不同類型濕地土壤周叢生物細菌群落結構特征及影響因素

摘" 要： 為探明不同類型濕地土壤周叢生物細菌群落結構差異及主要影響因素，在上海青西地區的稻田、農用池塘、水上森林和湖泊4種濕地開展了原位培養實驗，測定不同濕地土壤理化指標和周叢生物生物量，并通過高通量測序表征了周叢生物細菌群落結構特征. 結果表明：周叢生物生物量表現為水上森林gt;農用池塘gt;湖泊gt;稻田，細菌群落多樣性則表現為稻田gt;水上森林和農用池塘gt;湖泊，且水上森林和湖泊土壤細菌群落組成較為相似. 各濕地土壤周叢生物的優勢菌為伯克氏菌、假單胞菌、嗜氫菌、黃桿菌等. 土壤中較高的碳（C）、氮（N）和磷（P）含量能增加周叢生物細菌群落多樣性，而較高的N和P含量則能提高周叢生物細菌群落均勻度. 土壤pH值和堿性速效磷（AP）是造成不同濕地土壤周叢生物細菌群落結構差異的主要驅動因素. 研究結果可為掌握長三角地區濕地土壤周叢生物細菌群落多樣性的空間差異和主要驅動因素提供基礎數據.

關鍵詞： 周叢生物； 濕地； 土壤； 細菌群落結構； 環境因子

中圖分類號： X 172""" 文獻標志碼： A""" 文章編號： 1000-5137（2024）03-0341-11

Structural characteristics and influencing factors of bacterial communities in periphyton of different kinds of wetlands

LIANG Longrui1， LI Xilin1， LI Li1， YIN Haitao1， HUANG Nannan1， XIAO Jiamu1，

ZHAO Ang’ang1， XIE Yixuan2， ZHANG Ying2， MENG Liang1，3*

（1.School of Environmental and Geographical Sciences， Shanghai Normal University， Shanghai 200234，China； 2.The Shanghai Key Lab for Urban Ecological Processes and Eco-Restoration，East China Normal University，Shanghai 200241，China； 3.Shanghai Yangtze River Delta Urban Wetland Ecosystem National Field Science Observation Station，

Shanghai Normal University， Shanghai 201718， China）

Abstract： In order to explore the structural differences and the main influencing factors of bacterial communities in periphyton of different types of wetland soils， in situ culture experiments were carried out in four kinds of wetlands in Qingxi Zone， Shanghai， including paddy fields， agricultural ponds， aquatic forests， and lakes. The physical and chemical indicators of different wetland soils and the biomass of the periphyton were measured， and the characteristics of bacterial community structure of periphyton were characterized by high-throughput sequencing. The results showed that the biomass of periphyton was in the order of aquatic forestsgt;agricultural pondsgt;lakesgt;paddy fields and the bacterial community diversity was in the order of paddy fieldsgt;aquatic forests and agricultural pondsgt;lakes， and the bacterial community composition of aquatic forests and lakes was similar. The dominant bacteria of periphyton in the wetland soil were Burkholderia， Pseudomonas， Hydrogenophilus， and Flavobacterium. The higher content of carbon （C）， nitrogen （N） and phosphorus （P） in the soil can increase the diversity of the bacterial community， while the higher content of N and P can improve the uniformity of the bacterial community. Alkaline effective phosphorus（AP） and pH in soil were the main driving factors for the differences in the bacterial community structure of periphyton in different wetlands. The results can provide basic data for mastering the spatial differences and main driving factors of bacterial community diversity of periphyton in wetland soil in Yangtze River Delta region.

Key words： periphyton； wetland； soil； bacterial communities structure； environmental factor

0" 前 言

自然環境中的周叢生物主要由細菌、真菌、原生生物等微生物組成，其群落結構組成豐富多樣［1］. 周叢生物在濕地中尤為多見，普遍存在于濕地水-土界面之間［2］，其可提高濕地生物層次結構，增加濕地物種多樣性，豐富濕地生態系統的結構和功能，對維持濕地生態系統穩定起著重要作用.

濕地土壤周叢生物的細菌群落結構極易隨環境條件的變化而改變［3］. SU等［4］對比了2種不同生長環境下周叢藻類群落結構的差異，發現在相同培養天數下周叢藻類的優勢屬存在顯著差異. LU等［5］研究了營養物質對周叢生物群落結構的影響；發現營養物質越高，周叢生物群落多樣性越低，但其中原生動物多樣性則明顯升高. 國內外有關周叢生物群落結構特征研究大多關注環境因子對周叢藻類群落結構的影響，而其對周叢生物細菌群落結構影響的研究不多.

