酶解提取肉鴿血液中血紅素鐵的工藝優化

摘 要：以肉鴿血液為原料，采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶和復合蛋白酶對其中的血紅素鐵進行提取。以血紅素鐵含量為主要評價指標，篩選出木瓜蛋白酶和復合蛋白酶進行復配酶解，以血紅素鐵含量和水解度為評價指標，通過單因素和正交試驗優化確定肉鴿血液血紅素鐵的最佳提取工藝，結果表明：木瓜蛋白酶、復合蛋白酶配比2∶1、pH 7.0、溫度50 ℃、血水比1∶2、總加酶量8 000 U/g、酶解時間3 h工藝下，肉鴿血液中血紅素鐵的提取量達到95.43 μg/mL，與單酶提取法相比血紅素鐵得率顯著提高，可實現肉鴿血液的高附加值利用。

關鍵詞：肉鴿血液；血紅素鐵；酶法提取；工藝優化

Optimization of the Enzymatic Extraction of Heme Iron from Pigeon Blood

ZHANG Yuanhong1， ZHANG Weijia1， LI Ying1， CHEN Liting1， CHEN Weibo2， ZENG Xiaofang1，*

（1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Lingnan Specialty Food Science and Technology， College of Light Industry and

Food Sciences， Zhongkai University of Agriculture and Engineering， Guangzhou 510225， China;

2. Meizhou Golden Green Modern Agriculture Development Co. Ltd.， Meizhou 514500， China）

Abstract： In this research， heme iron from meat-type pigeon blood was extracted by enzymatic hydrolysis using papain， neutral protease， alkaline protease， flavourzyme or protamex. Based on heme iron content， papain and protamex were selected for dual-enzymatic hydrolysis. Employing one-factor-at-a-time （OFAT） method and orthogonal array design （OAD） with heme iron content and hydrolysis degree as evaluation indicators， the optimum extraction conditions were determined as follows： papain-to-protamex ratio 2：1， pH 7.0， temperature 50 ℃， blood-to-water ratio of 1：2， enzyme dosage 8 000 U/g， and hydrolysis time 3 h. Under these conditions， the extraction yield of heme iron was 95.43 μg/mL， which was significantly increased compared with that obtained using single enzymes.

Keywords： pigeon blood; heme iron; enzymatic extraction; process optimization

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240320-059

中圖分類號：TS251.93" " " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2024）04-0017-06

引文格式：

張遠紅， 張緯嘉， 李瀅， 等. 酶解提取肉鴿血液中血紅素鐵的工藝優化[J]. 肉類研究， 2024， 38（4）： 17-22. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240320-059. http：//www.rlyj.net.cn

ZHANG Yuanhong， ZHANG Weijia， LI Ying， et al. Optimization of the enzymatic extraction of heme iron from pigeon blood[J]. Meat Research， 2024， 38（4）： 17-22. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240320-059. http：//www.rlyj.net.cn

肉鴿是我國廣東省特色優勢家禽產業，其營養豐富，素有“一鴿勝九雞”的美譽[1]，已逐步發展成為繼雞、鴨、鵝之后的第四大家禽[2]。2022年全國乳鴿出欄5.84億 只，年產量約30萬 t。肉鴿屠宰加工過程中產生大量的血液，約占肉鴿體質量6%～8%，由于難保存、血腥味重等原因，這部分血液資源通常被當作廢棄物直接排放，鮮少加工利用，造成大量的資源浪費和嚴重的環境污染[3]。

畜禽血液中含有豐富的蛋白質，約占血液干基的90%，其中60%～65%為血紅蛋白。血紅素鐵是血紅蛋白中的重要活性成分，其攜帶的鐵離子具有良好的補鐵功效[4]。缺鐵性貧血是目前臨床上最常見的貧血癥，目前全球約20%的人口存在缺鐵性貧血的癥狀[5-7]。與非血紅素鐵相比，血液中的血紅素鐵更易于被吸收和利用，其吸收率比一般補鐵劑高3 倍，生物轉化利用率高，可作為鐵強化劑的更優選擇，應用于改善缺鐵性貧血[8-9]。因此，從畜禽血液中提取血紅素鐵并將其開發為鐵強化劑應用于各類食品基質中，不僅可以顯著改善缺鐵性貧血人群的健康狀況，還能提升畜禽加工副產物的綜合利用率和附加值。

