全基因組測序分析生畜肉中沙門氏菌血清型、耐藥性與毒力因子

摘 要：了解市售生畜肉中沙門氏菌（Salmonella）血清型、序列型（sequence typing，ST）分布、耐藥性和毒力因子特征，探討ST與耐藥性和毒力的關系。收集2020—2023年從生畜肉中分離的68 株沙門氏菌，用血清凝集法鑒定其血清型，微量肉湯稀釋法進行藥物敏感檢測；全基因組測序分析多位點序列分型、耐藥基因與毒力因子，并結合系統發育樹分析其相關性。結果表明：68 株沙門氏菌可分為14 種血清型，以鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌為主，ST以ST19、ST34和ST11為主；多重耐藥菌株占比69.12%（47/68），對氨芐西林（76.47%）、四環素（55.88%）和萘啶酸（52.94%）耐藥率較高；68 株沙門氏菌均攜帶菌毛吸附相關因子、鎂離子轉運相關因子、非菌毛類吸附相關因子、調控相關因子和分泌系統相關因子；生畜肉中污染的沙門氏菌血清型種類多樣，耐藥性嚴重且攜帶多種毒力因子，需要加強畜類養殖和生產銷售的管理。

關鍵詞：沙門氏菌；全基因組測序；序列型；耐藥性；毒力因子

Analysis of Serotypes， Drug Resistance and Virulence Factors of Salmonella in Raw Meat by Genome-Wide Sequencing

LIU Liang， LI Bingbing， LI Jie， LI Shuangshu， SUN Min， YANG Pengfei， XING Yadong， CHEN Dawei*

（Jiangsu Provincial Key Laboratory for Food Safety Risk Monitoring （Pathogenic Bacteria）， Huai’an Center for Disease Control and Prevention， Huai’an 223003， China）

Abstract： This study aimed to investigate the serotype and sequence type （ST） distribution， drug sensitivity and virulence factors of Salmonella in raw meat and to explore the relationship between ST and drug resistance and virulence factors. In total， 68 Salmonella strains isolated from raw meat from 2020 to 2023 were serotyped by serum agglutination， and their drug susceptibility was detected by the broth micro-dilution method. Genome-wide sequencing was used for analysis of multilocus sequence typing （MLST）， drug resistance genes and virulence factors， and the correlation between ST and drug resistance and virulence factors was analyzed by constructing phylogenetic tree. Our results showed that the 68 Salmonella strains were divided into 14 serotypes， with Salmonella typhimurium and Salmonella enteritidis being the main ones， and ST19， ST34 and ST11 were the predominant sequence types. A total of 47 （69.12%） out of the 68 strains were multi-drug resistant， and the drug resistance rates to ampicillin （76.47%）， tetracycline （55.88%） and nalidixic acid （52.94%） were high. All 68 Salmonella strains carried virulence factors related to fimbrial adherence， magnesium ion transport， nonfimbrial adherence， regulation， and the secretion system. A variety of Salmonella serotypes having serious drug resistance and carrying many virulence factors could contaminate raw meat. Therefore， efforts should be made to strengthen the management of livestock breeding， meat production and sales.

Keywords： Salmonella; whole genome sequencing; sequence type; drug resistance; virulence factors

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240421-089

中圖分類號：R378.2" " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2024）04-0023-07

引文格式：

劉靚， 李兵兵， 李潔， 等. 全基因組測序分析生畜肉中沙門氏菌血清型、耐藥性與毒力因子[J]. 肉類研究， 2024， 38（4）： 23-29. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240421-089." " http：//www.rlyj.net.cn

LIU Liang， LI Bingbing， LI Jie， et al. Analysis of serotypes， drug resistance and virulence factors of Salmonella in raw meat by genome-wide sequencing[J]. Meat Research， 2024， 38（4）： 23-29. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240421-089." " http：//www.rlyj.net.cn

