高效液相色譜（二極管陣列檢測(cè)器）法測(cè)定河粉中米酵菌酸含量

◎ 許和強(qiáng)，魯長(zhǎng)海，曾 軍

（廣電計(jì)量檢測(cè)集團(tuán)股份有限公司，廣東 廣州 510405）

河粉形狀扁寬，是廣東、海南、廣西、福建、湖南等地區(qū)一種大眾化的特色傳統(tǒng)食品，是將米洗凈后磨成粉，加水調(diào)制成糊狀，上籠蒸制成片狀，冷卻后劃成條狀而成。米酵菌酸是由椰毒假單胞菌酵米面亞種產(chǎn)生的一種可引起食物中毒的毒素[1]。椰毒假單胞菌可利用任何有機(jī)物快速生長(zhǎng)繁殖，在溫度和濕度適宜的條件下即可產(chǎn)生大量的米酵菌酸。米酵菌酸通過抑制線粒體腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶而產(chǎn)生毒性作用，致死率高[2]。2018—2020 年，廣東省共報(bào)告發(fā)生與河粉類食品相關(guān)米酵菌酸中毒事件5 起，報(bào)告中毒病例21人，死亡9 人，病死率為42.9%。其中，2018 年報(bào)告事件2 起，發(fā)病8 人，死亡5 人；2020 年報(bào)告事件3 起，發(fā)病13 人，死亡4 人，另有1 人放棄治療出院后因家屬拒絕聯(lián)系而失訪，預(yù)后不明[3]。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，米酵菌酸食入后經(jīng)消化道吸收、經(jīng)血液散布全身后可損傷人的肝臟、腦、腎及心臟等器官[4]，嚴(yán)重可致死亡。美國(guó)《食品毒理學(xué)》報(bào)道，米酵菌酸的人體致死劑量為1～1.5 mg[5]，即一個(gè)體重60 kg 的成年人（血液總量約為4200～4800 mL），血液中米酵菌酸的含量達(dá)到200～300 μg·L-1即可達(dá)到致死劑量。結(jié)合GB 5009.189—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中米酵菌酸的測(cè)定》[6]，該標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍為銀耳及其制品、發(fā)酵米面及其制品，未包含引起本次事件的食品基質(zhì)（河粉）。基于此，本研究針對(duì)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)和河粉生產(chǎn)行業(yè)的實(shí)際情況，建立了河粉中米酵菌酸殘留量的檢測(cè)方法，旨在有效降低檢驗(yàn)檢測(cè)設(shè)備成本，提升河粉生產(chǎn)企業(yè)自檢/送檢意愿，進(jìn)一步杜絕類似事件發(fā)生，進(jìn)而為河粉行業(yè)提供有效把控食品安全的方法和經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備和試劑

1.1.1 儀器設(shè)備

沃特世Waters 2695 高效液相色譜儀-二極管陣列檢測(cè)器；色譜柱：Waters Symmetry C18 250×4.6 mm，5 μm；分析天平：千分之一天平；超聲波振蕩器；恒溫水浴鍋；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；固相萃取裝置；氮吹儀；渦旋振蕩器。

1.1.2 試劑材料

固相萃取柱：陰離子交換柱（60 mg/3 mL）（Waters）；甲醇（CH3OH）：色譜純；氨水（NH3·H2O）；甲酸（CH2O2）；甲醇-氨水溶液：準(zhǔn)確吸取80 mL 甲醇于100 mL 容量瓶中，然后加入1.0 mL 氨水，再用一級(jí)水定容至100 mL，混勻；甲酸-甲醇溶液（2%）：準(zhǔn)確量取2.0 mL甲酸于100 mL 容量瓶中，再用甲醇稀釋，并定容至100 mL；實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)水。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品

米酵菌酸（C28H38O7，CAS 號(hào)：11076-19-0）：純度≥95%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：①米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（濃度0.1 mg·mL-1）。準(zhǔn)確稱取米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)品1.00 mg（精確至0.01 mg），隨后用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，用甲醇定容。②米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)工作液。按照濃度分別吸取米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋定容至10 mL 容量瓶中，分別配制成米酵菌酸濃度為0.3、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，即配即用。

1.2 使用方法

1.2.1 樣品前處理

鮮（濕）試樣經(jīng)剪碎、勻漿后，稱取樣品5 g 于50 mL 離心管中，加入30 mL 甲醇－氨水溶液。混勻，置于超聲波振蕩器中超聲提取1 h，過濾。合并濾液，取濾液30 mL，將濾液全部轉(zhuǎn)移到已活化的陰離子固相萃取交換柱中，并依次用5 mL 水和5 mL 甲醇進(jìn)行淋洗，流出液倒入廢液桶，真空抽干萃取柱，再用6 mL 甲酸-甲醇溶液（2%）進(jìn)行洗脫。接著，收集洗脫液，將洗脫液置于（40±0.5）℃水浴中用氮?dú)獯蹈桑缓蠹尤?.0 mL 甲醇，渦旋溶解，混勻，使用有機(jī)濾膜（0.45 μ 微孔）過濾后進(jìn)行高效液相色譜分析，同時(shí)做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 方法條件

流動(dòng)相條件：甲醇75+水25，用甲酸將pH 調(diào)至2.5；設(shè)定流速：1.0 mL·min-1；設(shè)置柱溫：30 ℃；檢測(cè)光譜波長(zhǎng)：267 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

標(biāo)準(zhǔn)品譜圖見圖1。

圖1 米酵菌酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液圖（濃度0.500 μg·mL-1）

2 結(jié)果與分析

用河粉樣品進(jìn)行定量限：0.15 μg·g-1濃度水平進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1，譜圖見圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在河粉基質(zhì)加標(biāo)中定量限濃度水平基本滿足信噪比要求（≥10），目標(biāo)物出峰處前后干擾小，較好的滿足定量要求。

表1 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

圖2 樣品加標(biāo)譜圖

采用平行加標(biāo)（n=6）進(jìn)行回收率及精密度實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，平均加標(biāo)回收為104%，RSD 為3.7%，說明實(shí)驗(yàn)方法比較準(zhǔn)確且精密度較好。

表2 加標(biāo)回收及精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

3 結(jié)語

綜上所述，本方法使用甲酸-甲醇溶液（2%）萃取洗脫凈化，在該色譜條件下，進(jìn)行了加標(biāo)回收測(cè)試和實(shí)際樣品檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法不僅可以較好地完成河粉中米酵菌酸含量的萃取和測(cè)定，方法可靠、精密度良好，而且可以在不需要昂貴檢測(cè)設(shè)備的情況下，滿足檢測(cè)要求，能夠?yàn)楹臃鄣让字破飞a(chǎn)經(jīng)營(yíng)企業(yè)，提供較便利的檢測(cè)方式。