低頻超聲在抗感染領域的應用現狀

閆開成 陳麗 劉曉麗 梁文馨 蔡蕓

摘要：抗菌藥物的不合理使用，導致耐藥菌感染成為影響人類健康的一大危機，雖然近些年研發了一些新型抗菌藥物，但耐藥趨勢并未逆轉，目前急需替代療法來應對這一危機。低頻超聲作為一個安全且有應用前景的物理方法，在抗感染領域的應用越來越被受到重視，與抗菌藥物聯合應用能產生協同殺菌作用，殺菌機制包括熱效應、機械效應和空化效應。本文綜述了體內外低頻超聲聯合抗菌藥物在抗浮游菌和生物被膜、促進植入物藥物釋放和臨床應用的特點，旨在對低頻超聲進一步研究和未來在抗感染領域的應用提供指導。

關鍵詞：低頻超聲；抗感染；空化效應；浮游菌；生物被膜；植入物

中圖分類號：R978.1 ?文獻標志碼：A

Application status of low-frequency ultrasound in the field of anti-infection

Yan Kaicheng1，2， Chen Li3， Liu Xiaoli4， Liang Wenxin2， and Cai Yun2

（1 Medical School of Chinese PLA， Beijing 100853; 2 Center of Medicine Clinical Research， Department of Pharmacy， Medical Supplies Center， Chinese PLA General Hospital， Beijing 100853; 3 Department of Information， Medical Supplies Center， Chinese PLA General Hospital， Beijing 100853; 4 Department of Dermatology， the First Medical Center， Chinese PLA General Hospital， Beijing 100853）

Abstract The irrational use of antibiotics has led to the infection of drug-resistant bacteria， which has become a major crisis affecting human health. Although some new antibiotics have been developed in recent years， the trend of drug resistance has not reversed. At present， there is an urgent need for alternative therapy to deal with this crisis. As a safe and promising physical method， low-frequency ultrasound has attracted more and more attention in the field of anti-infection. Combined with antibiotics， it can produce synergistic bactericidal effects. The bactericidal mechanism includes thermal effects， mechanical effects and cavitation effects. This review summarizes the characteristics of low-frequency ultrasound combined with antibiotics in anti-planktonic bacteria and biofilm， promoting implant drug release and clinical application in vivo and in vitro， in order to provide guidance for the further research of low-frequency ultrasound and its application in the field of anti-infection in the future.

Key words Low-frequency ultrasound; Anti-infection; Cavitation effect; Planktonic bacteria; Biofilm; Implants

1 ? ?背景

細菌感染仍然是人類社會面臨的主要挑戰之一，而抗菌藥物依舊是目前治療相關感染的最有效方法。但是在過去的幾十年中，由于不謹慎地使用抗菌藥物導致細菌耐藥性的流行急劇增加，耐藥菌感染仍然是人類健康的嚴重威脅[1]。在這種情況下，抗菌藥物聯合應用已成為治療耐藥菌感染的一種選擇，因為它具有廣泛的覆蓋范圍和協同效應，但也提高了藥物不良反應風險，最終導致治療失敗、抗菌藥物使用量增加以及可能加速多重耐藥菌產生[2]。生物被膜是指細菌黏附于接觸表面或形成聚集體，并顯示出對抗菌藥物和宿主防御的極端耐受性，抗菌藥物消除細菌生物被膜所需的藥量是根除浮游菌所需用量的500～5000倍，這遠遠超出了人體的承受能力[3]。因此，抗菌藥物治療通常無法完全根除生物膜，導致復發性生物被膜相關感染[4]。為了應對這些挑戰，有必要尋求一種輔助方法來協助去除細菌生物被膜和緩解細菌耐藥趨勢。