沙門氏菌是世界上最常見的食源性病原體之一，可引起人和動物的多種疾病，如胃腸炎、副傷寒和傷寒等[1-2]，目前已經有2 600多種血清型被確認。受污染的動物源食品，如家禽肉、雞蛋和乳制品，被認為是沙門氏菌感染的主要來源[3-4]。據世界衛生組織報道，沙門氏菌每年導致全球9 380多萬例胃腸炎，以及155 000多人死亡[5]。腸炎沙門氏菌與鼠傷寒沙門氏菌一直被列為世界上與人類疾病相關的最常見的2 種血清型。這2 種血清型占全球人類沙門氏菌病的比例超過40%，在中國比例超過30%[6]，在美國這一比例約為20%[7]。腸炎沙門氏菌感染的臨床表現多樣，包括自限性小腸結腸炎、急性胰腺炎及具有高死亡率的侵襲性感染[8]。鼠傷寒沙門氏菌感染能夠導致腸胃炎及血流感染，可感染肝臟及脾臟等器官[9]。

過去幾十年，隨著抗生素的頻繁使用，耐藥性沙門氏菌的出現及傳播對公共衛生構成了極大威脅，且多重耐藥菌株也已經普遍存在。研究表明，我國禽源沙門氏菌對氨芐西林、四環素、萘啶酸等的耐藥率均超過50%[10]；在美國，同時耐受氨芐西林、鏈霉素、新諾明和四環素的多重耐藥菌株比例從2009—2013年的1.1%上升到2014—2018年的2.6%[11]。沙門氏菌還攜帶有多種毒力基因，如毒力島、鞭毛、菌毛和腸毒素等，毒力基因復雜多樣；正是由于沙門氏菌多種毒力基因的表達導致沙門氏菌致病性的多樣化，同時由于沙門氏菌攜帶多種質粒等可移動原件，導致其耐藥基因及毒力基因的傳播[12]。

本研究利用全基因組測序手段分析2020—2023年68 株分離自生畜肉中的沙門氏菌，鑒定血清型，檢測藥物敏感性，從全基因組水平分析其耐藥基因和毒力因子以及序列型（sequence typing，ST）與耐藥和毒力的關系，為了解生畜肉中沙門氏菌的流行情況及其防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用沙門氏菌菌株分離自2020—2023年風險監測項目生畜肉，包括牛肉、羊肉和豬肉，其中2020年采集的159 份樣本分離出13 株、2021年采集的262 份樣本分離出20 株、2022年采集的275 份樣本分離出15 株、2023年采集的256 份樣本分離出20 株。

1.2 儀器與設備

GelDoc XR Biorad凝膠成像系統 伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；DH209L電熱恒溫培養箱 天津泰斯特儀器有限公司；Phoenix-M50全自動微生物鑒定藥敏分析系統、Phoenix革蘭氏陰性藥敏檢測板 碧迪醫療器械（上海）有限公司；沙門氏菌鑒定分型診斷血清套裝 丹麥國家血清研究院；022070平板計數瓊脂干粉" "廣東環凱微生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血清型鑒定

按照血清凝集方法，對沙門氏菌分離株進行血清型鑒定；根據得到的O、H1和H2抗原數據，按照考夫曼-懷特沙門氏菌屬抗原表判定沙門氏菌分離株血清型。

1.3.2 藥敏實驗

利用全自動微生物鑒定藥敏分析系統對68 株沙門氏菌進行青霉素類（氨芐西林（ampicillin，AMP））、β-內酰胺類（氨芐西林/舒巴坦（ampicillin/sulbactam，AMS））、頭孢類（頭孢噻肟（cefotaxime，CTX）、頭孢他啶（ceftazidime，CAZ））、磺胺類（復方新諾明（cotrimoxazole，SXT））、四環素類（四環素（tetracycline，TE））、氨基糖苷類（阿米卡星（amikacin，AMI））、大環內酯類（阿奇霉素（azithromycin，AZM））、碳氫霉烯類（厄他培南（ertapenem，ETP）、美羅培南（meropenem，MEM））、苯丙醇類（氯霉素（chloramphenicol，CHL））、氟喹諾酮類（環丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、萘啶酸（nalixic acid，NAL））10 大類、13 種抗菌藥物進行最小抑菌濃度實驗。耐3 類及以上藥物的菌株為多耐藥菌株，耐5 類及以上藥物的菌株為高耐藥菌株，藥敏結果參照美國臨床和實驗室標準化協會規定的標準判定是否耐藥。