周叢生物主要生長于潮濕環境中，因此目前主要關注水體環境因子對周叢生物群落結構的影響，然而濕地中相當數量的周叢生物生長于水土界面，其與下覆土壤接觸密切［3］，推測土壤理化性質也可能對周叢生物群落結構產生影響. 土壤的pH值和營養物質會影響土壤細菌碳源利用功能的多樣性，進而改變細菌群落結構；土壤β?葡萄糖苷酶（β-GC）和N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（NAG）分別能降解纖維素和幾丁質［6］ ，并產生大量碳（C）源和氮（N）源，從而進一步改變細菌群落結構. 然而上述土壤環境因子及土壤酶活性對所附著周叢生物細菌群落結構的影響規律尚不清楚.

本文作者以長三角一體化示范區內的青西郊野公園為研究區域，研究不同人為干擾程度的淡水濕地土壤周叢生物細菌群落結構差異，掌握影響周叢生物群落結構特征的主要土壤環境驅動因子，為長三角淡水濕地土壤周叢生物多樣性維持與功能利用提供科學依據，有助于長三角生態綠色一體化示范區的建設與發展.

1" 材料與方法

1.1 研究區域

研究區域為上海市青西郊野公園，其位于上海市青浦區西南部、淀山湖南側，周邊土地利用類型以水域、基本農田保護區和農林復合區為主［7-8］. 選擇公園內4種典型的濕地類型：稻田（PS）、農用池塘（LP）、水上森林（FW）和湖泊（LW），每個濕地各在進水口、中心點、出水口設定1個培養點位，各培養點經緯度如表1所示.

1.2 現場培養

周叢生物現場培養從2020年8月3日開始至2020年10月7日結束，放置基質日期為2020年8月3日，采集周叢生物日期為2020年10月5日，2020年10月6—7日完成周叢生物預處理.

1.2.1 材料放置

以PVC塑料板作為周叢生物培養基質［9］. 所用PVC塑料板為片狀，厚度為1.0 mm ，長寬為20.0 cm×29.7 cm. PVC板置于各濕地培養點土壤表面并固定，放置位置依據各濕地水位高低進行適當調整，以確保塑料板與水接觸. 每個培養點放置3片PVC塑料板作為重復實驗.

1.2.2 材料回收

生長2個月后采集各點位基質和下覆土壤.

（1） 土壤采集：用鐵鏟取各培養點5～10 cm深度的表層土樣，裝于鐵盒中，用保鮮膜密封后4 ℃保存. 每個點位取3份作為重復土樣.

（2） 周叢生物采集：取下附著周叢生物的PVC塑料板，裝入塑料保鮮盒中4 ℃保存.

1.2.3 樣品預處理和測定

周叢生物樣品的預處理步驟如下：

（1） 用磷酸緩沖液沖洗PVC塑料板以去除多余土壤，直至僅存附著在基質上的周叢生物.

（2） 將附有周叢生物的PVC塑料板剪成1 cm×1 cm的小片.

（3） 將每個樣品所得PVC塑料小片分成3份：一份在質量分數為5%的戊二醛4 ℃保存用于形貌觀測；一份鮮樣4 ℃保存用于生物量測定；一份鮮樣-86 ℃保存用于DNA提取.

周叢生物樣品預處理完畢后，用結晶紫法測定生物量，掃描電子顯微鏡（SEM）觀測周叢生物表面形貌. 周叢生物DNA 使用FastDNA? Spin Kit for Soil試劑盒提取，并利用Illumina 測序平臺進行16S rDNA 高通量測序，分析周叢生物細菌群落多樣性. 為更為準確闡明土壤環境因子對周叢生物影響，僅取與土壤接觸的PVC塑料板一側上周叢生物進行分析測定.

土壤樣品pH值使用玻璃電極法測定；硝態氮（NO3--N）使用紫外分光光度法測定；銨態氮（NH4+-N）使用2 mol·L-1 KCL浸提-靛酚藍比色法測定；有機質（SOM）使用重鉻酸鉀容量法測定；堿性速效磷（AP）用碳酸氫鈉浸提法測定；土壤中性磷酸酶（NP）使用磷酸苯二鈉比色法測定；土壤過氧化氫酶（CAT）使用高錳酸鉀滴定法測定；土壤β-GC 、土壤NAG使用對-硝基苯酚比色法測定.

1.3 數據處理

利用SPSS軟件對實驗數據進行統計與繪圖，結果均采用平均值±標準誤差（mean±SD）表示；基于QIIME 2平臺，完成16S rDNA序列處理→操作分類單元OTU生成→物種注釋分析→Alpha和Beta多樣性分析；使用Canoco軟件完成細菌群落多樣性與土壤理化指標的冗余分析（RDA）.