目前，血液中血紅素鐵的提取方法主要有冰醋酸法、酶水解法、鞣酸法、選擇溶劑法和羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）法等，每種方法得到的產物有所差異，工藝也存在不同的優缺點[10]。

其中冰醋酸法主要利用2 價鐵與組氨酸的配位鍵在pH＜3.5時發生斷裂、解離提取血紅素鐵，但存在溶劑使用量大、成本高、不易回收等問題；鞣酸法提取純度高達90%，通常采用5%的鞣酸作為提取劑，但所用鞣酸無法回收，生產成本較高；CMC-Na法工藝過程相對簡單，不需要使用有機溶劑，但提取純度低。酶水解法是通過蛋白酶對血紅蛋白進行水解，把蛋白質水解成多肽和氨基酸，血紅素鐵連接在多肽鏈上，一定程度上克服單體血紅素的不足，同時產生的多肽具有一定的生理功能，可以增強水解產物的功能活性和應用范圍[11-12]，且該法反應條件溫和，是目前最為綠色、環保的血紅素鐵提取方法[13]。

因此，本研究以肉鴿血液為原料，采用酶法水解提取肉鴿血液中的血紅素鐵，以血紅素鐵含量為主要篩選指標，對蛋白酶種類、酶添加量、血水比、酶解時間等工藝條件進行優化，以期得到最佳的肉鴿血液血紅素鐵酶法提取工藝，為肉鴿血液資源的開發和高附加值綜合利用提供理論和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉鴿血液由梅州市金綠現代農業發展有限公司提供。

木瓜蛋白酶（800 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）、堿性蛋白酶（200 U/mg）、風味蛋白酶（20 U/mg）、復合蛋白酶（120 U/mg）、四硼酸鈉、乙醇、鄰苯二甲醛、二硫蘇糖醇、絲氨酸、十二烷基硫酸鈉 上海源葉生物科技有限公司；氯化高鐵血紅素（純度≥90%） 美國Sigma公司；酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、硫酸銅（均為分析純） 天津大茂化學試劑廠；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

pHS-3C pH計 上海雷磁儀器有限公司；Neo 15R高速冷凍離心機 上海力申科學儀器有限公司；SHZ-B水浴恒溫振蕩器 上海博迅實業有限公司；UV-1780紫外分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州國宇儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白酶水解提取鴿血血紅素鐵技術路線

新鮮鴿血→預處理→溶血→調節血水比→調節pH值→酶解→滅酶（95 ℃、10 min）→離心（4 ℃、10 000 r/min、20 min）→取上清液→酶解液待測。

1.3.2 血紅蛋白制備

抗凝處理：以5 g/100 mL檸檬酸三鈉溶液為抗凝劑，將抗凝劑與新鮮鴿血按體積比1∶9混勻，冷藏作抗凝處理，用紗布過濾除去雜質后，密封保存于4 ℃冷藏備用。

凍融破碎：將鴿血置于－18 ℃冰箱，2 h后取出，在室溫下緩慢溶解，以破碎大部分動物性的細胞及細胞內的顆粒，并于5 000 r/min下離心20 min，收集上層紅細胞液，并將其作為原料進行酶解實驗。

1.3.3 血紅蛋白含量的測定

采用雙縮脲法對紅細胞液中的蛋白質含量進行測定[14]。

標準曲線的繪制：首先配制10 mg/mL標準牛血清蛋白溶液備用，分別吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL配制好的標準蛋白溶液于試管中，加入超純水補充至1 mL，最后在各樣液試管中分別加入4 mL的雙縮脲試劑，渦旋混勻后，反應30 min。反應結束后，使用分光光度計于540 nm波長處快速進行比色測定。采用3 組平行的實驗方法分別進行測定，并以其蛋白含量和測得吸光度繪制標準曲線，得到的蛋白含量標準曲線方程為

y＝0.046 7x＋0.079 4（R2＝0.999 2）。將樣品的質量濃度調節至曲線的線性范圍內，血紅蛋白含量按式（1）計算：

（1）

式中：ρ為蛋白質量濃度/（mg/mL）；V為血清樣品體積/mL；n為稀釋倍數。

1.3.4 血紅素鐵含量的測定

采用紫外-可見分光光度法測定血紅素鐵含量[15]。準確稱取1.0 mg氯化高鐵血紅素，使用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液進行溶解，稀釋并定容至100 mL后，充分搖勻，以此作為10 μg/mL標準儲備液。分別取0、1、2、4、6、8、10 mL標準儲備液，使用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液定容至10 mL，稀釋為不同質量濃度，渦旋混勻后，用

