促生菌黃漿水培養(yǎng)基優(yōu)化及發(fā)酵菌液對(duì)種子萌發(fā)的影響

摘 要：

黃漿水含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)其資源再利用具有重要意義。通過水解圈的定性分析及氨氮含量的定量測定以篩選具氨化及溶磷作用的促生菌菌株，通過單因素、正交試驗(yàn)對(duì)2個(gè)菌株的黃漿水發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，利用2個(gè)菌株的發(fā)酵菌液對(duì)黑麥草及苜蓿種子進(jìn)行浸種以分析其對(duì)種子萌發(fā)的影響。結(jié)果表明：惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）HGD3和吡咯伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pyrrocinia） P10具有較強(qiáng)的氨化能力和溶磷性。在含40%黃漿水的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，HGD3和P10菌株發(fā)酵液的氨氮濃度分別為894.92 mg/L和546.49 mg/L，較優(yōu)化前分別提高6.79和2.60倍。HGD3和P10菌株發(fā)酵液的浸種均顯著地提高了黑麥草和苜蓿種子的發(fā)芽率，苜蓿種子的發(fā)芽率較對(duì)照分別提高了34.51%和24.36%；黑麥草種子的發(fā)芽率分別提高了32.66%和18.85%，且萌發(fā)黑麥草的芽長分別增長1.57倍和0.77倍、根長分別增長了1.53倍和0.91倍。惡臭假單胞菌HGD3的黃漿水發(fā)酵液可以顯著地促進(jìn)黑麥草和苜蓿種子的萌發(fā)，尤以黑麥草為甚，研究結(jié)果為黃漿水的再利用及促生菌菌株對(duì)種子的促萌發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：

黃漿水；促生菌；黑麥草；苜蓿；種子萌發(fā)

中圖分類號(hào)：Q939.96

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008－0457（2024）04－0076－10

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2024.04.011

豆制品生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢水也叫黃漿水，屬于高濃度化學(xué)需氧量（Chemical Oxygen Demand，COD）及生物需氧量（Biochemical Oxygen Demand，BOD）有機(jī)廢水，據(jù)統(tǒng)計(jì)，每利用1 t大豆要排放廢水30～50 m3，國內(nèi)豆制品企業(yè)每年的大豆廢水排放量至少300萬t，排放量大且環(huán)境污染嚴(yán)重［1-3］。對(duì)于大豆加工類廢水的處理大多采用生物處理，厭氧-好氧組合的工藝可以使得出水水質(zhì)達(dá)標(biāo)［4-5］。近年來，廢棄物資源化處理的研究逐漸增多，利用廢棄物進(jìn)行微生物發(fā)酵可以減少污染排放，提高資源利用率，是一條經(jīng)濟(jì)環(huán)保的資源化利用路線［6］。豆制品廢水以無毒無害低重金屬、富含大量營養(yǎng)物質(zhì)如可溶性蛋白質(zhì)、低聚糖、維生素、脂類、微量元素等成為理想的生長基質(zhì)［7］。對(duì)于黃漿水的利用研究主要集中在生產(chǎn)復(fù)合飲料［8］、生成乳酸菌和酵母菌等［9］發(fā)酵食品生產(chǎn)中，但其回收利用技術(shù)很難應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)際中。近年來，以其作為培養(yǎng)基或添加基質(zhì)的研究也被報(bào)道，如培養(yǎng)光合細(xì)菌收獲單細(xì)胞蛋白［10］、制備枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌類益生菌［11］、提高Tribonema的生物量［12］，以及發(fā)酵S-腺苷-L-蛋氨酸［13］等；但利用黃漿水為培養(yǎng)基質(zhì)用于發(fā)酵根際促生菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR）菌株的研究未見報(bào)道。

根際促生菌是一類定殖在植物根際的有益細(xì)菌的統(tǒng)稱［14］，已報(bào)道的PGPR菌株包括腸桿菌屬（Enterobacter sp.）、氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）、芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）、游動(dòng)球菌屬（Planococcus sp.）、鹽單胞菌屬（Halomonas sp.）、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia sp.）、微桿菌屬（Microbacterium sp.）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus sp.）等［15］。通常PGPR具有溶磷、產(chǎn)生植物激素、分泌鐵載體等多種促生特性，可以促進(jìn)多種植物的生長［16］；除了固氮外，其在氮循環(huán)中的作用是多樣化的，還可通過反硝化作用將NO-3作為電子受體，轉(zhuǎn)化為NOx，并最終被還原為NH+4，NOx可能在根際中發(fā)揮重要作用［17］；也有報(bào)道PGPR還可通過硝化作用和氨化作用釋放水解酶將有機(jī)態(tài)氮礦化為無機(jī)態(tài)氮，為植物生長提供必需的氮源［18］。近年來已經(jīng)有利用PGPR菌株促進(jìn)牧草生長的報(bào)道，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）促進(jìn)多年生黑麥草的生長及耐鹽性［19］、可以防治紫花苜蓿根腐病并促進(jìn)其生長［20］；假單胞菌（Pseudomonas sp.）可以促進(jìn)燕麥的生長［21］，復(fù)合促生菌劑提高了青稞的生長量和葉綠素含量［22］。