1.3.3 全基因組多位點序列分型（complete genome multilocus sequencetyping，cgMLST）實驗

按照Stepan等[13]的方法將68 株全基因組測序后的沙門氏菌上傳至http：//enterobase.warwick.ac.uk/species/senterica/allele_st_search網站，比對aroC、dnaD、hemD、hisD、purE、sucA和thrA 7 個管家基因，查詢管家基因的基因位點編號，由7 個管家基因位點編號判斷分離株的ST。將68 株沙門氏菌的全基因組測序拼接草圖上傳至http：//bacdb.cn網站[14]，用cgMLST V2算法構建最小生成樹和聚類樹，將全基因組序列上傳至https：//cge.cbs.dtu.dk//services/ResFinder/進行耐藥基因的注釋（一致性≥90%，覆蓋度≥60%），毒力基因的注釋與分類在http：//www.mgc.ac.cn/cgi-bin/VFs/v5/main.cgi網站完成。

1.4 數據處理

數據處理與分析利用Origin 8.0和Chiplot在線作圖軟件完成[15]，差異顯著性分析采用卡方檢驗法。

2 結果與分析

2.1 血清型與多位點序列分型（multilcous sequence typing，MLST）結果

如表1所示，68 株沙門氏菌分離株經鑒定分屬14 種血清型。其中，27 株為鼠傷寒沙門氏菌，占比39.71%，22 株為腸炎沙門氏菌，占比32.35%，為2 種優勢血清型；其次為圣保羅沙門氏菌（4/68，5.89%），阿貢那沙門氏菌、布倫登盧普沙門氏菌、黃金海岸沙門氏菌和湯普遜沙門氏菌各2 株，占比2.94%，病牛沙門氏菌、里森沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、倫敦沙門氏菌、維爾肖沙門氏菌、新斯托夫沙門氏菌和乙型副傷寒沙門氏菌均為1 株，占比1.47%。68 株沙門氏菌經比對鑒定有12 種ST，鼠傷寒沙門氏菌（n＝27）的ST主要為ST19

（n＝15）和ST34（n＝11），另外還有ST26（n＝1）；

腸炎沙門氏菌（n＝22）的ST為ST11（n＝22）；圣保羅沙門氏菌（n＝4）的ST有ST49（n＝2）和ST27（n＝2）；阿貢那沙門氏菌（n＝2）、布倫登盧普沙門氏菌（n＝2）、黃金海岸沙門氏菌（n＝2）和湯普遜沙門氏菌（n＝2）的ST分別為ST13（n＝2）、ST22（n＝2）、ST358（n＝2）、ST26（n＝2）。

如圖1所示，本研究從生畜肉中分離到的沙門氏菌血清型以鼠傷寒沙門氏菌占比最多，其次為腸炎沙門氏菌，這與吳海晶等[16]從豬肉中分離到的鼠傷寒沙門氏菌占比最多保持一致，其余血清型存在一定的差異

性，本研究中發現的沙門氏菌優勢血清型為鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌，流行ST為ST19、ST34和ST11，這與張捷[17]、毛旭建[18]等報道我國流行的沙門氏菌優勢血清型基本相同，與Turcotte等[19]報道美國分離的沙門氏菌ST19、ST11、ST32型基本相同，血清型存在一定差異。由此可知，我國生畜肉中目前流行的沙門氏菌以鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌為主，ST19和ST11為流行沙門氏菌ST。

