四烯類抗真菌抗生素效價測定方法的改進

王立新 馬步芳 張培培 姚尚辰 寧保明 常艷

摘要：目的 對四烯類抗真菌抗生素的效價含量測定方法進行改進，提高方法的可靠性與可操作性。方法 管碟法。改進培養基pH 6.0～6.2；pH 6.0磷酸鹽緩沖液；檢定菌為啤酒酵母菌（ATCC9763）；培養溫度為30℃±2℃；培養時間為（20±2） h；抗生素濃度范圍為10～50 U/mL；可信限率（FL%）為不得大于5%。結果 抑菌圈大小符合規定，邊緣清晰可以使用儀器進行測量；制霉菌素、制霉素分別在9.45～56.34 U/mL和8.43～50.23 U/mL濃度范圍內線性良好，回歸方程分別為y=0.08854x+1.31343（R2= 0.99978）和y=0.10454x+1.28875（R2=0.99843）；重現性與重復性好[日內精密度分別為1.95%（n=6）和1.95%（n=6），日間精密度分別為1.83%（n=12）和1.84%（n=12）]。結論 改進方法可以作為四烯類抗真菌抗生素及其制劑的常規質量控制方法。

關鍵詞：四烯類抗真菌抗生素；抗生素微生物檢定法；效價測定；制霉菌素；制霉素；不確定度

中圖分類號：R917 ?文獻標志碼：A

Improvement of microbiological potency measurement of tetraenes

antifungal antibiotics

Wang Lixin， Ma Bufang， Zhang Peipei， Yao Shangchen， Ning Baoming and Chang Yan

（National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 102629）

Abstract ? ?Objective A potency determination method for tetraene antifungal antibiotics was established to improve the reliability and operability of existing methods. Methods The cylinder plate method with medium （pH 6.0～6.2） and pH 6.0 phosphate buffer was used. The test organism was Saccharomyces cerevisiae （ATCC 9763）. Incubation lasted 18～22 hours at the temperature 30℃ ±2℃. The range of test dilution concentration was 10 to 50 U/mL. The fiducial limit （FL%） was not more than 5%. Results The size of circular area （zone） of growth inhibition around the cylinder was moderate and the brim of ones was clear， which can be determined by the measuring instrument. The linearity was achieved over the range of 9.45～56.34 U/mL （y=0.08854x+1.31343， R2=0.99978） and 8.43～50.23 U/mL （y=0.10454x+1.28875， R2=0.99843） for nystatin and nysfungin， respectively. The reproducibility and recovery were acceptable. For nystatin and nysfungin， the relative standard deviation （RSD） of intra-day repeatability was 1.95% （n=6） and 1.95% （n=6） and the RSD of inter-day repeatability was 1.83% （n=12） and 1.84% （n=12）， respectively. Conclusion The method has the potential to become the routine quality control method for tetraenes antifungal antibiotics.

Key words Tetraenes antifungal antibiotics; Microbiological assay of antibiotics; Potency determination; Nystatin; Nysfungin; Uncertainty

多烯類抗生素由于結構中含有一系列共軛雙鍵使其具有抗真菌活性，按其中共軛雙鍵可以分為四烯、五烯、六烯和七烯類化合物，臨床常用藥物包括，四烯類：制霉菌素、制霉素；七烯類兩性霉素B等[1]。

制霉菌素（nystatin）在1950年被Hazen和Brown從土壤微生物Streptomyces noursei的培養物中分離獲得[2]，該品種被國際藥典（IntP）、歐洲藥典（EP）、英國藥典（BP）、美國藥典（USP）和日本藥典（JP）所收載，在各國藥典中定義該品種為多組分抗生素[3-7]，其主要組分為制霉菌素A1（圖1）[3-6]，組分限度規定：制霉菌素A1不得低于85.0%，其他任一組分不得大于4.0%[4-6]。