物理方法是疾病治療的一個重要輔助手段，其中低頻超聲（low frequency ultrasound，LFU）作為一個安全且有應用前景的物理方法，已經在臨床研究和診斷中應用了很多年。LFU指頻率范圍在20 kHz～1 MHz，具有長波長的聲波，這種聲波在各種組織中具有很強的穿透力，可以引起熱效應、機械效應和空化效應[5]。關于超聲治療的最早報道可以追溯到19世紀50年代，氫化可的松軟膏聯合超聲“按摩”治療手指關節炎和手滑囊炎，與單純注射氫化可的松相比療效更佳，在后來的研究中也得到了類似的結果，證實了超聲可以增強藥物的皮膚滲透性[6-7]。隨著對這些作用機制的深入研究，LFU在治療中的潛力逐漸顯現。針對多種臨床疾病進行了充分研究，包括促進組織再生、疼痛管理、神經調節、抗感染和抗癌癥治療[8]。

LFU在抗感染領域的應用也越來越受到重視，多項研究表明，LFU與抗菌藥物聯合應用能產生協同殺菌作用，可以提高抗菌藥物對浮游細菌、細菌生物被膜、真菌和其他生物體的殺菌作用[9]。因此，根據現有的體內和體外的研究數據，綜述LFU的作用機制及應用效果，旨在評估LFU協同抗菌藥物在抗感染領域的應用現狀，為未來的臨床實踐提供指導。

2 LFU的生物學機制

2.1 熱效應

一般認為，LFU的抗菌效果取決于其生物學影響，包括熱效應和非熱效應。LFU的熱效應也稱為熱療效應，當超聲波穿過組織時，組織顆粒介質界面會產生摩擦，介質吸收這些能量并將其轉化為熱能，引起生物體的某些變化[10]。LFU的熱效應與超聲參數和組織密度有關，超聲的受阻和衰減度決定了組織中產生的熱量水平，這些熱量隨后對機體的血管舒張、氧合功能和營養交換等生理現象發揮作用。當LFU強度<0.1 W/cm2主要表現為多普勒效應，而0.1和1 W/cm2之間的強度用于診斷成像[11]。當超聲強度>10 W/cm2會產生大量熱量，高強度聚焦超聲是一種新的無創治療技術，可以瞬間將靶組織加熱到60℃，導致蛋白質變性或凝固性壞死，因此，高強度聚焦超聲主要用于抗癌和消融[12]。相比之下，低頻低強度超聲（0.02至1 W/cm2）隨著時間的推移產生的熱量相對較少[13]，具體取決于頻率、波長和治療持續時間，許多研究已經驗證了低強度脈沖超聲和低強度連續超聲在組織再生、疼痛緩解、血栓形成、抗微生物、骨折愈合和骨關節炎等疾病治療中的潛在有效性，可見LFU在低強度下對抗炎、抗菌、修復和再生等有積極療效。

2.2 機械效應

機械效應是超聲波的最基本的效應，當超聲波在體液介質中產生駐波時，懸浮在介質中的微粒在機械力的作用下凝聚，發生位移，這些作用力包括空化效應、微束流和輻射力。而LFU最重要的生理效應是產生空化效應，當超聲波在機體傳播時，使組織中的液體形成微小氣泡核（空化核），這些空化核閉合時會發生一系列動態過程，包括振蕩、膨脹、收縮和崩潰。當聲壓達到一定數值時，氣泡迅速膨脹，然后突然關閉，隨后的沖擊波可以誘導周圍空化核的形成以及細胞膜和質膜的破裂。LFU的這種空化和微流特性歸因于慣性流體中微泡的連續壓縮和折射循環，引發細胞膜和質膜的局部擴展松動，從而增加營養物質的交換或促進藥物輸送[14]。