2.2 耐藥性與耐藥基因測定結果

如圖2所示，68 株沙門氏菌對AMP的耐藥率最高，為76.47%；其次為TET和NAL，耐藥率為55.88%和52.94%；對CHL、SXT和AMS的耐藥率均在30%以上，對CTX和AZM的耐藥率約為20%，對CAZ和CIP的耐藥率約為15%；68 株沙門氏菌對碳氫霉烯類ETP和MEM以及氨基糖苷類AMI均無耐藥性；雖然對CIP的耐藥率較低，但是中介占比較高，達到64.71%，對AMS的耐藥中介占比為41.18%。

如表2所示，2020—2023年共47 株為多耐藥菌株，占69.12%，其中2020年6 株（46.15%）、2021年13 株（65.00%）、2022年10 株（66.67%）、2023年18 株（90.00%）；2020—2023年共16 株為高耐藥菌株，占23.53%，其中2020年0 株（0%）、2021年4 株（20.00%）、2022年3 株（20%）、2023年9 株（45.00%）；多耐藥和高耐藥菌株占比呈現出一定的上升態勢。耐藥譜為CHL-SXT-TET-AMP的菌株有10 株（14.71%），是耐藥譜中占比最多的，有6 株菌對檢測用藥物全部敏感。

本研究選取10 大類13 種抗生素進行藥物敏感實驗，結果表明，沙門氏菌對AMP、TET和NAL耐藥較嚴重，3 重及以上耐藥菌株占比69.12%（47/68），說明生畜肉中沙門氏菌耐藥嚴重，這與朱坤鵬等[20]報道廣東雞肉源沙門氏菌耐藥性相似，與王雪嬌等[21]報道天津市濱海新區食源性疾病主動監測沙門氏菌耐藥結果也類似。本研究中所分離的沙門氏菌對碳氫霉烯類ETP和MEM以及氨基糖苷類AMI均無耐藥性，這與劉建忠等[22]報道的福建泉州引起食源性腹瀉的沙門氏菌對AMI耐藥嚴重不一致，這說明沙門氏菌的耐藥性與地域有一定關系。由此可見，生畜肉中沙門氏菌對青霉素類AMP、四環素類TET和NAL耐藥嚴重，提示在生畜養殖中要加強對這3 類抗生素的使用管理。同時本研究中的沙門氏菌對碳氫霉烯類ETP和MEM無耐藥性，提示由沙門氏菌引起的生畜疾病中可合理使用碳氫霉烯類抗生素治療管理。

如表3所示，大部分菌株對檢測用的抗生素耐藥性均由1～2 種耐藥基因所介導。對CHL耐藥的26 株沙門氏菌中，出現3 種耐藥基因型，主要基因型為floR。對SXT耐藥的22 株沙門氏菌中，出現4 種耐藥基因型，主要為sul2。對碳氫霉烯類ETP和MEM耐藥菌株數量為0，同時也沒有檢測到相應的耐藥基因。對頭孢類CTX和CAZ耐藥的菌株分別為15、10 株，出現耐藥基因型5 種，主要為blaCTX-M-14和blaCTX-M-55。對TET耐藥的38 株沙門氏菌中發現3 種基因型，主要為tet（A）。對氟喹諾酮類CIP和NAL耐藥的菌株分別為9、36 株，CIP的耐藥基因型有3 種，qnrS1為主要基因型，未檢測到NAL的對應耐藥基因。對AZM和AMI耐藥的菌株與基因型一致性較低，對AZM耐藥但只有1 株檢測到對應耐藥基因，68 株沙門氏菌均攜帶aac（6’）-Iaa基因，但對AMI均無耐藥性。對AMP和AMS耐藥的菌株分別檢出8、4 種基因型，均以blaTEM-1B為主要基因型。

本研究中大部分沙門氏菌的耐藥表型均由1～2 種耐藥基因所介導，即大部分菌株的耐藥性由基因水平介導。這與華德等[23]報道的沙門氏菌耐藥基因與耐藥表型基本一致的結論相符，該研究中的63 株沙門氏菌均攜帶aac（6’）-Iaa基因，只有6 株具有對氨基糖苷類慶大霉素的耐藥性，與本研究中結果類似；這表明aac（6’）-Iaa基因在氨基糖苷類藥物耐藥中不是起到主要作用。本研究中68 株沙門氏菌對AZM耐藥的有13 株，耐藥率為19.12%，只有1 株發現相關的耐藥基因，這與Chiou等[24]