2" 結果與討論

2.1 4種濕地土壤理化特征與酶活性

由表2數據可知，稻田和農用池塘濕地土壤呈弱酸性，水上森林和湖泊濕地則為弱堿性；硝態氮、銨態氮含量在稻田和農用池塘土壤中較高，在水上森林和湖泊土壤中偏低；SOM在湖泊土壤中含量較低；AP在農用池塘和稻田中含量偏高. NP是催化土壤有機磷（P）礦化的酶，其在稻田和農用池塘中含量相對較高，這可能是由于這2種濕地有機磷的外源匯入較多［10］，激活土壤中NP活性；β-GC可降解纖維素，為土壤提供碳源，其在水上森林和稻田土壤中含量較高，這可能與這2種濕地植物殘體的外源輸入較多有關.

2.2 濕地土壤周叢生物生長情況

圖1所示為4種濕地土壤周叢生物生物量情況，其中水上森林周叢生物生物量最高，其次為農用池塘和湖泊. 稻田周叢生物生物量最少，這可能是由于采樣期間稻田水位較低，使周叢生物的水分生長條件受限所致.

圖2為不同濕地土壤周叢生物SEM圖. 經過2個月培養，各濕地PVC基質表面均已形成較為致密的周叢生物結構，且生長有不同密度的細菌. 其中水上森林和農用池塘周叢生物細菌以桿菌為主，湖泊濕地周叢生物細菌以桿菌和球菌為主，稻田周叢生物則被大量胞外聚合物（EPS）包裹，所含細菌數量較少，這與周叢生物生物量的結果相一致.

2.3 4種濕地土壤周叢生物細菌群落結構分析

2.3.1 細菌群落物種組成

4種濕地中周叢生物細菌在科水平的分布如圖3所示. 結果表明：各濕地周叢生物中優勢菌為伯克氏菌科 （Burkholderiaceae）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、嗜氫菌科（Hydrogenophilaceae）和黃桿菌科（Flavobacteriaceae）. 其中，湖泊周叢生物中假單胞菌豐度大于10%，其次為微球菌和伯克氏菌；農用池塘周叢生物伯克氏菌豐度最大，且顯著高于其他3種濕地，其次為黃桿菌科和假單胞菌科. 伯克氏菌為水上森林、稻田和農用池塘周叢生物中的首要優勢菌，這是由于伯克氏菌通常與植物共生，而上述3種濕地植被覆蓋情況優于湖泊濕地，從而促進伯克氏菌的大量生長. 值得注意的是，微球菌科（Micrococcaceae）作為湖泊周叢生物中的第二大優勢菌科，其在其他3種濕地中豐度卻較低，說明微球菌適合生長于湖泊環境.

2.3.2 細菌群落多樣性指數分析

2.3.2.1 α多樣性

圖4為4種濕地土壤周叢生物細菌群落α多樣性結果. 由圖4可知，4種濕地間周叢生物細菌群落的Chao1指數無顯著差異，說明四者細菌群落物種豐富度較為一致. Shannon指數分析表明稻田周叢生物細菌群落多樣性最為豐富，湖泊最低，而水上森林和農用池塘與其他2種濕地的差異不明顯. 上述結果表明濕地類型會顯著影響土壤周叢生物細菌群落多樣性，其中稻田由于有機肥等營養物質的大量輸入，使其土壤周叢生物細菌具有較高的活性和群落多樣性，而湖泊濕地較高的水流速度則不利于土壤周叢生物細菌的穩定生長，使其群落多樣性偏低［8-9］；Pielou指數表征物種群落的均勻度，4種濕地的Pielou指數同樣具有一定差異，且與Shannon指數的排列規律一致.

2.3.2.2 β多樣性

β多樣性指數可用于比較不同濕地土壤周叢生物細菌群落組成的相似度. 圖5的主坐標分析（PCoA）結果表明：農用池塘和稻田間的細菌群落組成差異較為明顯，這是由于兩者的作物種植模式不同所致. 水上森林和湖泊受人為干擾較少，且兩者處于同一區域，環境因子接近，因此兩者土壤周叢生物細菌群落結構較為相似. 此外，由于頻繁受到翻耕、灌溉、施用化肥和農藥等人為干擾，稻田和農用池塘土壤周叢生物細菌群落組成與水上森林和湖泊相差較大，說明人類活動會顯著影響濕地土壤周叢生物細菌群落構建. SU等［4］在研究中同樣發現長期施肥顯著改變了水稻田土壤周叢生物細菌物種組成方式.

2.3.3 α多樣性指數與土壤因子相關性分析

為了進一步探究土壤環境因子對周叢生物細菌結構的影響，分析了土壤理化指標和酶活性與周叢生物細菌多樣性間的皮爾森相關性. 如表3所示，4種濕地周叢生物細菌群落Chao1指數與土壤理化指標和酶活性無相關性. Shannon指數與土壤SOM含量、NP、NAG呈正相關（p lt; 0.05），這是由于濕地環境中C，N，P等營養元素較為豐富，從而增加了周叢生物細菌多樣性. Pielou指數與土壤pH值呈負相關性（p lt; 0.05），說明pH值越高，濕地周叢生物細菌群落均勻度越低；該指數與NP和NAG則呈顯著正相關（p lt; 0.01），說明土壤N和P能提高周叢生物細菌群落均勻度. 錢瑋等［11］在對底泥細菌群落結構研究中同樣得到高負荷N和P會對細菌群落結構產生影響的相似結論.