0.1 mol/L氫氧化鈉溶液作空白調零，從低質量濃度到高質量濃度依次于385 nm波長處測定吸光度[16]。繪制的卟啉鐵濃度-吸光度標準曲線方程為：y＝0.055 1x＋0.017 9（R2＝0.997 4）。將樣品質量濃度調整到標準曲線線性范圍內即可測定其血紅素鐵含量。

1.3.5 水解度（degree of hydrolysis，DH）的測定

參考張建萍等[17]方法，采用鄰苯二甲醛法測定DH。DH是指特定條件下蛋白質被水解為小分子肽時，斷裂的肽鍵數在蛋白質總肽鍵數中的占比[18]，通過

式（2）～（4）計算：

（2）

（3）

（4）

式中：Cserine-NH2為L-絲氨酸含量/（mmol/g）；V為原始水解液體積/μL；n為水解液稀釋倍數；X為制備樣品體積/μL；Y為樣品中蛋白含量/（mmol/g）；h為每克蛋白斷裂產生的肽鍵數/（mmol/g）；Htot為蛋白中總肽鍵數

（Htot＝8 mmol/g）；α、β均為修正因子，α＝1.00，β＝0.4。

1.3.6 酶解工藝條件優化

1.3.6.1 酶種類篩選試驗

選取木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶、復合蛋白酶和中性蛋白酶，參照表1的酶解條件對上述處理的肉鴿血液樣品進行酶解。肉鴿血液樣品的pH值分別調節至各酶的最適pH值條件。酶解結束后測定各酶解產物的DH，并以血紅素鐵含量作為主要評價指標，從中選取2 種酶作為復配用酶進行雙酶酶解。

1.3.6.2 酶配比對肉鴿血液酶解的影響

在總加酶量6 000 U/g、酶解時間3 h、血水比1∶3（m/m）、溫度50 ℃、pH 7.0下，探究不同酶（木瓜蛋白酶∶復合蛋白酶）配比（1∶0、1∶1、1∶2、2∶1、0∶1）對肉鴿血液蛋白質DH與血紅素鐵含量的影響。

1.3.6.3 pH值對肉鴿血液酶解的影響

在不同pH值（6.5、7.0、7.5、8.0）下進行酶解，其余酶解條件為總加酶量6 000 U/g、酶配比2∶1、酶解時間3 h、血水比1∶3（m/m）、溫度50 ℃。

1.3.6.4 血水比對肉鴿血液酶解的影響

在不同血水比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，m/m）下分別酶解，其余酶解條件為酶配比2∶1、總加酶量6 000 U/g、酶解時間3 h、溫度50 ℃、pH 7.0。

1.3.6.5 總加酶量對肉鴿血液酶解的影響

在不同總加酶量（2 000、4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g）下分別酶解，其余酶解條件為酶配比2∶1、酶解時間3 h、血水比1∶3（m/m）、溫度50 ℃、pH 7.0。

1.3.6.6 酶解時間對肉鴿血液酶解的影響

酶解不同時間（2、3、4、5 h），其余酶解條件為酶配比2∶1（m/m）、總加酶量6 000 U/g、血水比1∶3（m/m）、溫度50 ℃、pH 7.0。

1.3.6.7 正交試驗工藝優化設計

根據單因素試驗結果，選取血水比（A）、酶解時間（B）和總加酶量（C）為試驗因素，以血紅素鐵含量、DH為篩選指標，采用L9（34）正交試驗確定最佳酶解工藝。正交試驗因素水平見表2。

1.4 數據處理

每組數據經過3 次平行測定，結果使用平均值±標準差形式表示，采用SPSS 22.0軟件進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。使用Origin 2022軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶種類對血紅蛋白DH和血紅素鐵含量的影響