制霉素（nysfungin）是從廣東土壤中分離的鏈霉菌Norse actinomycetes的培養物中分離獲得[8-9]，該品種為中國特有品種，執行部頒標準（WS1-C2-0025-89）。制霉素為多組分抗生素，但其在組分構成上與制霉菌素存在明顯差異，其主要組分為制霉菌素A1（2.12%～15.56%）、制霉菌素 A3（27.22%～53.52%）、多真菌素B（19.13%～39.83%）[10]（圖1）和其他成分[11]，目前標準中尚未對各組分的含量限度進行規定。

目前，各國藥典[3-7]和部頒標準中均采用抗生素微生物檢定法（管碟法）測定四烯類抗真菌抗生素的效價含量。但在實際檢驗過程中發現，現有各標準中規定的實驗條件均存在相同的問題：抑菌圈邊緣模糊不清，無法使用抑菌圈測量儀進行測量，嚴重影響檢驗結果的準確性。為了改善現有標準中遇到的主要問題，本研究在現有試驗條件基礎上，對試驗菌選擇、菌懸液制備、培養基配方、雙碟制備方式、菌碟的培養溫度和時間等進行優化，建立了針對四烯類抗真菌抗生素效價含量測定的改進方法。

1 儀器與試藥

1.1 材料與試劑

制霉菌素標準品（批號130375-201802，效價含量5900 U/mg）、制霉素標準品（批號130344-201703，效價含量5581 U/mg）由中國食品藥品檢定研究院提供；制霉菌素原料（批號4011010）由羅馬尼亞Antibiotice S.A公司提供；制霉素原料（批號01-060-151128）由浙江震元制藥有限公司提供。

色譜純乙腈購自美國Fisher公司；分析純N，N-二甲基甲酰胺、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉和醋酸銨購自北京化學試劑公司；現有方法所用培養基按EP中F號培養基配方自制（pH 6.0～6.2）、改進培養基、滅菌緩沖液（pH 6.0）均由中國食品藥品檢定研究院提供；自制培養基中各配方購自三藥技術開發公司；啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）ATCC 9763和ATCC2601購自中國醫學細菌保藏中心。

1.2 儀器

Waters e2695液相色譜儀、Waters 2998 Photodiode Array Detector、Empower工作站（美國waters公司）；CHB-1抗生素效價測量儀（北京超聲技術發展公司）；GRP-9270型隔水式恒溫培養箱（上海森信實驗儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 效價測定方法

照抗生素微生物檢定法（中國藥典2020年版四部通則1201）測定[12]。現有方法中高、低劑量分別為28和14 U/mL，培養溫度為30℃±2℃，培養時間為（20±2） h；改進方法中高、低劑量分別為50和25 U/mL，培養溫度為30℃±2℃，培養時間為（20±2） h。培養基、滅菌緩沖液、試驗菌均見“儀器與試藥”。

2.2 HPLC分析方法[4-6]

色譜柱：CAPCELL PAK C18（4.6 mm×150 mm， 5 μm）；梯度洗脫（表1）；流動相A：乙腈：0.05 mol/L（3.85 g/L）醋酸銨（29：71， V/V），流動相B：乙腈：0.05 mol/L（3.85 g/L）醋酸銨（60：40， V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：305 nm; 進樣量：20 μL。

3 結果與討論

3.1 現有效價測定方法實驗條件的比較（表2）

制霉素在研發之初曾一度被認為是“國產制霉菌素”，因此，部頒標準（WS1-C2-0025-89）中的質控項目和實驗條件等與當時的USP基本保持一致。故將制霉菌素和制霉素現有質量標準中收載的效價測定實驗條件一并比較（表2）。各標準中，相同點：起始母液濃度和溶劑、培養基配方、緩沖液基本一致；不同點：在試驗菌、是否為單菌層、培養溫度和時間、最終點樣溶液的濃度范圍上存在較大差異。

由于四烯類（制霉菌素和制霉素）和七烯類（兩性霉素B）同屬多烯類抗真菌抗生素，基于本實驗室早期對兩性霉素B的研究基礎[13]，結合現有試驗中遇到的抑菌圈邊緣模糊的主要問題，本研究選擇試驗菌、菌懸液制備、培養基配方、雙碟中是否增加底層、菌碟的培養溫度和時間等作為優化對象，對改進方法中的實驗條件進行逐一確定。

