度和是否變質。

（1） 看。品質正常的牛乳顏色呈乳白色或微黃色，牛乳中不應出現沉淀物或絮狀物，不應有凝塊產生[4]，通過觀察乳品的顏色、流體狀態可以判斷出乳品是否變質。

（2） 聞。由于牛乳中脂肪酸的揮發，牛乳聞起來會有一種濃郁的奶香氣。如果牛乳中有令人不悅的異味產生，說明其中的脂肪酸發生氧化，產生過氧化物，則認為牛乳發生了酸敗現象。

（3） 嘗。牛乳中乳糖的存在會讓人喝起來有淡淡的甜味，牛乳中脂類物質可以使牛乳有順滑、濃郁的感覺。如果品嘗出酸或苦等異味，則說明牛乳已經變質。

2 牛乳理化指標檢測

理化檢驗技術是牛乳質量檢測最常使用的技術手段。理化指標檢測通過分析乳品的物理特性或化學成分，能夠得到其中各項營養成分的含量及實時變化情況，具有準確性高、說服力強的優點[5]。理化指標檢測可以實現對牛乳新鮮度的檢測，以及其中某一項營養成分，如蛋白質、脂肪含量的檢測和牛乳中多種營養指標共同檢測。

2.1 酸度測定

通過酸度的測定可評判出牛乳的新鮮程度。當牛乳在貯存和運輸的環節中受到微生物污染時，其中含有的營養物質會被分解，牛乳中的乳糖會分解成乳酸，引起酸度的增高，稱為牛乳的酸敗現象[6]。酸度測定的方法是利用酚酞溶液作為指示劑，用氫氧化鈉標準滴定溶液（0.100 0 mol/L） 來滴定，計算滴定結束時所用氫氧化鈉溶液的體積。

2.2 相對密度、比重測定

通過對牛乳的相對密度和比重的測定，可以反映出牛乳是否存在衛生問題。牛乳的相對密度和比重是通過密度乳稠計和比重乳稠計來測定的，當溫度為20 ℃時，單位體積牛乳的質量與溫度在4 ℃時單位體積水的質量之比則稱為牛乳的相對密度，為1.028～1.032。當溫度在15 ℃時，單位體積牛乳質量與單位體積水的質量之比稱為牛乳的比重，為1.030～1.034[1]。如果牛乳的相對密度或比重值不在正常范圍內，則可以推測為牛乳中的營養物質已經發生改變，誘發牛乳變質或者存在不良商家對牛乳摻水作假的嫌疑。

2.3 蛋白質檢測方法

蛋白質是牛乳中重要的營養物質，通常情況下牛乳的蛋白質含量越多，代表著牛乳品質越好[7]，在牛乳的生產貯存過程中，蛋白質含量的變化情況也可以反映出牛乳質量的變化，當蛋白質含量降低時則可能牛乳發生變質[8]。現階段，主要通過凱氏定氮法、考馬斯亮藍法和紫外分光光度法來檢測牛乳中的蛋白質含量[9]。凱氏定氮法是目前應用最廣泛的一種檢測方法，該方法發展完善，有著成熟的檢測體系和極高的準確度，不足之處是凱氏定氮法的試驗周期相對較長，對試驗環境要求較高。將經典的凱氏定氮法改良后，通過模塊式消化來進行試驗，是將牛乳進行微波消解技術處理后再測定蛋白質含量，這種改良方案提高了試驗分析效率，減少了試劑用量，且對環境較為友好[10]。紫外分光光度法也在生產實踐中廣泛應用于牛乳蛋白質含量的測定，其利用牛乳中的蛋白質與紫外光的吸收程度存在著線性關系，通過測定樣品的吸光度可以測定出蛋白質在乳品中的含量[11]。

