液相色譜法在測定糧食作物中真菌類毒素的應用研究

◎ 梁 輝

（海南省糧油產品質量監督檢驗站，海南 海口 570203）

糧食安全關系國計民生，糧食作物的品質和安全是保障糧食安全的關鍵環節[1]。作為真菌類微生物的有害代謝產物，真菌類毒素是糧食作物中常見的一類有害物質，嚴重威脅著人類和動物健康[2]。因此，對糧食作物中真菌類毒素的準確測定顯得尤為重要。

液相色譜法是一種基于液體為流動相的色譜技術，具有高分辨率、高靈敏度等優點。在毒素測定領域，液相色譜法已被廣泛應用于多種毒素的分析，如真菌類毒素、有機磷農藥、重金屬等[3]。真菌類毒素是一類由真菌產生的有毒代謝產物。其中，黃曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）是糧食作物中最常見的3 種真菌毒素[4-5]。本研究利用液相色譜串聯紫外和熒光檢測器，對3 種真菌類毒素進行檢測，旨在為糧食產品的檢驗檢測提供可靠依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1290 型高效液相色譜儀（配制熒光檢測器和紫外檢測器）；JOANLAB 軌道式振蕩器；SHZ-D (Ⅲ)型循環水真空泵；MS204S 型電子天平；Milli Q 超純水器；TG18G-Ⅱ型高速離心機；黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準溶液購自國家標準物質平臺；水為超純水；乙腈購自默克股份兩合公司。

1.2 樣品來源

在市場上購買所需糧食樣品。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的制備

稱取50.0 g 粉碎后糧食樣品于250 mL 磨口具塞三角瓶中，加入80% 乙腈100 mL，振蕩提取30 min（300 r·min-1）；取濾液50 mL 置離心管中（5 000 r·min-1），離心5 min。取濾液10 mL，加水40 mL，混勻，用玻璃纖維濾紙過濾，備用。

取20.0 mL 上述提取濾液，以1.5～2 mL·min-1流速緩慢通過免疫親和柱。以10 mL 水淋洗柱子2 次，棄去全部流出液，并使部分空氣通過柱體。準確加入1.0 mL 乙腈洗脫，流速控制為1～2 mL·min-1，收集全部洗脫液于樣品瓶中，氮氣吹干。用20% 乙腈溶解混勻后，過0.22 μm 濾膜，待液相色譜測定。

1.3.2 標準溶液的配置

精密量取黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準溶液適量，用色譜純乙腈稀釋制成含各標準品100 μg·mL-1的混合標準品溶液。

1.3.3 主要儀器參數

色譜條件：色譜柱選擇Diamonsil C18，250 ×4.6 mm，5 μm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；VWD 檢測器波長為220 nm；熒光檢測器激發波長305 nm，發射波長460 nm；流動相：乙腈和0.1% 乙酸溶液。洗脫程序見表1。

表1 洗脫程序表

1.3.4 標準曲線的繪制

分別用刻度管移取0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.00 mL 混合標準品溶液于20 mL 的容量瓶中，分別用乙腈溶液定容，得到一系列不同濃度的標準溶液。濃度分別為1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg·mL-1的標準曲線系列溶液。分別精密量取各標準曲線系列溶液各20 μL，在擬定的液相色譜條件下進樣分析，記錄峰面積。以真菌毒素的濃度為橫坐標，以其峰面積為縱坐標進行線性回歸，獲得標準曲線。

1.3.5 檢測限與定量限

取混合標準品溶液擬定的色譜條件下進行分析，根據分析結果逐級稀釋樣品濃度，分別測定黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測限（S/N=3）和定量限（S/N=10）。

1.3.6 加標回收率測定

稱取50.0 g 粉碎后糧食樣品于250 mL 磨口具塞三角瓶中，分別加入混合標準品溶液。照“1.3.1”進行樣品處理，并將制備好的樣品進行液相色譜測定。

1.3.7 樣品的重復性的測定

照“1.3.1”項下方法，處理樣品并測定糧食樣品中的黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量。

2 結果與分析

2.1 標準曲線、檢測限和定量限的測定結果

黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定結果見表2。在擬定的色譜條件下，黃曲霉毒素B1在1.01～50.30 μg·mL-1范圍內，線性方程為y=12 139x-2 703.2，R2=0.999 8；玉米赤霉烯酮在1.02～50.75 μg·mL-1范圍內，線性方程為y=495.28x-85.947，R2=0.999 9；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在1.02～51.15 μg·mL-1范圍內，線性方程為y=26.292x+10.985，R2=0.998 4。

表2 標準曲線數據表

2.2 樣品的加標回收率測定結果

黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的加標回收率結果見表3。結果顯示，本方法測定各添加劑的加標回收率在97.02%～101.95% 范圍內，測定結果的RSD 值均小于5%。因此，用本方法測定糧食樣品中黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇準確度良好。

表3 糧食樣品的加標回收率測定結果表

2.3 樣品的重復性測定結果

采用本方法，對“1.3.8”中加標回收率樣品連續測定6 次，測定結果見表4。

表4 樣品的重復性測定結果表

從表4的測定結果看出，對同一樣品連續測定6次，黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測定結果的RSD 分別為2.93%、2.41%和2.64%，均小于5%。因此，本方法測定樣品的重復性良好。

3 結語

本研究建立了一種同時測定糧食作物中黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的液相色譜方法。通過對定量分析方法的驗證，得到以下結論：①所測定的3 種真菌毒素類化合物的線性關系良好，R2均大于0.990。②3 種真菌毒素中，檢測限濃度最高為0.31 μg·mL-1，定量限濃度最高為0.93 μg·mL-1，表明該方法靈敏度較高。③本方法測定黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的加標回收率為97.02%～101.95%，測定結果的RSD 值均小于5%。④對同一樣品連續測定6 次，黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測定結果的RSD 分別為2.93%、2.41%和2.64%，均小于5%，表明該方法測定樣品的重復性良好。綜上所述，本研究結果能夠為糧食產品提供更好的安全保障，對于糧食作物中真菌類毒素的檢測和控制具有重要意義。