UPLC-MS/MS 法測定軟糖中低添加量甲鈷胺含量

◎ 蔡桂珠，林岱濱，張敬鍇

（廣東億超生物科技有限公司，廣東 汕頭 515000）

目前，作為可以對人體產生治療或保健作用的維生素B12有氰鈷胺、羥鈷胺、腺苷鈷胺和甲鈷胺[1]。其中，甲鈷胺對神經組織具有良好的傳遞性，可促進核酸－蛋白－脂肪的代謝，可修復損傷了的神經組織，臨床上多用于糖尿病神經障礙、多發性神經炎等周圍神經疾病[2]。

當前，國內的甲鈷胺片中甲鈷胺添加量大部分是0.5 mg/片，2020 版《中國藥典》也針對相應的規格制定標準檢測方法[3]。

甲鈷胺在美國市場作為維生素B12缺乏癥的補充劑被廣泛使用[4-8]，國內也有報道使用HPLC 方法測定類似添加級別的軟糖產品的含量測定方法[9]。因此，開發一個可用于產品中甲鈷胺低添加量的含量測定方法，對于國內外貿出口膳食補充劑生產企業相關產品的質量控制具有參考意義。

1 方法

1.1 儀器與試藥

QTRAP 4500 超高效液相色譜-串聯質譜儀（SCIEX）、多管式渦旋混合器；甲鈷胺對照品（93.9%）（中國食品藥品檢定研究院），批號：100692- 202006；乙腈（HPLC 級）（美國默克），含量≥99.90%；甲酸（HPLC 級）（美國默克），含量≥99.90%。

1.2 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×50 mm（1.7 μm），序列號：04223208 115169；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（見表1）；柱溫：40 ℃；進樣體積：10 μL。

表1 梯度洗脫條件表

1.3 質譜條件

離子源模式：ESI，正模式，MRM；IS：5500；TEM：500；GAS1: 50；GAS2：60；離子對信息見表2。

表2 離子對信息表

1.4 供試品溶液制備

稱取1.0 g 含有甲鈷胺的軟糖于50 mL 具塞塑料離心管中，加水至20 mL，密塞置于多管式渦旋混合器，2 500 rpm 渦旋10 min。然后置于高速離心機，10 000 rpm 離心2 min。上清液經0.22 μm 濾膜過濾，收集濾液，即為供試品溶液。

1.5 標準曲線制備

準確稱取適量甲鈷胺標準品加水溶解定容，配制成濃度為0.1 mg·mL-1的甲鈷胺標準儲備溶液，棕色瓶保存。分別吸取一定體積的甲鈷胺標準儲備溶液，加水稀釋，制備一系列標準溶液，標準工作曲線溶液濃度為10、20、100、200、1 000 ng·mL-1，按上述色譜條件，采用超高效液相色譜-串聯質譜儀分析，以濃度為橫坐標，以測得峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.6 測定方法

將供試品溶液按上述色譜條件進行超高效液相色譜-串聯質譜儀測定，采用外標法通過上述標準曲線計算其濃度。

2 方法學驗證

照ICH Q2(R1)Validation of Analytical Procedures:Text and Methodology 開展方法學驗證活動。

2.1 專屬性

取甲鈷胺軟糖陰性樣品，依上述方法制備處理、檢測，測定圖譜如下所示。由圖1、圖2 可知，不存在干擾情況。因此，該色譜－質譜條件可行。

圖1 對照品圖譜圖

圖2 甲鈷胺陰性樣品圖譜圖

2.2 線性范圍與檢測限、定量限

配制甲鈷胺濃度為10、20、100、200、1 000 ng·mL-1的曲線，擬合獲得回歸方程為y=76.461x-768.11，R2=0.999 8，表示在10～1 000 ng·mL-1濃度范圍內，有良好線性。

分別取甲鈷胺軟糖陰性樣品加標，信噪比法測定，結果顯示溶液濃度為10.91 ng·mL-1時，信噪比為13.31，即在供試品稱樣量為1 g，稀釋倍數為50 mL 時，測得甲鈷胺檢出限約為0.2 μg·kg-1，定量限約為0.5 μg·kg-1。

2.3 精密度與準確度

取甲鈷胺軟糖陰性樣品，分別加入一定量的甲鈷胺標準品溶液，依上述方法制備處理、檢測，使之成為理論濃度分別約為20、100、500 ng·mL-1的樣品，每個濃度平行操作3 份，照1.2 色譜條件、1.3 質譜條件上機測定，計算各組樣品含量的RSD%（結果見表3）。

表3 測定甲鈷胺軟糖陰性樣品精密度和準確度表

試驗結果顯示，甲鈷胺軟糖陰性樣品3 個濃度水平加標準確度分別為1.7%、1.3%、1.2%，3 個濃度水平加標回收率在85.8%～98.9%，均達到可接受標準。

3 結語

實驗結果顯示，該方法在10～1 000 ng·mL-1有良好線性；在小于0.1 mg·kg-1的添加級別，精密度RSD 為1.2%～1.7%，符合RSD ≤5% 的要求；在小于0.1 mg·kg-1的添加級別，加標回收率為85.8%～98.9%，符合60%～120%的要求[10]。因此，該方法可為軟糖中較低含量的甲鈷胺測定提供參考依據。