報道76 株AZM耐藥沙門氏菌只有1 株未檢測到相關耐藥基因結果不一致，但他們也發現有26 株中介耐藥菌株未檢測到相關耐藥基因；AZM和碳氫霉烯類藥物是臨床上治療多重耐藥沙門氏菌引起的侵襲性沙門氏菌病的最后手段，非基因水平介導的AZM耐藥機制值得深入探究。由此可知，生畜中沙門氏菌的耐藥基本由基因水平介導，需要加強在生畜養殖中抗生素的合理使用和管理，同時對于非基因水平介導的抗生素抗性需要進一步研究其機制，不同菌株間是否具有轉移性和共性。

2.3 全基因組毒力因子分析

為了解68 株沙門氏菌的致病性譜，將68 株沙門氏菌全基因組測序結果上傳至VFDB網站，所得注釋結果經統計后如圖3所示，68 株沙門氏菌所攜帶的毒力基因按照功能可分為11 大類，分別為：菌毛吸附、鎂離子轉運、非菌毛吸附、調控相關、分泌系統、前噬菌體、壓力適應性、血清抗性、毒素、轉運蛋白相關因子和侵襲素。其中，68 株沙門氏菌均攜帶的毒力因子有菌毛吸附相關：Agf、Bcf、Fim、Stb、Std、Sth、Sti，鎂離子轉運相關：Mg2＋ transport，非菌毛類吸附相關：MisL、SinH，調控因子相關：PhoPQ，分泌系統相關：TTSS（SPI-1"encode）、TTSS（SPI-2 encode）、TTSS effectors、TTSS-1 effectors、TTSS-2 effectors；67 株攜帶Saf、Stf、Mig-14；65 株攜帶Lpf、ShdA；63 株攜帶RatB；57 株攜帶SodCI；這些毒力因子被大多數沙門氏菌所攜帶。

此外，3 株攜帶由cdtB基因編碼的傷寒毒素，其中2 株黃金海岸沙門氏菌和1 株病牛沙門氏菌，31 株攜帶由spvB基因編碼的SpvB毒力因子，其中8 株鼠傷寒沙門氏菌占比29.63%（8/27），22 株腸炎沙門氏菌占比100%（22/22），1 株都柏林沙門氏菌；6 株攜帶Invasin A，其中4 株腸炎沙門氏菌、1 株鼠傷寒沙門氏菌、1 株都柏林沙門氏菌；15 株攜帶Ibes，其中12 株鼠傷寒沙門氏菌占比44.44%（12/27）、1 株乙型副傷寒沙門氏菌、1 株里森沙門氏菌、1 株都柏林沙門氏菌；7 株攜帶AFA-I，其中4 株圣保羅沙門氏菌占比100%（4/4）、1 株鼠傷寒沙門氏菌、1 株新斯托夫沙門氏菌、1 株阿貢那沙門氏菌，35 株攜帶LPS O-抗原，其中21 株腸炎沙門氏菌占比95.45%（21/22），3 株鼠傷寒沙門氏菌；28 株攜帶EhaB，其中腸炎沙門氏菌21 株，占比95.45%（21/22），29 株攜帶與VI型分泌系統相關的毒力因子，其中腸炎沙門氏菌22 株，占比100%（22/22），鼠傷寒沙門氏菌2 株。

本研究中68 株沙門氏菌主要毒力因子與吸附、轉運、分泌系統及壓力適應性等相關，這與Yan Shigan等[25]報道的243 株沙門氏菌毒力因子中與黏附、效應子遞送系統、免疫調節、運動和營養/代謝因素相關的菌株占84.63%結果類似；梁麗等[26]報道的鼠傷寒沙門氏菌毒力因子主要與細菌黏附、毒素、分泌系統、血清抗性和免疫逃避等相關，不同菌株之間毒力基因也存在顯著差異；與本研究中沙門氏菌毒力因子大部分相同、少部分為個別菌株特有結果一致。這表明沙門氏菌大部分毒力因子趨于穩定，少量毒力因子變化較大。變化較大的毒力因子主要與侵襲、轉運、毒素及吸附相關，需要加強對這幾類毒力因子的監測分析。