空化效應通常分為穩定型和慣性型，在低強度下，空化核圍繞平衡半徑周期性振蕩，產生輻射壓力和微束，微束可以在氣泡表面附近產生高剪切力，然后氣泡變形和破裂，影響相鄰的組織結構并使周圍的細胞或血管壁破裂。隨著頻率的降低，共振氣泡的大小和因振蕩而被迫移動的液體體積也會增加，這表明微束在低頻下可能具有更重要的作用[15]。當強度增加時，空化氣泡在負壓下迅速膨脹，在正壓下急劇收縮內爆，稱為慣性空化。在此過程中，氣泡振蕩比較劇烈，從劇烈膨脹到急劇塌陷再到瞬間破裂，慣性空化對超聲強度呈總體依賴性，超聲強度必須高于閾值強度，并且超聲頻率越高，慣性空化的閾值強度越大。Tezel等[16]發現慣性空化增強通常與空化的能量密度相關，而與強度和頻率無關。這些數據表明慣性空化在低頻超聲中起著重要作用。

LFU的生理效應受多因素影響，其效應機制也是多樣復雜的，生物學效應可能主要歸因于機械振動，因為一般在低強度下對組織和細胞水平上的熱效應很小[17]。在過去的幾十年中，LFU應用取得了重大進展，隨著對超聲生物效應的了解不斷增加，已經確定機械效應可以增強超聲化學效應，在促進藥物滲透中，LFU介導的微束流和內吞作用可能具有協同作用；在抗腫瘤和抗感染的治療中，LFU的熱效應和空化效應也是相輔相成的；多數研究發現LFU的空化作用在多種治療作用中具有主導作用[18]。

3 LFU的協同抗菌效應

3.1 對浮游菌的作用

LFU對浮游菌作用效果的相關文獻大多是體外研究，盡管有些研究表明單獨使用LFU可以降低細菌的數量[19-20]，但這樣的殺菌效果并不明顯，設定的強度也較高，容易產生熱損傷。本課題組胡杏等[21]通過體內小鼠肺炎模型，考察了LFU對小鼠肺炎克雷伯菌肺炎的作用效果，設定頻率為29.36 kHz，強度為0.25～0.3 W/cm2，發現對小鼠活體肺組織中發光肺炎克雷伯菌熒光強度無影響。因此，LFU在抗感染領域的應用主要表現為和抗菌藥物的協同作用，Pitt等[22]首次證實了LFU聯合慶大霉素對銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和葡萄球菌的協同抗菌作用，吸引了很多學者對LFU在抗感染方面的探索。LFU對浮游菌的聯合作用主要是在體外孔板中進行，容易操作和孵育，作用時間短且不易生成生物被膜（表1）。

Runyan等[23]使用70 kHz的LFU在不同強度下聯合頭孢硝噻吩作用于銅綠假單胞菌，在0.5～4.7 W/cm2范圍內，殺菌效果隨著超聲強度增強而增高，進一步研究發現LFU作用于銅綠假單胞菌時，會增大細菌的孔膜，可以使大分子的β-內酰胺酶從細胞中排出，而小分子頭孢硝噻吩更容易進入細菌內，從而殺死細菌。其他研究也證實了LFU增強了一些抗菌藥物對某些特定細菌的活性，特別是氨基糖苷類對革蘭陰性菌的活性，Zhu等[28]運用LFU介導的微泡法進一步增強了慶大霉素對大腸埃希菌的抗菌活性，透射電鏡下顯示細菌細胞膜比單用藥物組破壞更嚴重。此外，Liu等[26]發現LFU聯合左氧氟沙星或環丙沙星可增強其殺死大腸埃希菌的有效性，LFU可以激活氟喹諾酮類藥物產生活性氧，主要包括超氧自由基陰離子和羥基自由基。研究發現一些革蘭陽性菌也容易受到LFU的作用，使得病原菌對抗菌藥物更敏感，甚至能降低耐藥性，Ayan等[24]發現LFU可以增強金黃色葡萄球菌對青霉素、替考拉寧、紅霉素等多種抗生素的敏感性，對細菌的形態學和遺傳學都產生了改變。LFU聯合苯唑西林不僅減少了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的菌落數，使得細胞壁破裂，并且改變MRSA的菌落特征，包括對甲氧西林的耐藥性[25]。

