基于CRISPR技術的雞傳染性支氣管炎病毒耐藥性研究

摘" 要：雞傳染性支氣管炎（avian infectious bronchitis，IB）是一種急性呼吸道疾病，具有很高的傳染性。該病的發病率不高，但發病后可導致雞生長緩慢、產蛋率降低等，嚴重影響家禽業的健康發展。早期診斷和綜合防治是控制該病的有效方法，因此，本文就如何有效地防治雞傳染性支氣管炎進行了探討與分析。

關鍵詞：CRISPR技術；雞傳染性支氣管炎；耐藥性

作者簡介：李軍琪（1988－ ），男，高級獸醫師，主要從事基層畜牧獸醫工作；E-mail：xumuweishi@yeah.net

隨著我國規模化、集約化飼養技術的進步，雞的飼養量大幅提升，但高密度飼養也導致各種疾病的發生。雞傳染性支氣管炎在全國范圍內均有發生，不論規模大小，發病率均較高。南方的雞場發病率較北方的高。雞傳染性支氣管炎具有一定的季節性，可在不同季節發生。該病具有很強的傳染性，如果不能進行有效控制，很難達到很好的控制效果。多年的飼養經驗表明，飼養環境、飼養管理、疾病預防措施與該病的發生、流行之間存在著密切的關系。

1" 病原學

雞傳染性支氣管炎（avian infectious bronchitis，IB）是由冠狀病毒科、冠狀病毒屬的雞傳染性支氣管炎病毒（avian infectious bronchitis virus，IBV）所引起的一種急性、高度接觸性傳染病。IBV是一種單股負鏈RNA病毒，病毒粒子呈囊泡狀和球形，具有較差的耐溫性，56 ℃下15 min即死亡，但在低溫下能存活很久[1]。IBV也會發生突變，突變株在傳染性和防控方面與原有毒株有很大差異，不僅造成防控更加困難，而且容易出現新的血清型和變種。這些變種可以在患病雞氣道內大量繁殖，嚴重影響呼吸道的結構和功能，有些毒株甚至會侵害腎臟、生殖器官，引發病變。

IBV可通過飼料和飲水途徑進行傳播，不同品種、年齡和性別的雞均易感，但1～4周齡的雞更易感，且發病率更高。IB一年四季都有發生，主要發生在冬春季節。

2" 臨床癥狀

2.1 呼吸型傳染性支氣管炎

喘氣、氣管啰音、咳嗽、打噴嚏、流鼻液等是雛雞患有傳染性支氣管炎的典型癥狀。在條件差的雞舍中，容易發生支原體、大腸桿菌、副嗜血桿菌等多種病原體的混合感染，造成雞群出現較大的傷亡。患病雞表現為精神萎靡、食欲減退、羽毛蓬亂、昏睡、怕冷、下痢等癥狀[2]。6周齡以上及成年雞感染IBV后，會出現輕微的呼吸癥狀，死亡率下降，甚至無死亡；產蛋母雞感染后，會出現產蛋率和蛋殼品質下降，軟殼和畸形蛋增多，蛋白偏稀；患病蛋雞的產蛋率降低程度與雞群所處的產蛋期及所感染毒株的毒性有關。

2.2 腎型傳染性支氣管炎

腎型傳染性支氣管炎多見于10周齡以內的幼年雞，成年雞中很少見。在發病早期，患病雞無明顯的臨床癥狀，僅有輕度的呼吸癥狀，接著死亡率急劇上升，病死雞體表呈深紫色；患病雞群食欲增加，出現白色水樣腹瀉。本病常在雞群中延續很久，有時可超過兩周。

2.3 腺胃型傳染性支氣管炎

在發病初期，患病雞沒有什么特別的臨床癥狀，但隨著時間的推移，食欲越來越差，情緒也變得低落，表現為無精打采，羽毛蓬松，排便量越來越少，直到死亡。在感染期，各類疫苗都無法產生良好的免疫效果，有些疫苗甚至會出現免疫失敗。在良好的環境管理和飼料營養狀況下，雞的發病率較小，即使發生，病程也較短[3]。

3" 特征性剖檢病變

發生呼吸型傳染性支氣管炎時，患病雞的氣管和竇腔中可發現漿狀、卡他性或酪性分泌物；氣囊有輕微的渾濁和增厚；灰紅色的病變多發生在肺門處，或靠近支氣管。

發生腎型傳染性支氣管炎時，患病雞腎水腫，呈灰白色，尿酸沉積于小管，呈一條白線，腎切面可見乳白色的細顆粒狀分泌物；尿酸鹽沉淀導致的輸尿管擴大。如果病情較重，在心包膜、心外膜、肝表面、氣管黏膜、氣囊可見白色的鈣尿酸鹽。

發生腺胃型傳染性支氣管炎時，患病雞腺胃體積較大，在漿膜表面可見膨大的腺胃腺；腺胃黏膜水腫、出血；在乳頭根部有環狀出血，偶有腺胃乳頭破裂，呈彈坑狀；腎腫大，有斑點。

患有傳染性支氣管炎的產蛋雞，剖解后通常可見卵泡系帶松弛，卵泡扁平、橢圓形，同時輸卵管子宮部位會有黏膜水腫等情況。患病雞在幼年期感染，剖檢可見其卵巢發育良好，并有大量的卵泡排出，卵黃破裂；可能是輸卵管發育不全，僅有子宮、陰道部分存在，造成輸卵管內積水[4]。