2.4 乳脂檢測方法

如果新鮮牛乳發生變質，則乳品總脂肪的含量會呈下降趨勢[12]。在乳脂檢測方法中，羅茲- 哥特里法被廣泛應用，該方法有著技術成熟、發展完善、準確度高的優點，缺點是試驗操作時間長且復雜，易產生污染[13]。相對于傳統方法，伊尼霍夫堿法來檢測牛乳中的脂肪含量可以實現試驗周期大幅縮短、操作更為簡便等優點，也被逐漸推廣[14]。除以上2 種方法外，對牛乳中脂肪含量的檢測還會使用核磁共振定量氫譜技術、巴勃科克氏法、蓋勃氏法等[15]。

2.5 乳糖檢測方法

乳糖含量在牛乳儲存周期中的變化規律與牛乳變質不存在特定性的關系[8]。但在乳品質量檢測時也應作為必不可少的一項營養指標。乳糖可以長時間滯留在人的腸道內，需要自身產生的乳糖酶分解，乳糖酶缺乏的人群會產生乳糖不耐受癥，消費者可以從此項指標對牛乳進行甄別。對于牛乳中乳糖含量的測定，目前普遍采用蒽酮比色法和萊茵- 埃農氏法[16]。

2.6 低場核磁共振技術

低場核磁共振（NMR） 是一種對乳品質量檢測的新興技術手段，適用于對牛乳的多項營養物質含量進行檢測，原理是通過牛乳在恒定磁場強度小于0.5 T 時所產生的核磁共振現象對其營養成分進行分析。低場核磁共振技術一般用來檢測乳制品中蛋白質和脂肪的含量、水分子的遷移率及乳制品的保水能力等理化指標。在測定牛乳中蛋白質含量時，該方法有著極高的準確度，現階段廣泛應用于乳蛋白的快速檢測[17]。利用雙高斯公式擬合低場核磁共振測定得到的乳脂肪液相信號，也可以得出乳品中脂類物質的含量評判牛乳的品質[18]。

2.7 近紅外光譜分析法

近紅外光譜分析法（NIR） 是近年來新興的綠色檢測技術，可以實現對乳品中的脂肪、蛋白質和乳糖三大營養成分的共同檢測分析。在現階段牛乳質量檢測技術中具有十足的發展潛力[19]。其原理是通過乳品中不同營養物質的含氫基團對不同頻率的紅外光進行選擇性吸收來進行不同營養物質的動態監測。運用近紅外光譜系統在線監控乳品中脂類含量的變化的技術已經被廣泛使用[20]。也可以將近紅外光譜分析技術結合偏最小二乘方法分析后形成的光譜數據信息，能夠構建出牛乳中脂肪、蛋白質和乳糖含量之間的校正模型[21]，該模型可以分析出3 類營養物質含量的變化趨勢。另外，近紅外分析技術還可以對牛乳中的體細胞數進行檢測[22]，當牛乳的體細胞過高時可能會引起風味欠佳、品質下降，乳品被污染等。

3 牛乳微生物指標檢測

由于奶源致病菌防控關系到公共衛生安全，近年來各項技術速發展，檢測技術可分為常規細菌鑒定技術、免疫學檢測技術、基因檢測技術和全基因組測序技術[23]。對一些致病菌的檢出結果和檢出率，各國衛生部門都已做出了明確規定。大部分國家的法規中，乳制品不得檢測出彎曲桿菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌及產氣夾膜梭菌，對于乳品中存在少量的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌，衛生部門對其檢出率也有著明確的限量標準[24-25]。

3.1 常規細菌鑒定技術

常規細菌鑒定技術是檢測細菌最基本的技術，其包括細菌分離培養、菌落特征觀察、顯微鏡下觀察及生化試驗等。該方法優點是結果客觀、準確，其不足是耗時、費力，至少48 h 才能獲得結果，不適合對乳品的快速檢測[23]。