2.3.4 OTU（operational taxonomic units）韋恩圖

利用高通量測序技術得到用于后續分析的序列條數，在97%相似度下將序列聚類為分類單元用于物種分類，每個分類單元稱為OTU. 圖6為所有濕地周叢生物細菌OTU韋恩圖，顯示了各濕地周叢生物特有和共有的細菌群落數. 結果表明4種濕地周叢生物樣品中細菌OTU數目為19 638，其中水上森林、稻田、農用池塘、湖泊4種濕地包含的OTU數目分別為6 797，6 491，5 631和7 211. 水上森林和湖泊擁有1 884個相同的細菌OTU數，相似群落數最高并占總群落數的9.59%；稻田和湖泊擁有1 371個相同細菌群落數，相似度則較低. 此外，農用池塘周叢生物特有的細菌群落數量明顯低于其他3種濕地，這一方面是由于其總體OT數目較低所致，另一方面也說明該濕地周叢生物細菌群落受自然和人為因素影響程度相當，其與純人工濕地（稻田）和天然濕地（湖泊和水上森林）共享細菌群落數量較多.

2.3.5 物種組成熱圖

由細菌物種組成熱圖可直觀判斷不同周叢生物細菌群落的相似度和優勢菌屬. 如圖7所示，湖泊和水上森林周叢生物細菌群落組成較為相似，而稻田和農用池塘的周叢生物細菌群落組成差異較大，且兩者與湖泊和水上森林的差異同樣較大，這與PCoA的結果一致. 此外，湖泊和水上森林進水口、中心和出水口點位周叢生物細菌群落結構存在一定差異，這與胡安誼等［12］的研究結果相似，說明自然濕地對周叢生物的微生物組成存在空間分異效應.

2.4 周叢生物細菌代謝通路統計

為統計周叢生物細菌的整體功能，引入KEGG數據庫（KEGG Pathway Database），以直接鑒定不同濕地周叢生物特定代謝途徑細菌的基因數量. 如圖8所示，所有濕地周叢生物細菌的主要代謝通路均為代謝（metabolism），其中代謝能力最強的為異生物素生物降解和代謝，之后依次為萜類化合物和聚酮化合物代謝、糖類代謝和脂質代謝.

2.5 主要土壤環境驅動因子

將4種濕地周叢生物細菌群落與土壤理化指標及酶活性進行RDA分析. 如圖9所示，RDA1軸能解釋群落結構差異的53.29%，RDA2軸能解釋差異的20.94%，總體能解釋周叢生物細菌群落結構間差異的73.23%. 湖泊周叢生物細菌群落結構與土壤pH值呈正相關；稻田周叢生物細菌群落結構主要與土壤中的AP和NP的含量呈正相關，與土壤pH值和CAT含量呈負相關；農用池塘周叢生物細菌群落結構與土壤中NO3--N，AP和NAG的含量呈正相關；土壤理化指標和酶活性對水上森林周叢生物細菌群落組成無顯著影響，說明該濕地可能還存在植被類型、淹水頻率、凋落物種類等其他關鍵環境驅動因子［13-15］. 整體而言，pH值和AP的含量是影響周叢生物細菌群落組成的主要土壤環境驅動因子，NAG，β-GC，SOM和CAT的含量的影響次之，且對細菌群落結構的影響程度差異不大.

3" 結 論

（1） 4種濕地土壤周叢生物呈現不同生長狀態. 周叢生物生物量由多到少依次為水上森林、農用池塘、湖泊和稻田；除稻田外，濕地土壤周叢生物表面附著大量細菌，并以桿菌和球菌為主.

（2） 所有濕地周叢生物細菌群落豐富度較為一致，細菌多樣性和均勻度則為稻田最高，湖泊最低；水上森林和湖泊周叢生物細菌群落結構相近；濕地周叢生物優勢細菌種類為伯克氏菌科、假單胞菌科、嗜氫菌科和黃桿菌科等.

（3） 所有濕地周叢生物細菌的主要功能表現為代謝，其中稻田周叢生物細菌具有更強的萘降解能力，湖泊和農用池塘周叢生物細菌則具有更強的生物合成能力.

（4） 土壤中C，N和P能增加周叢生物細菌群落多樣性，而N和P則能提高周叢生物細菌群落均勻度；土壤pH值和AP含量是影響濕地土壤周叢生物細菌群落結構的主要驅動因子.

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（責任編輯：郁慧）