4" 基于規律成簇的規律間隔成簇短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）技術的雞傳染性支氣管炎病毒耐藥性概述

IBV的耐藥性是指病毒對多種藥物的敏感性變差，包括藥物治療和疫苗接種。IBV的耐藥性會影響疫苗的免疫效果。研究表明，IBV耐藥株中編碼蛋白的基因發生了顯著的改變。研究表明，某些IBV基因在其遺傳變異過程中發生了改變，導致其對抗生素產生抗藥性。這些研究為未來針對IBV的耐藥性分析奠定了基礎。利用CRISPR/CRISPR（CRISPR associated，Cas）蛋白9（CRISPR/Cas9）技術，對不同基因型IBV在不同組織中的耐藥情況進行分析，有助于深入了解不同IBV對抗生素耐藥的分子機制，為抗生素耐藥性檢測提供重要信息。

為此，我們利用CRISPR/Cas9技術對IBV進行了檢測，為建立快速的IBV耐藥性檢測方法提供了新思路。

首先，我們從雞組織中分離得到IBV，并通過反向遺傳技術對IBV進行遺傳變異分析。結果顯示，通過反向遺傳技術獲得的IBV對多種藥物具有耐藥性。其次，我們利用CRISPR/Cas9技術在雞組織中鑒定了IBV的耐藥突變位點。通過反向遺傳技術獲得的IBV耐藥突變位點與傳統方法獲得的變異位點存在較大差異。再次，我們對兩種變異類型的IBV進行了比較，結果表明耐藥突變位點在兩種變異類型之間存在差異。最后，我們通過實時熒光定量PCR技術對IBV在不同組織中的藥物敏感性進行了分析。結果表明，反向遺傳獲得的IBV對多種藥物有耐藥性，其變異位點主要分布在感染細胞中。對IBV耐藥突變位點進行分析，可以有效識別并鑒定IBV的耐藥性。

基于CRISPR/Cas9技術的IBV耐藥性檢測方法已經被廣泛應用于細菌耐藥性的研究，但目前僅在小鼠模型中得到了驗證。因此，我們使用CRISPR/Cas9技術建立了一種快速、簡便、敏感的IBV耐藥性檢測方法，并利用該方法對不同基因型IBV在不同組織中的藥物敏感性進行了分析[5]。

5" 基于CRISPR技術優化雞IBV耐藥性的舉措

目前，IBV的耐藥機制研究主要集中在耐藥基因的定位與克隆、耐藥基因的功能驗證及分子機制解析。因此，可以利用CRISPR/Cas技術，在獲得高質量病毒基因組的基礎上，對病毒的耐藥性進行篩選和驗證。為了解決雞傳染性支氣管炎病毒耐藥性問題，可以對病毒基因組進行優化設計，并選擇合適的方法對其進行提取、純化和測序。對基因組中不利于藥物篩選的基因進行剔除或替換。也可以對CRISPR/Cas系統中不同靶點進行改造，增加靶向基因的數量，優化設計出更加高效、安全的基因編輯系統，并利用該系統提高雞胚致死率。還可以通過在不同宿主細胞中，建立相應的病毒基因組表達系統，并將表達系統引入到病毒基因組中，利用該系統對病毒基因組進行調控，使其產生新的基因突變。

在細胞水平上，可以通過測定病毒基因突變后的毒力，并通過免疫原性試驗、疫苗免疫效果評價等方法，對基因突變后的病毒毒力進行評價。利用CRISPR/Cas系統進行藥物篩選也是目前研究病毒耐藥性的一個重要方法。然而，目前CRISPR/Cas系統用于篩選藥物的方法還存在一定的局限性。因此，需要尋找一種更為高效、安全的方法進行藥物篩選工作，以提高藥物篩選的準確性。

6" 總結

目前，基于CRISPR技術的IBV耐藥性研究仍處于初期階段，相關研究還不夠深入。未來的研究工作應深入到IBV基因的功能研究，特別是基因表達調控、信號轉導等方面，將這些機制闡明，有助于進一步揭示IBV耐藥性的形成機制和規律，為今后優化IBV耐藥性提供理論基礎，同時也可為臨床藥物的研發提供重要參考。

參考文獻

[1] 李倩．雞傳染性支氣管炎病毒血清學和分子生物學檢測技術研究進展[J]．畜禽業，2023，34（9）：12-14.

[2] 莊金秋，阮震，張穎，等．雞傳染性支氣管炎病毒血清學和分子生物學檢測技術研究進展[J]．中國動物檢疫，2018，35（7）：74-77.

[3] 趙秀美，周生，姜逸，等．雞傳染性支氣管炎病毒輔助蛋白研究進展[J]．中國家禽，2022，44（1）：97-101.

[4] 王金萍，路宏朝，張濤，等．CRISPR/Cas9技術在雞抗病毒感染中應用的研究進展[J]．黑龍江畜牧獸醫（下半月），2022（2）：28-34，41.

[5] 馬得瑩，范佳慧，任夢婷，等．不同毒力傳染性支氣管炎病毒誘導SPF雞炎癥反應的免疫機制[J]．東北農業大學學報，2023，54（1）：60-69.