3.2 免疫學檢測技術

免疫檢測的基本原理就是抗原抗體結合反應，當抗原和抗體在體外特異性結合后會產生免疫現象。在牛乳制品的免疫學檢測中，可以利用牛乳中含有的已知抗原來檢測未知的抗體，也可使用制備好的抗體來檢測未知的抗原。對使用的抗原或抗體進行檢測都可以確認乳品是否被致病菌感染[26-27]。免疫學檢測技術在乳品中的應用主要有酶聯免疫吸附技術（ELISA）、免疫磁性分離技術、酶聯熒光免疫吸附技術（VIDAS） 等[28]。

3.2.1 血清學反應

血清學反應是最常規的免疫學技術，反應中所用抗體是血清，主要包括凝集試驗和沉淀試驗等。血清學反應可以檢測出引起牛乳腺炎疾病的主要幾種致病菌菌株[29]。凝集試驗使用的抗原為顆粒性抗原，與抗體結合后會出現顆粒性凝集現象，主要用于布魯氏桿菌和沙門氏菌等的檢驗。沉淀試驗使用的抗原是可溶性抗原，抗原與抗體結合后會產生沉淀現象，在牛乳源致病菌檢測中應用較少。

血清學反應的優勢是其操作簡便，可以直觀觀察到試驗結果；其不足之處是試驗人為影響因素較多而導致靈敏度較低，因此不適合進行大批量檢測和現場快檢。

3.2.2 抗體標記技術

抗體標記技術是將標記物與抗體分子共價結合后和所檢測的致病菌特異性結合，形成抗原抗體結合物，再利用熒光顯微鏡、酶標儀及發光免疫檢測儀對其進行定性和定量。

（1） 酶聯免疫吸附試驗。目前，應用最為廣泛的方法是間接ELISA。ELISA 法通過底物呈現的顏色反應來達到檢測目的，對于同種動物多種不同病原的檢測只需要標記一種二抗，該方法適合批量檢測。對牛乳中的沙門氏菌和黃曲霉素M1的定量檢測有著極高的靈敏度[30]。全自動酶標檢測儀和全自動洗板機在應用中的廣泛普及，ELISA 操作的標準化程度明顯提升[31]，該方法主要應用于我國內蒙古地區對奶牛乳腺炎的致病菌檢測。

（2） 膠體金免疫層析快速檢測技術。膠體金免疫層析快速檢測技術是一種新興的標記抗體快速檢測技術，因為該技術所利用的抗體為單克隆抗體，其具有高特異性，試驗結果的準確性和檢測的靈敏度也得到保障，該方法的最大優勢是操作簡便，可以在10 min 內獲得試驗結果，結果易觀察判別等，因而得到廣泛應用。在檢測時，不依賴試驗環境和試驗設備，使用組裝好的成品試劑盒就可以隨時在牧場中現場應用，對操作人員的專業性要求較低，適合于基層檢測站和養牛戶使用。我國相關研究機構已研發出“快速檢測牛乳源無乳鏈球菌的膠體金免疫層析試劑盒”“快速檢測牛乳中致病性金黃色葡萄球菌的膠體金免疫層析”“快速檢測牛乳中牛結核分枝桿菌感染早期標識物的膠體金免疫層析試劑盒”等保障牛乳源安全的快檢產品[32-33]。

3.3 基因檢測技術

3.3.1 聚合酶鏈式反應（PCR） 技術

乳樣中含有多種類的微生物，通過對細菌的特異性研究進行相應的PCR 試驗，可檢測出不同菌株，PCR 技術的廣泛應用改變了在傳統的培養技術中面對細菌多樣性一直存在著試驗準確度不高的問題。因為PCR 技術對單一細菌檢測的高特異性，該技術在實際應用中得到普遍認可[34]，我國《奶粉中阪崎腸桿菌檢測方法》中，明確要求對于乳制品中的阪崎腸桿菌的含量測定要采用PCR 技術手段來進行，目前普遍應用于嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的檢測[35]。對于其他不同致病菌，在檢測方法和檢出率上也各不相同。對于牛乳中志賀氏菌的檢測，最優方案是采用快速常規PCR 與實時定量PCR 相結合的方法[36]。乳品中的蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌也可以通過采用過濾富集菌體后PCR 技術來檢測出[37-38]。