3.2 試驗菌的選擇

目前各標準中規定的四烯類抗真菌抗生素（制霉菌素和制霉素）效價測定用試驗菌分為兩個不同的種屬，分別為假絲酵母屬熱帶假絲酵母種[4-5]和酵母屬釀酒酵母種[3-7]，其中釀酒酵母種為各標準中的通用菌，但在具體應用上存在差異，其中：IntP 9th[3]、EP10.0[4]、BP2022[5]和JP17[7]采用Saccharomyces cerevisiae菌種，具體標準菌株（NCYC 87、CIP 1432-83、ATCC9763）分別向英國NCYC（National Collection of Yeast Cultures， AFRC Food Research Institute， Colney Lane， Norwich NR4 7UA， England）、法國CIP（Collection of the Institute Pasteur， Rue du Dr. Roux， Paris 15， France）和美國ATCC（American Type Culture Collection， 10801 University Boulevard， Manassas， Virginia 20110-2209， USA）菌種保藏機構進行溯源；USP2021[6]和部頒（WS1-C2-0025-89）采用Saccharomyces kudriavzevii菌種，具體標準菌株（ATCC2601）向美國ATCC進行溯源。從標準菌株溯源角度，國內ATCC標準菌株最為易得。根據ATCC官方網站提供的資料顯示：ATCC9763的染色體組型為多倍體，且較ATCC2601的使用范圍廣，ATCC2601僅用于制霉菌素和兩性霉素B的效價測定，而ATCC 9763除用于制霉菌素和兩性霉素B的含量測定外，還用于茴香霉素（anisomycin）、殺假絲菌素（candicidin）、納他霉素（natamycin）等品種的含量測定。通過試驗，在現有條件下ATCC2601和ATCC9763形成的抑菌圈情況并無明顯差異，邊緣均模糊不清無法使用抑菌圈測量儀進行測量。根據菌株易得性和本實驗室前期研究基礎，最終選擇ATCC9763開展后續研究。

3.3 培養基的選擇

培養基為檢定菌提供生長所需的營養，因此在抗生素微生物檢定法中選用的培養基的成分應包含檢定菌生長必需的營養物質[14]。啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）在生長過程中需要充足的碳源及氮源，而最佳碳源和氮源分別是葡萄糖和蛋白胨[15]。基于本實驗室早期對兩性霉素B的研究基礎[13]，選擇培養基配方：蛋白胨10 g、葡萄糖40 g、氯化鈉10 g、瓊脂約13 g，加水至1000 mL，調滅菌后pH值為6.0～6.2。采用2種不同培養模式：20 mL底層加5 mL菌層和無底層僅15 mL單菌層，在相同溫度和時間下對ATCC 9763進行培養，比較菌株在不同培養模式下的生長狀態，ATCC9763在雙層條件下的生長狀態明顯優于單菌層，故選擇20 mL底層加5 mL菌層的方式制備雙碟開展后續研究。在應用該改進培養基時需注意，因該配方中葡萄糖含量較高，如配制后反復加熱融化或多次高壓滅菌，培養基的顏色會隨加熱或高壓次數的增加而明顯變深，從淺土黃色變至深褐色，可能是其中糖在高溫條件下轉化為醛所致，而ATCC 9763在顏色變深的培養基中，即便在20 mL底層加5 mL菌層的培養模式下，生長速度和狀態都會明顯受到抑制。因此，在使用該改進培養基時需臨用現制。