除了常規抗菌藥物，LFU還可以增強新型抗菌物質對病原菌殺傷能力，比如金屬氧化物納米顆粒、生物聚合物和綠原酸[27，29-30]。

3.2 對生物被膜的作用

與浮游菌相比，生物被膜內的細菌對多種抗菌藥物表現為耐藥，耐藥性的增加是由于細菌代謝特征和基因表達的變化。除了表型變化外，生物被膜本身可能會結合或減緩抗菌藥物的運輸，從而保護內部的細菌免于接觸致死水平的抗菌藥物。大多細菌在繁殖過程中都會產生生物被膜，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌產生的生物被膜更常見、耐藥性更強。很多研究報道了LFU在體外和體內可有效增強某些抗菌藥物殺滅細菌生物膜的作用，體內模型大多為兔子和大小鼠皮下植入物模型（表2）。

Rediske等[32]報道LFU作用于家兔皮下的載有大腸埃希菌的聚乙烯圓盤，皮下在超聲作用前注射慶大霉素，治療24 h后分別測量圓盤載菌量，研究分為8個組別，分別設置了陰性對照組、陽性對照組、單用藥物組、單用LFU組以及不同強度的LFU組。在24.48 kHz頻率下，單用強度0.1 W/cm2

的LFU未見殺菌效果，而與單用藥物組相比，LFU聯合慶大霉素在0.1 W/cm2時，細菌活力未見明顯降低；在0.3 W/cm2時，細菌平均活力從2.94降低到

0.99 lgCFU/cm2；在0.6 W/cm2時，細菌平均活力從2.93降低到1.69 lgCFU/cm2，結果顯示在強度為0.3 W/cm2時聯合慶大霉素有更好的殺菌效果，這也提示并不是超聲強度越高越好，在實際應用中需要探索合適的作用強度，才可能產生更好地殺菌效果。同樣，Carmen等[34]研究了LFU聯合慶大霉素在不同強度下作用于體外大腸埃希菌和銅綠假單胞菌被膜，隨著作用強度的增加LFU顯著增加了慶大霉素穿過生物膜的量，使得慶大霉素在生物被膜下處于較高濃度。對于金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物被膜的治療主要是協同萬古霉素，LFU增強了萬古霉素在體內外對葡萄球菌生物膜的抑菌作用，特別是對于MRSA[42]，這種聯合作用更具殺菌效果，且對動物無明顯危害，其他研究也顯示多次LFU聯合抗菌藥物組合對細菌生物膜的協同作用優于單次LFU[46]。另外，人β-防御素3抗菌肽對于葡萄球菌具有殺菌效果，LFU可以通過同時促進細菌相關基因表達來增強人β-防御素3活性，從而抑制葡萄球菌耐藥基因的表達，在80 kHz時體內外都有明顯的協同殺菌作用[37-38]。LFU協同殺死有生物被膜的細菌，一是可能增加了細胞的通透性，提高了抗菌物質通過生物膜的效率；二是LFU作用后的局部溫度升高和細胞內活性氧的產生增多。

3.3 促進植入物抗菌藥物釋放

臨床植入物的的使用越來越廣范，心腦血管和骨科每年有大量的手術都涉及醫療器械植入人體，這就導致這些“外來品”容易造成局部或全身感染，并且細菌在植入物表面更易形成生物被膜。近年來，人們致力于通過制備生物相容性材料來抑制細菌及生物被膜的形成，以防止或減少生物被膜的感染。其中一種策略是在器械或材料中加入抗菌藥物，通過藥物緩慢釋放來預防植入部位的細菌感染以及生物被膜的形成，當感染發生時，LFU可促進這些預制抗菌藥物的加速釋放而起到積極的效果[47]。目前相關研究主要集中在體內外模擬預制骨水泥抗菌藥物的釋放，而主要的病原菌和臨床感染相似，以常見的金黃色葡萄球菌為主（表3）。