通過PCR 技術，也可反映出乳品中細菌群落結構及體細胞總數的動態變化。對于牛乳中的金黃色葡萄球菌可以通過免疫磁球捕獲- 實時熒光PCR 法來檢測，利用該技術可以快速檢測出其含量，該方法的檢測下限為104CFU/mL[39]。后通過對16S rRNA的V3 區進行擴增，并結合實時PCR，能夠實現對牛乳中的總細菌數和特定細菌的種類進行動態監控[40]。總體來說，PCR 檢測方法最大的優勢就是特異性強、準確度高且試驗操作較為簡便，有很高的實用價值和推廣價值[41]。

3.3.2 全基因組測序技術

通過對細菌全基因組DNA 測序、拼接、組裝，可獲取全部的基因組信息[42]，從而實現了功能基因注釋及個性化分析。對分離菌株的基因功能研究、致病機制及免疫機制研究該技術的發展有著重要意義，對各地區不同情況的乳源安全問題可開展針對性研究，通過細菌生態學獲取的信息，可深入掌握所在地區致病菌種的獨立強弱及優勢基因，提出相應的應對防控措施。

4 發展牛乳質量檢測技術對乳品安全和公共衛生的意義

在我國的內蒙古地區，乳品質量檢測技術的不斷發展對當地奶牛業健康發展、保障乳品安全起到了巨大作用。有關科研機構調查結果表明，內蒙古地區牛乳安全問題主要由奶牛患有乳房炎流行病引起，其中金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、糞腸球菌和大腸埃希菌是使奶牛感染乳房炎的主要致病菌[43]。對于以上致病菌的檢測，利用生物學技術使致病菌抗原基因特異性表達，結合間接ELISA 方法可準確地在病源乳中篩查出無乳鏈球菌及金黃色葡萄球菌[44]。在基層牛乳檢測應用中，現階段研發出的快速檢測牛乳源致病菌的膠體金免疫層析試劑盒有著極高的準確度[45]。內蒙古地區的乳源檢測技術不斷發展，使我國乳品質量安全得到保障。

德國有著嚴格的乳品檢測制度，每個州都會設立一個獨立的第三方檢測機構來負責該州的乳品質量檢測工作，檢測站會定期對牧場收到的奶源進行批量檢驗，進行定級，對該牧場乳源的安全等級進行評定[46]。其工作內容主要是對牛乳的各項理化指標進行檢測，對牛奶的脂肪、蛋白質含量和菌群數量等都進行詳細的分析和監控。檢測站得出的最終數據被法律認可，具有權威性，乳品加工廠會憑借該數據選擇性地向奶農收購奶源。這樣在源頭上很大程度避免了乳品質量的安全隱患。

新西蘭的乳品產業在國民經濟中占有重要的地位，現階段該國主流的檢測手段是利用光譜儀對牛奶進行檢測分析，牛乳樣本被光譜儀射出的光掃過后，牛奶的不同成分會吸收不同波長的光，就可直觀地得到牛乳樣本的光譜信息[47]，然后由檢測人員分析牛奶的成分是否存在著營養素的缺失、致病微生物的產生及質量變化的發生等。該檢測方式一般都是在新西蘭全境的牧場中進行抽樣檢測，既可在同一標準下評估乳品質量水平，又可有效減少檢測時間和成本。

由于檢測方法眾多，在實際生產中應充分結合實際情況，選擇最適宜的檢測方法。傳統檢測方法不斷改良研究并且與新興技術結合，充分利用多元信息，將多種檢測手段聯合應用，開發出快速準確綠色的檢測技術來有效保障牛乳制品的安全將是未來研究的一個趨勢。牛乳品質檢測技術的研究發展既促進了我國乳品行業的蓬勃發展，又為公共衛生安全提供了絕對保障。