3.4 菌懸液的制備

在管碟法中需要使用一定濃度的菌懸液來制備菌層，菌懸液的質量與抑菌圈的邊緣清晰度直接相關[14]。各國藥典中均對啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）菌懸液的制備作出規定[3-5，7，12]，但在具體要求間存在較大差異（表3），主要差異點：培養溫度、時間，制備菌懸液的溶劑以及菌懸液是否可以儲存使用。為了改善現有抑菌圈邊緣模糊的現象，對上述因素進行逐一考察。根據ATCC官網信息，ATCC 9763在30 ℃條件下進行培養。故本研究中選擇不同溫度（27℃±2℃、30℃±2℃、35℃±2℃）和時間[（24±2） h、（48±2） h、（72±2） h]條件下對ATCC9763在斜面培養物上的生長狀態進行觀察，并采用不同溶劑（滅菌水和生理鹽水）制備菌懸液，分別在菌懸液制備后的第0、1、3、7、14天按“3.3”中確定的改進培養基制備雙碟觀察抑菌圈邊緣的清晰情況。通過試驗觀察，在30℃±2℃培養（48±2） h的斜面培養物ATCC9763的菌落形態最為理想，呈現奶油色、光滑扁平并散發出濃郁的啤酒香氣；不同溶劑制備的菌懸液所形成的抑菌圈形態并無明顯差別；但隨菌懸液放置時間的延長抑菌圈邊緣明顯出現模糊的現象，其中由新制菌懸液（放置0 d）獲得的抑菌圈邊緣最為清晰，可以滿足儀器測量需求。最終確定：將ATCC9763接種于沙氏或YPD斜面上，在30℃±2℃培養（48±2） h，用滅菌水或生理鹽水將菌苔洗下置含有滅菌玻璃珠的試管中，振搖均勻（應避免劇烈震蕩），該菌懸液需臨用現制，當天使用。此外，雖然均使用臨用現制的菌懸液，但制霉素形成的抑菌圈邊緣仍較制霉菌素形成的抑菌圈邊緣模糊，有時甚至出現“雙圈”現象，這正是由于制霉素和制霉菌素在組分構成上存在差異所致（圖2）。當待測抗生素由多個組分構成時，不同組分可能具有不同的MIC值，各組分形成的抑菌圈直徑可能存在差異，各組分共同作用時可能形成多個抑菌圈疊加的現象，致使該多組分抗生素所形成的抑菌圈邊緣模糊呈現“雙圈”現象，此時更應嚴格控制試驗菌傳代和菌懸液的制備操作[14]。

3.5 培養溫度和培養時間的選擇

按前述“3.2”至“3.4”確定的改進試驗條件制備雙碟，選擇不同溫度（30℃±2℃、35℃±2℃）和時間[（17±2） h、（20±2） h、（46±2） h]條件下培養，對菌層生長、抑菌圈形成過程和鋼管內剩余抗生素溶液的量進行觀察。通過試驗觀察，在30℃±2℃培養（20±2） h的菌層生長和抑菌圈形成情況最為理想，可以直接使用抑菌圈測量儀進行測定，且在培養終點時各鋼管內均有剩余抗生素溶液。35℃±2℃溫度條件下菌層的生長較30℃±2℃受到抑制，這與啤酒酵母菌（saccharomyces cerevisiae）自身的生長特性相關。雙碟培養（17±2） h時菌層中試驗菌呈現的整體狀態略薄、顏色較培養（20±2） h明顯偏淺，由于ATCC 9763呈現奶油色，菌層顏色偏淺時和培養基的顏色較為接近，不利于儀器測量時對抑菌圈邊緣的判斷；雙碟培養（46±2） h時菌層狀態最優，但菌圈邊緣較培養（20±2） h明顯出現模糊的現象，這可能由于各鋼管中的抗生素溶液在培養24 h后逐漸耗盡所致。根據抑菌圈形成的原理：培養基中的試驗菌開始生長與鋼管中的抗生素溶液向培養基內呈球面狀擴散同時發生，當培養到某一時間段，培養基中的兩種互動作用達到動態平衡，培養基中形成透明的抑菌圈，在抑菌圈邊緣處抗生素的濃度恰好等于此抗生素對于該試驗菌的最低抑菌濃度[14]。如果當鋼管中的抗生素溶液耗盡后繼續培養，隨著時間的不斷延長，已形成的抑菌圈邊緣處的動態平衡將被打破，邊緣外的菌將逐漸向圈內生長或抑菌圈內原本受到抑制的試驗菌隨抗生素濃度的不斷下降將逐漸恢復生長，最終呈現出邊緣模糊的現象。故最終確定培養溫度和時間分別為30℃±2℃和（20±2） h。