酶種類的選擇是影響蛋白質酶解效率的關鍵因素[19]，不同酶作用于不同水解肽鍵位點，從而得到不同酶解特性的水解產物[20-21]。如圖1所示，5 種酶中DH最大的是風味蛋白酶，其次是木瓜蛋白酶，堿性蛋白酶和復合蛋白酶的DH差異不顯著（P＞0.05），中性蛋白酶DH最低。風味蛋白酶因其同時存在內切酶和外切酶2 種酶的酶切位點，酶外切作用產生更多游離氨基酸[22]，其DH顯著高于其他蛋白酶（P＜0.05），但是其酶解上清液含量較少，蛋白回收率較低。從酶解后得到的血紅素鐵含量可以看出，木瓜蛋白酶得率最高，含量為57.23 μg/mL；其次是風味蛋白酶和復合蛋白酶。考慮到風味蛋白酶蛋白回收率較低，本研究選用木瓜蛋白酶和復合蛋白酶進行后續雙酶酶解試驗。

小寫字母不同表示DH差異顯著（P＜0.05）；大寫字母不同表示血紅素鐵含量差異顯著（P＜0.05）。下同。

2.2 酶配比對血紅蛋白DH和血紅素鐵含量的影響

如圖2所示，木瓜蛋白酶與復合蛋白酶的配比不同，肉鴿血液的DH與血紅素鐵含量也產生相應變化，在酶配比為2∶1時達到最高，分別為13.93%與70.24 μg/mL，顯著高于其他酶配比（P＜0.05）。說明在給定pH值和溫度下，增大木瓜蛋白酶的比例有助于酶解效率的提高。而使用單一蛋白酶進行酶解的效果不如雙酶酶解，后者從肉鴿血液中提取出的血紅素鐵含量比單酶酶解提升約22.73%。原因是組合使用蛋白酶進行酶解時能夠增加酶切位點，擴大作用范圍[23-24]。根據試驗結果，選擇酶配比為2∶1作為后續試驗條件。

2.3 pH值對血紅蛋白DH和血紅素鐵含量的影響

不同pH值對酶解效率有較大的影響，當pH值處于最適范圍時，酶活性會有所提高[25]。因此有必要對雙酶酶解作用的pH值進行優化。如圖3所示，隨著pH值的增加，肉鴿血液的DH呈現先增加后降低的趨勢，在pH 7.0時達到最大值，且差異顯著（P＜0.05）。這和木瓜蛋白酶和復合蛋白酶的最適pH值在中性附近有關[26]。血紅素鐵的含量隨pH值、DH的變化規律類似，表明血紅素鐵的含量和肉鴿血紅蛋白的水解程度密切相關。根據試驗結果，2 種指標在pH 7.0時達到最大值，故選擇pH 7.0作為下一步的試驗條件。

2.4 血水比對血紅蛋白DH和血紅素鐵含量的影響

肉鴿血液和水的混合比例關系到酶解反應的底物濃度，直接影響蛋白酶對底物的水解效果[27]。如圖4所示，血水比1∶1時，因底物即血紅蛋白濃度過高，酶的擴散受到限制，部分血紅蛋白沒有被有效水解，酶的水解反應發生抑制效應[28]，從而使血紅素鐵含量和DH較低；當血水比為1∶2時，底物濃度最合適，此時底物可以與酶進行充分反應，血紅蛋白可以在此條件下進行充分、有效的水解。之后，隨著血水比增加至1∶3、1∶4時，底物濃度逐步降低，酶與底物的接觸減少，反應效率也下降。因此，選擇血水比1∶2酶解效果最好。

2.5 總加酶量對血紅蛋白DH和血紅素鐵含量的影響

當酶用量過少時，反應速率會受到限制，隨著酶用量增大，酶水解效率提高。由圖5可知，隨著總加酶量的提高，能參與底物反應的酶也較多，因此整體有正向促進作用，水解效率隨之增加。總加酶量為6 000 U/mg時，所提取出的血紅素鐵含量達到最大，為69.64 μg/mL。當總加酶量繼續增大時，由于底物濃度不變，底物與酶作用趨于飽和，這時再提高酶用量并不能明顯提高酶促效應，相反，此時過高的酶濃度會引起酶自溶，反而產生一定的負效應[29-30]。說明6 000 U/g是一個重要的拐點，超過這個點反而會產生負效應。因此，選用6 000 U/g作為酶添加量。

