秦皇島地區克氏原螯蝦源嗜水氣單胞菌分離及生物學特征分析

蘇蒙蒙　王璐　趙興旺　韓業越　張艷英

摘 要：為鑒定引起克氏原螯蝦死亡的病原菌及分析其生物學特征，從秦皇島地區病死的疑似細菌感染的克氏原螯蝦的肝臟和胰腺分離出1株病原菌，暫定名為ProcQHD。經細菌分離鑒定和16S rRNA基因序列分析，該菌株被鑒定為嗜水氣單胞菌。通過人工感染動物試驗、PCR法及K-B藥敏紙片對其致病性、毒力基因、耐藥基因及耐藥性進行了研究。結果表明，ProcQHD株的LD50為1.0×105 CFU/mL，攜帶ser、 act、 exu、 lip和Luxs 5種毒力基因；ProcQHD株對替米考星、頭孢曲松、環丙沙星、土霉素、諾氟沙星等12種藥物高度敏感且攜帶Tet（A）、 Tet（C）、 Tet（E）、 qepA、 gyrB、 aac4、 aadB、 Ant-Ia、 Sul-1、 LAP-1、 SHV 11種耐藥基因。分析發現ProcQHD株的某些耐藥表型與耐藥基因之間有一定相關性。

關鍵詞：克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）；嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）；致病性；毒力基因；耐藥性；耐藥基因

中圖分類號：S968.22

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），又名小龍蝦，屬于原螯蝦屬，原產于美洲大陸的美國南部及墨西哥北部，20世紀30年代引入中國，主要飼養于長江中下游地區，成為了我國水產養殖中重要的經濟動物[1-2]。克氏原螯蝦病害高發期是每年的4—6月份，臨床中以細菌性疾病為主，感染率和死亡率均較高，嚴重影響克氏原螯蝦養殖業的發展[3]。目前，我國所報道的引起克氏原螯蝦大規模發病的病原菌主要有嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和弗氏檸檬酸桿菌（Citrobcter freundii）等[4]。

嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）屬于弧菌科氣單胞菌屬，主要分布于自然水體、土壤及魚體內，可以感染不同種類的魚類、鳥類、爬行類及兩棲類動物，主要引起腸炎、皮膚病、敗血癥等疾病[5-6]。A. hydrophila也可通過食物感染人類，引起人的腹瀉、腸炎，嚴重者會導致敗血癥等，是一種人-畜-水生動物共患病原菌[7]。嗜水氣單胞菌還是一種重要的食品病原，目前已有報道從動植物食品中可以分離到嗜水氣單胞菌，如蔬菜、肉類制品、奶制品等均有報道。因此，加強該菌的控制已刻不容緩[8]。

許多研究表明，A. hydrophila 能分泌多種毒力因子，有些毒力基因可以作為鑒別致病性嗜水氣單胞菌的標志，敲除相關的毒力基因可以降低其致病力。因此，A. hydrophila毒力基因與其致病力密切相關[7，9-10]。水產養殖動物的嗜水氣單胞菌防治以抗生素為主，由于濫用已出現嚴重的耐藥性，對水環境也造成了一定程度的污染，同時還危害人類的健康[11-12]。筆者試圖從克氏原螯蝦體中分離出單一的嗜水氣單胞菌，并對其致病性、毒力基因、耐藥性及耐藥基因等生物學特征進行分析，以期為小龍蝦嗜水氣單胞菌疾病防治及藥物合理利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

秦皇島昌黎縣某養殖基地的25 d病死克氏原螯蝦，在無菌條件下，取其肝、胰臟、腸道組織進行細菌分離鑒定。

1.2 主要試劑

RS瓊脂培養基、TSB（胰蛋白胨大豆肉湯培養基），均購自青島海博生物；細菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂凝膠回收試劑盒購自OMEGA公司；藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術開發公司；Raid ID 32E陰性鑒定試紙條購自bio-Merieuxsa公司；DL2000 Marker購自北京中科康泰生物科技有限公司；2×Taq Marker Mix購于北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3 細菌分離與培養

無菌的條件下，將病死克氏原螯蝦肝、胰臟、腸道組織接種于綿羊鮮血平板上，倒置于28 ℃恒溫培養箱中18～24 h后，挑選平板上的單個優勢菌落，在RS培養基劃板，進一步培養。24 h后挑取培養基上單個菌落接種于TSB中進行純化培養。對純化后培養得到的菌株進行革蘭氏染色，電鏡觀察。分離菌株暫定命名為ProcQHD株。