3.6 對改進方法的驗證

按中國藥典2020年版四部通則指導9101分析方法驗證指導原則對改進方法進行方法學驗證[12]。

3.6.1 線性與范圍

取制霉菌素和制霉素標準品（130375-201802批和130344-201703批，效價含量5900 U/mg和5581 U/mg），分別精密稱定19.1和18.0 mg，各置于100 mL容量瓶中，加入N，N－二甲基甲酰胺（DMF）溶解并稀釋制成約1000 U/mL的母液，再分別精密量取制霉菌素和制霉素母液適量，以pH6.0磷酸鹽緩沖液為稀釋劑，采用0.8作為劑間比進行9點等比稀釋，并確保各溶液中DMF的含量均為5%（V/V），即：制霉菌素各溶液濃度分別為56.34、45.08、36.06、28.85、23.08、18.46、14.77、11.82和9.45 U/mL；制霉素各溶液濃度分別為50.23、40.18、32.15、25.72、20.57、16.46、13.17、10.53和8.43 U/mL。采用改進培養基，按抗生素微生物檢定法測定標準曲線，得制霉菌素和制霉素回歸方程分別為y=0.08854x+1.31343（R2=0.99978）和y=0.10454x+1.28875（R2=0.99843），即在9.45～56.34 U/mL、8.43～50.23 U/mL的濃度范圍內，制霉菌素、制霉素各自濃度的對數劑量和抑菌圈半徑的平方值呈直線關系。綜上，確定四烯類抗真菌抗生素效價測定的濃度范圍為10～50 U/mL。

3.6.2 精密度

對同一批樣品的效價含量進行測定，制霉菌素和制霉素日內的相對標準偏差（RSD）為1.95%（n=6）和1.95%（n=6），制霉菌素和制霉素日間的RSD為1.83%（n=12）和1.84%（n=12）。

3.6.3 準確度

對現有方法與改進方法的測定結果進行比較。采用所間協作方式分別對同一批制霉菌素和制霉素樣品進行效價測定，采用測量結果的不確定度（即測量的分散性）作為準確度的評價指標，即在兩種方法測定結果間無顯著性差異時，測量結果的不確定度越小則結果的準確度越高，其中：制霉菌素以JP17中二劑量作為現有方法，由3個協作單位采用現有方法測得34組結果；另外4個協作單位采用改進方法測得51組結果；制霉素以部頒標準（WS1-C2-0025-89）中二劑量作為現有方法，由5個協作單位采用現有方法測得60組結果；另外5個協作單位采用改進方法測得60組結果。測定結果及其不確定度詳見表4～5。利用兩樣本獨立t檢驗對由現有方法和改進方法獲得的測定結果間的差異性進行統計分析，制霉菌素和制霉素的統計結果分別為P=0.608>0.05和P=0.097>0.05，即2種方法獲得的制霉菌素和制霉素測量結果間均無顯著性差異。但現有方法結果的不確定度約是改進方法的3～4倍。根據不確定度評定中的1/3原則，即某一分量的不確定度數值小于最大分量不確定度數值的1/3時，該分量對總不確定度的貢獻可以忽略不計的原則[16]，由此可以認為改進方法測定結果的分散程度小于現有方法測定結果的分散程度，即改進方法可以明顯提高測定結果的準確度。

3.6.4 可信限率（FL%）

分別計算出采用現有方法與改進方法測定結果FL%的平均值（表6），可見改進方法的可信限率更低。因此，將改進方法中的可信限率要求由現有方法中的7%下調為“不得大于5%”。

4 結論

本研究以現有試驗中遇到的抑菌圈邊緣模糊的主要問題為出發點，從試驗菌選擇、菌懸液制備、培養基配方、雙碟制備方式、各關鍵環節的培養條件等幾個方面入手對現有測定方法進行了改進。改進方法中形成的抑菌圈邊緣清晰可以使用抑菌圈測量儀進行測量，可以大大提高測定結果的準確性。通過系統的方法學驗證，證明了改進方法的可靠性，該方法可以作為四烯類抗真菌抗生素（制霉菌素和制霉素）原料及其制劑的常規質量控制方法。目前，該方法已作為常規標定方法在制霉素國家標準品的換批標定工作中使用。

參 考 文 獻

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