2.4 ST與耐藥和毒力關聯性分析

已有研究表明，沙門氏菌的毒力和耐藥存在一定的關聯性。為探究本研究中68 株沙門氏菌ST、毒力和耐藥的關系，將沙門氏菌攜帶的毒力基因和耐藥基因、實際耐藥重數和ST統計后結合單核苷酸多態性進化樹進行分析。如圖4所示，系統發育樹將68 株沙門氏菌分為4大支，部分ST19為一支、部分ST19與ST34為一支、ST11為一支、其他ST為一支；總體上攜帶耐藥基因數量與實際耐藥重數成正比；ST11攜帶毒力因子最多，ST34攜帶毒力因子最少。具體來看，ST19進化分為2 個方向：一是攜帶更少毒力因子，耐藥性增強，二是攜帶更多毒力因子，耐藥性減弱；ST34攜帶毒力因子少但耐藥性強；ST11則是攜帶毒力因子多的同時耐藥性也強；ST49耐藥性弱，攜帶毒力因子數量較多；ST27攜帶耐藥基因和毒力因子數量均較多；ST358耐藥性強但攜帶毒力因子數量少；ST13攜帶毒力因子多且耐藥性強；ST155攜帶耐藥基因數量較少但其實際耐藥重數較多，且攜帶毒力因子數量較多；ST22耐藥性弱且攜帶毒力因子較少；2 株ST26耐藥性強，攜帶耐藥基因數量較少，1 株ST26則耐藥性相對較弱，但毒力因子攜帶數量較多。

據報道，沙門氏菌的毒力與攜帶的毒力因子數量成正比[27-29]，這說明ST11型腸炎沙門氏菌實際毒力很強。Wang Xufeng等[30]通過沙門氏菌感染小鼠腸道發現，鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌對小鼠腸道的損傷強于其他幾種血清型沙門氏菌。Li Yan等[31]報道，在研究的8 種血清型沙門氏菌中腸炎沙門氏菌攜帶最多種類的質粒，也就意味著腸炎沙門氏菌攜帶更多種類的耐藥基因和毒力基因，與本研究結果一致。這表明腸炎沙門氏菌在向毒力增強和耐藥性增強的方向進化，雖然鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌是與人類感染密切相關的2 種沙門氏菌，從本研究中的耐藥和毒力分析結果來看，腸炎沙門氏菌的威脅性更大。以往監測中主要關注其耐藥性的變化，從本研究結果來看，一方面要監測其抗生素抗性的變化，另一方面要監測其毒力基因攜帶情況的變化。

3 結 論

本研究對分離自生畜肉中的68 株沙門氏菌的分型結果表明，鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌是生畜肉中沙門氏菌的主要血清型，ST19、ST34和ST11是流行ST。藥物敏感性試驗結果表明，68 株沙門氏菌多重耐藥菌株占比69.12%（47/68），對氨芐西林（76.47%）、四環素（55.88%）和萘啶酸（52.94%）耐藥率較高，大部分菌株對所檢測用的抗生素耐藥性均由1～2 種耐藥基因介導。毒力因子分析表明，沙門氏菌攜帶多種類型的毒力因子，與細菌黏附、毒素、分泌系統、血清抗性和免疫逃避等相關的毒力因子最多。ST與耐藥和毒力關聯性分析表明，ST11型腸炎沙門氏菌攜帶更多的毒力因子且耐藥性強。綜上，市售生畜肉中沙門氏菌血清型和ST分布廣泛，耐藥性嚴重同時攜帶多種毒力因子，提示要加強對畜類飼養環節抗生素的合理使用和生產銷售環節的管理。

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