1.4 生化試驗鑒定

根據Raid ID 32E革蘭氏陰性菌生化鑒定試條的說明書，將純化培養后得到的菌株培養至菌液濃度為OD600nm≈0.5時，接種于生化鑒定試條中，并在37 ℃恒溫濕盒中培養24～48 h后，用ATB自動化微生物生化鑒定系統進行生化特性鑒定。

1.5 細菌的PCR鑒定

參考文獻[7]中報道的細菌通用16S rRNA基因序列引物5'-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3'/5'-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3'由上海生工生物工程有限公司合成。分離菌株的DNA利用細菌基因組DNA試劑盒提取，并以其為模板，進行PCR鑒定。將PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，并利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收基因片段。將目的片段16 ℃過夜連接至pMD18-T載體上，挑取陽性質粒，由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，其測序結果與GenBank中已登錄序列進行同源性比對，用BLAST軟件構建系統進化樹。

1.6 致病性試驗

將分離純化培養的菌液培養至對數期（OD600nm=0.8）時，采用10倍梯度稀釋，進行滴板計數，調整菌液濃度。將60尾健康、體重一致的克氏原螯蝦分為6組，每組10尾。1—5組每尾注射上述菌液200 μL，按組分別注射濃度為1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108 CFU/mL的菌液，第6組為對照組，注射等量無菌的1×PBS。于攻菌12 h后，連續觀察15 d，記錄每組發病及死亡情況，利用改良寇氏法計算分離菌株的LD50。

1.7 毒力基因檢測

參照文獻[13]，設計9種嗜水氣單胞菌的毒力基因引物（act、aha、exu、aer、Luxs、Lip、Hly、ompA和Ser），由上海生工生物工程有限公司合成。以提取的基因組DNA為模板。用PCR進行毒力基因檢測，回收PCR產物進測序，其測序結果與GenBank中登錄的序列用DNAStar軟件進行同源性分析。

1.8 藥敏試驗

本研究藥敏試驗參照CLSI[14]推薦的標準K-B紙片法進行操作及結果判斷。

1.9 耐藥基因的檢測

參照文獻[15]，合成β-內酰胺類、四環素類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類、大環內酯類共6類耐藥基因引物由上海生工生物工程有限公司合成。利用已提取的細菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增，回收PCR產物進測序，其測序結果與GenBank中已登錄序列用DNAStar軟件進行同源性分析。

2 結果

2.1 分離鑒定結果

疑似嗜水氣單胞菌分離菌株ProcQHD株在7%脫纖綿羊血培養基生長出：邊緣整齊、呈β型溶血樣的透明隆起菌落；在RS培養基上長出：大小一致、邊緣整齊、稍隆起的黃色圓形菌落；革蘭氏染色呈現散在或者成雙排列的兩端鈍圓的陰性桿菌（封三，圖1）；在透射電鏡下，ProcQHD株菌體呈圓桿狀，菌體表面不平整，且周生菌毛，周圍有較細長的鞭毛，一端有長鞭毛（封三，圖2）

2.2 細菌生化鑒定結果

ProcQHD株經ATB自動化微生物生化鑒定系統鑒定為嗜水氣單胞菌，相似度可達99.9%（表1），ProcQHD株的生化特性與《伯杰氏系統細菌學手冊》報道的嗜水氣單胞菌的生化特性基本上一致，ProcQHD株初步判定為嗜水氣單胞菌。

2.3 細菌PCR鑒定與測序結果

用16S rRNA通用引物對ProcQHD株進行PCR鑒定，結果顯示，ProcQHD株，擴增出大約為1 500 bp的目的基因的條帶（封三，圖3）。目的片段純化回收，送上海生工生物公司測序，測序結果與GenBank中已登錄序列比對，并用DNAstar軟件進行同源性分析，結果顯示，ProcQHD菌株與GenBank中登錄的10株嗜水氣單胞菌參考株基因序列同源性在98.9%～99.9%之間，16S r RNA系統進化樹可見與CP016989株聚為一支，親緣關系最近（封三，圖4），表明分離的ProcQHD菌株為嗜水氣單胞菌。

2.4 致病性試驗結果

健康克氏原螯蝦在腹腔注射不同濃度菌懸液后，于攻毒的3～4 d，出現發病，剖檢死亡的克氏原螯蝦肝臟、腸道，出現嚴重的出血，且采集病料組織分離得到了嗜水氣單胞菌，經15 d結果觀察，記錄死亡數據（表2）。利用改良寇氏法計算分離菌株的LD50為1.0×105 CFU/mL。