2.6 酶解時間對血紅蛋白DH和血紅素鐵含量的影響

由圖6可知，隨著酶解時間的延長，DH不斷增加，酶解至4 h時，DH達到13.51%，進一步延長酶解時間，DH無顯著增加（P＞0.05），說明此時底物蛋白質的有效酶切部位已得到較充分地水解。血紅素鐵含量隨著酶解時間的延長緩慢增加。在酶解至4 h時，血紅素鐵含量達到最大，為71.4 μg/mL。此后，血紅素鐵含量呈現下降的趨勢。這可能是由于蛋白質在降解過程中產生大量中間產物，從而產生產物抑制，使得血紅素鐵得率降低[31]。為提高血紅素鐵含量，必須控制好酶解時間，綜合考慮，4 h為最佳水解時間。

2.7 正交試驗結果

選取對血紅素鐵含量和DH影響較大的工藝條件：血水比、酶解時間和總加酶量3 個因素進行3水平正交試驗，由表3可知，R值說明不同因素對血紅素鐵含量的影響次序為A＞C＞B，即血水比＞總加酶量＞酶解時間。通過K值可知，以血紅素鐵含量為篩選指標得到的最佳酶解工藝為A2B1C3，即血水比1∶2、酶解時間3 h、總加酶量8 000 U/g；同時，以DH為評價指標得出R’值，可知在DH的影響因素中，血水比同樣是第1位，酶解時間作用次之，而總加酶量對DH的影響最小，主次順序為A＞B＞C，最佳工藝條件為A1B3C2，即血水比1∶1、酶解時間5 h、總加酶量6 000 U/g。

對正交試驗所得的2 組最優條件組合進行驗證。其中以酶解后所提取的血紅素鐵含量為指標所得出的A2B1C3組合的血紅素鐵提取量為95.43 μg/mL，DH為18.41%。以DH為指標得出的A1B3C2組合條件進行酶解后，所得血紅素鐵提取量為56.72 μg/mL，DH為30.93%。因此正交試驗得到的2 組最優組合條件下血紅素鐵含量和DH均最高，說明正交試驗結果可信。2 個指標之間以血紅素鐵含量為首要評價指標，因此得到最佳血紅素鐵提取工藝為A2B1C3，即血水比1∶2、酶解時間3 h、總加酶量8 000 U/g，在此條件下得到的血紅素鐵含量比單一酶解所得的含量提高66.74%，顯著提升了肉鴿血液中血紅素鐵的提取量。

3 結 論

利用生物蛋白酶水解從肉鴿血液中提取血紅素鐵，以DH和血紅素鐵含量作為優化指標，對酶解工藝條件進行優化。雙酶復配酶解工藝研究結果表明，不同血水比產生的血紅素鐵含量差異較顯著，水解效果明顯；酶添加量對血紅素鐵產量影響較大，對于DH影響不顯著，在4 000～8 000 U/g范圍內均可進行有效水解。最終確定雙酶酶解血紅素鐵的最佳提取工藝為：木瓜蛋白酶、復合蛋白酶配比2∶1、pH 7.0、血水比1∶2、總加酶量8 000 U/g、溫度50 ℃、酶解時間3 h，在此條件下對肉鴿血液進行雙酶酶解后，血紅素鐵提取量為95.43 μg/mL，DH為18.41%，效果最佳。與單酶酶解相比，雙酶酶解的血紅素鐵提取率提高約66.74%，說明雙酶酶解能夠有效提高血紅素鐵的提取量。

雙酶酶解法能夠提高血紅素鐵提取量，并且適用于工業化方法和設備，適合大規模生產，為提高肉鴿血液資源利用及減少資源、環境污染提供一條合理的新途徑，對經濟、環保具有重大的可持續發展意義。未來針對血紅素鐵在不同提取條件下的穩定性及產品開發應用方面仍需更進一步的研究。

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