Cai等[51]模擬髖關節置換術預制萬古霉素丙烯酸骨水泥，置入家兔髖關節部位，然后人為造成金黃色葡萄球菌急性感染，加用LFU后測量髖部抽取物的細菌載量，LFU組0～12 h的髖部抽吸物菌量減少了1.62 lg CFU/mL，LFU組12～24 h的髖部抽吸物菌量減少了2.77 lg CFU/mL。LFU增強骨水泥抗菌效果可能歸因于促進釋放的藥物濃度始終高于最低抑菌濃度，以及超聲引起的相關生物聲學效應。在預防植入物葡萄球菌引發的感染主要以預制萬古霉素和慶大霉素骨水泥為主[50，55]，而對于革蘭陰性菌大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的植入物感染，LFU主要聯合環丙沙星或慶大霉素[48-49]，LFU可促進相應抗菌藥物的釋放，使得水凝膠上的生物膜累積量顯著減少。LFU的這種可靶向或控制藥物釋放能力，使得在感染發生時能夠使預制骨水泥大量釋放抗菌藥物，局部藥物濃度高于最低抑菌濃度，有效殺滅感染菌，此外，LFU可以更有效地讓藥物透過深層組織，發揮更大療效。

3.4 臨床應用

LFU作為一種新型的物理輔助抗感染手段，目前研究大多處于體外和動物實驗階段，臨床研究主要集中在表皮清創術后的康復和慢性傷口愈合，具有減少抗菌藥物的使用時間、降低感染復發率和促進組織再生等功效。相關研究主要以臨床病例回顧性為主，主要針對葡萄球菌，抗菌藥物全身使用，部分是局部協同用藥，LFU局部治療時間一般較長，3個月左右（表4）。

Tewarie等[59]回顧性對比了胸骨切開術后心臟手術患者胸骨皮膚瘺使用超聲輔助治療的效果，設定超聲頻率為25 kHz，強度35～40 W/cm2 ，LFU輔助傷口組18人，常規治療組19人，61%為革蘭陽性菌，16.5%為革蘭陰性菌，10.5%白色念珠菌，結果顯示LFU輔助治療組傷口愈合時間和患者住院時間明顯縮短，抗菌藥物使用時間減少，感染復發率降低。LFU輔助傷口清創系統是一種能夠破壞細菌生物被膜、優先清除壞死組織、減少細菌數量、減少出血量和相對無痛的清創方式。在胸骨深部感染及下肢血管移植術后感染，LFU輔助清除促進了表面和深部壞死物質的分離和脫落，而不損害周圍正常的組織[56-57]。除了外科手術的優勢外，LFU輔助技術在傷口清創和促進愈合等方面，將通過縮短住院時間和降低抗微生物治療的時間來節約成本，提高療效。

4 總結

根據近20年的體外和體內研究數據，可以得出LFU在對浮游菌和細菌生物被膜的聯合治療中起到了很好的輔助作用。對于含藥植入物，LFU可以促進抗菌藥物的釋放，達到最佳療效，但也有報道顯示，經LFU處理會降低負載萬古霉素的丙烯酸骨水泥的界面剪切強度和穩定性[60]。另外，LFU與抗菌藥物聯合治療的臨床應用可能還有很長的路要走，因為臨床應用除了考察其有效性外，安全性是放在首位的，目前雖然對LFU的作用機制有一定了解，但作用頻率、強度及應用時間在體外研究中尚存在很大差異，能夠使用于臨床的參數還需要進一步評估。人們對一種新生事物的研究總會經歷一個漫長的過程，從理論到實踐都是必經之路，從目前來看，LFU這一物理抗感染手段在未來應對細菌耐藥及抗生物被膜是很有前景的。

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