2.5 毒力基因PCR檢測結果

采用PCR方法檢測ProcQHD株的act、aha、exu、aer、Luxs、Lip、Hly、ompA和Ser 9種毒力基因，結果顯示，ProcQHD株攜帶ser、act、exu、lip和luxs 5種毒力基因 （圖5）。ProcQHD株攜帶ser、act、exu、lip和luxs 5種毒力基因的測序結果與GeneBank中登錄的A. hydrophila參考序列的同源性在97.4%～99.0%之間。

2.6 藥敏試驗結果

用K-B藥敏紙片測定ProcQHD株耐藥性，結果顯示，ProcQHD株對阿米卡星、卡那霉素、鏈霉素、環丙沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、土霉素、多西環素、氨芐西林、頭孢曲松、替米考星等12種藥物高敏。對復方新諾明中敏，對磺胺間甲氧嘧啶、青霉素、阿莫西林3種藥物耐藥（表3）。

2.7 耐藥基因檢測結果

采用PCR方法對四環素類、氟喹諾酮類、β-內酰胺類、氨基糖苷類、磺胺類及大環內脂類等藥物的33種耐藥基因進行檢測，結果顯示，ProcQHD株攜帶Tet（A）（344 bp）、Tet（C）（546 bp）、Tet（E）（544 bp）、qepA（570 bp）、gyrB（299 bp）、aac4（356 bp）、 aadB（412 bp）、Ant-Ia（284 bp）、Sul-1（425 bp）、LAP-1（729 bp）、SHV（843 bp） 11種耐藥基因（圖6）。其測序結果與GenBank中登錄嗜水氣單胞菌參考株基因序列同源性均＞98.0%。通過分析，ProcQHD株部分耐藥表型與攜帶耐藥基因之間有一定的相關性。

3 討論

3.1 克氏原螯蝦嗜水氣單胞菌的分離鑒定

嗜水氣單胞菌是水產動物養殖過程中常見病原菌之一，該菌為條件致病菌，當機體免疫力下降時可以引起發病，可以導致淡水魚類的細菌性出血病。對多種水產動物具有較強的致病性，感染率和死亡率均較高，成為淡水魚養殖過程中危害比較大的病原菌[16-17]。該病原菌對克氏原螯蝦也有較大的危害，感染嗜水氣單胞菌的克氏原螯蝦在發病初期無明顯癥狀，感染后期不攝食，反應遲鈍，應急能力減弱，螯足及附肢無力，解剖后可見肝，胰腺顏色淡黃，腹節背部肌肉蒼白，可造成嚴重的經濟損失[8]。本次試驗從25 d病死克氏原螯蝦體內分離得到單一的病原菌，綜合分析基本可以確定其為嗜水氣單胞菌。通過人工感染動物試驗驗證其致病性，ProcQHD株的LD50為1.0×105 CFU/mL，致病性較強，為高致病菌株。該菌可能對克氏原螯蝦存在潛在的威脅，在克氏原螯蝦養殖過程中應該主要防控該菌。

3.2 克氏原螯蝦嗜水氣單胞菌的毒力基因

嗜水氣單胞菌是多種水生動物的機會性感染的病原體，該菌的毒力基因和毒力的致病性具有多樣性，攜帶不同毒力基因，其毒力的表達與致病具有一定的相關性。氣溶素基因（aer）、溶血素基因（hly）是致病性嗜水氣單胞菌標志性毒力基因，aer屬于氣單胞菌典型的外毒素基因且具有細胞毒性和溶血性，可以與紅細胞膜表面的特殊受體結合，破壞紅細胞，常導致出血病、敗血癥等[7，10]。本次試驗研究表明ProcQHD菌株攜帶ser、act、exu、lip和Luxs 5種毒力基因，不攜帶aer、hly等毒力基因，且通過回歸動物致病性試驗，發現ProcQHD株具有很強的致病性。這說明嗜水氣單胞菌致病性可能與攜帶的毒力基因有關，一種或幾種毒力基因表達后可能會增強其致病性，也可參與侵染宿主，其致病機理有待進一步研究。

3.3 克氏原螯蝦嗜水氣單胞菌的耐藥性與耐藥基因

嗜水氣單胞菌耐藥性的產生與臨床中抗生素不合理使用及自身的耐藥質粒、耐藥基因的水平轉移等因素有關[15-16]。國內許多研究表明，嗜水氣單胞菌對臨床中常用的喹諾酮類藥、β-內酰胺類藥物等產生很強的耐藥性，耐藥菌株呈現逐年增多趨勢[17-18]。本次研究表明，ProcQHD株對常用抗生素類藥物均敏感，但對部分β-內酰胺類及磺胺類藥物仍產生了耐藥性，這與馬小榮等[8]對嗜水氣單胞菌藥敏試驗的結果相符。此現象表明ProcQHD株已對這兩類藥物產生耐藥趨勢，應減少這兩類藥物的使用。耐藥性的產生可能與感染宿主、地區及藥物使用有關。發生該病時，應該合理使用藥物，提高其治療效果。嗜水氣單胞菌對抗生素的耐藥性與其攜帶的耐藥基因有關。耐藥性隨耐藥基因的表達而增強，而在不同菌株之間耐藥性的傳播，也會誘發耐藥性的產生[18-19]。本次試驗研究表明，ProcQHD株攜帶11種耐藥基因，通過分析發現ProcQHD株部分耐藥表型與攜帶的耐藥基因之間有一定相關性，而有些相關性不大，可能是由于從克氏原螯蝦體內分離的嗜水氣單胞菌攜帶的耐藥基因在菌株中未表達或者未出現變異情況有關，其作用機理有待進一步研究。本次試驗為克氏原螯蝦養殖中嗜水氣單胞菌病的防治及合理用藥提供參考。

4 結論

本次試驗從病變的克氏原螯蝦中分離鑒定了1株嗜水氣單胞菌（ProcQHD），其攜帶ser、act、exu、lip和Luxs 5種毒力基因，對替米考星、頭孢曲松、環丙沙星、土霉素、諾氟沙星等12種藥物高度敏感且攜帶Tet（A）、Tet（C）、Tet（E）、qepA、gyrB、aac4、aadB、Ant-Ia、Sul-1、LAP-1和SHV 11種耐藥基因，其致病和耐藥機理有待進一步研究。

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Isolation and biological characteristics of Aeromonashydrophila from Procambarus clarkii

SU Mengmeng1，WANG Lu1，ZHAO Xingwang2，HAN Yeyue3，ZHANG Yanying1

（1．Hebei Normal University of Science & Technology/Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine in Hebei Province，Qinhuangdao 066004，China;2.Qianxi County Bureau of Agriculture， Animal Husbandry and Fisheries，Qianxi 064300，China;3.Qinhuangdao Aquatic Germplasm Resources Protection Zone Management Office， Qinhuangdao 066000，China）

Abstract：In order to identify the pathogenic bacteria causing the death of Procambarus clarkii and analyze its biological characteristics. A pathogen named ProcQHD was isolated from the liver and pancreas of dead P. clarkii. ProcQHD strain was identified as Aeromonas hydrophila by routine bacterial isolation， identification and 16S rRNA gene sequence analysis. The pathogenicity， virulence gene， drug resistance gene and drug resistance were detected by artificial infection animal experiment， PCR and K-B drug sensitivity test. The results showed that the LD50 of ProcQHD strain was 1.0 × 105 CFU/mL， carried five virulence genes ser， act， exu， lip and LuxS; ProcQHD strain was highly sensitive to 12 kinds of drugs， such as tilmicosin， ceftriaxone， ciprofloxacin， oxytetracycline and norfloxacin. It carried 11 kinds of resistance genes， including Tet（A）， Tet（C）， Tet（E）， qepA， gyrB， aac4， aadB， Ant-Ia， Sul-1， LAP-1， SHV， etc. There was some correlation between drug resistance phenotype and resistance gene.

Key words：Procambarus clarkii; Aeromonas hydrophila; pathogenicity; virulence gene; drug resistance; drug resistance gene

（收稿日期：2023-11-09）

基金項目：中國-阿拉伯合作項目（項目編號：SACF/KF2018004）；河北省重點研發計劃項目（項目編號：19226628D）；河北省教育廳重點項目（項目編號：ZD2019092）；河北省第三期現代農業產業技術體系河北省創新團隊建設項目海淡水養殖疫病防控及質量控制崗（HBCT2023220207）；河北省預防獸醫學重點實驗室績效后補助項目（項目編號：20567621H）;特色海產品創新團隊近海綠色碳匯綜合養殖崗（項目編號：HBCT2018170204）。

作者簡介：蘇蒙蒙（1998.3-），女，碩士研究生，研究方向：水產動物病害。E-mail：summ13633798058@163.com。

通訊作者：張艷英（1973.10-），女，博士，教授，研究方向：水產動物病害防控。E-mail：yanyzha@163.com。