黑麥草（Lolium perenne）為禾本科一年生或多年生牧草，草產(chǎn)量高、消化率高，適口性較好且粗蛋白質(zhì)含量豐富，易栽培，可多次刈割、且刈割后再生性較強(qiáng)［23］；紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是享有“牧草之王”美譽(yù)的豆科多年生牧草，其富含蛋白質(zhì)、纖維素、維生素、礦物質(zhì)元素等，且氨基酸種類十分豐富［24］；這兩種牧草是我國畜牧生產(chǎn)中的優(yōu)質(zhì)牧草而被廣泛栽培，提高黑麥草和苜蓿的產(chǎn)量對(duì)于發(fā)展畜牧業(yè)具有重要意義。本研究篩選到2株具有溶磷及較強(qiáng)氨化作用的PGPR菌株、即吡咯伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）P10和惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida） HGD3；通過單因素、正交試驗(yàn)對(duì)含不同添加量黃漿水的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以2個(gè)菌株的發(fā)酵菌液進(jìn)行紫花苜蓿及黑麥草種子的萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，以探討利用黃漿水為培養(yǎng)基質(zhì)發(fā)酵促生菌劑的可能性，為黃漿水的廢棄物再利用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及植物種子

4株根際促生菌，即吡咯伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pyrrocinia） P10、耐酪氨酸束村氏菌（Tsukamurella tyrosinosolvens） P9、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis） HP9、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida） HGD3，均由貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離篩選并保存。

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）種子，購自沭陽綠中城綠化工程有限公司；多花黑麥草（Lolium multiflorum Lam.）種子，購自宿遷妃里香花卉有限公司。黃漿水由貴州省遵義市山那邊生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1000 mL；

氨化細(xì)菌液體培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，氯化鈉0.25 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2；

蒙吉娜卵磷脂培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，NaCl 0.3 g，MnSO4·7H2O 0.03 g，CaCO3 5.0 g，卵磷脂1.0 g（溶于75%乙醇中），去離子水1000 mL，瓊脂20 g，pH 7.2～7.4。

1.3 方法

1.3.1 具溶磷作用的根際促生菌菌株初篩

對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的吡咯伯克霍爾德氏菌P10、耐酪氨酸束村氏菌P9、貝萊斯芽孢桿菌HP9、惡臭假單胞菌HGD3進(jìn)行溶磷定性檢測。分別取4個(gè)保種的適量菌懸液轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中、于30 ℃、150 r/min搖床振蕩過夜活化，次日以點(diǎn)種法轉(zhuǎn)接于蒙吉娜卵磷脂固體培養(yǎng)基上、30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，根據(jù)透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）的比值（D/d）初步確定菌株對(duì)有機(jī)磷溶磷能力的強(qiáng)弱［25］。

1.3.2 4株根際促生菌的氨化能力分析

將4株菌株的過夜活化菌液轉(zhuǎn)接入氨化細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，于 30 ℃、120 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)48 h；培養(yǎng)液經(jīng)4000 r/min離心后，取上清液經(jīng)納氏試劑分光光度法測定氨氮濃度；以不接菌的空白液體培養(yǎng)基為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組氨氮濃度的差值即為待測菌株經(jīng)氨化作用產(chǎn)生的氨氮含量［26］。

1.3.3 不同黃漿水添加量對(duì)2個(gè)菌株氨化作用的影響

2個(gè)菌株的過夜活化菌液按照2%接種量轉(zhuǎn)接于含不同濃度黃漿水（20%、30%、40%及50%）的氨化培養(yǎng)基中、搖床振蕩培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)液離心后取上清液，用納氏試劑分光光度法測定氨氮濃度；每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)；氨氮含量的計(jì)算同上。

1.3.4 不同碳源、氮源對(duì)2個(gè)菌株氨化作用的影響

以添加一定濃度黃漿水的氨化培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，單一碳源分別設(shè)置為葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖，以相同含碳量加入碳源；單一氮源分別為牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出物、硫酸銨，以相同含氮量的氮源替換蛋白胨，其他成分保持不變，具體添加量見表1。以2%接種量將2個(gè)菌株的活化菌液轉(zhuǎn)接于含單一碳源或單一氮源的培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)48 h后測定上清氨氮濃度并計(jì)算菌株產(chǎn)生的氨氮量；每組處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化含黃漿水的氨化培養(yǎng)基

根據(jù)碳氮源的單因素試驗(yàn)結(jié)果，以葡萄糖、果糖、麥芽糖為備選碳源，以蛋白胨、酵母浸出物、硫酸銨為備選氮源，碳氮比則分別設(shè)定為 1∶1、5∶1、10∶1，其他成分不變，設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn) L9（33） （表2），以菌株經(jīng)氨化作用產(chǎn)生的氨氮含量為主要指標(biāo)，確定最佳培養(yǎng)基組分。以優(yōu)化前含40%黃漿水氨化培養(yǎng)基作為對(duì)照，進(jìn)一步驗(yàn)證并得到最終優(yōu)化結(jié)果。

1.3.6 2個(gè)菌株發(fā)酵液對(duì)黑麥草及苜蓿種子萌發(fā)的影響

取2個(gè)菌株的甘油保藏液適量分別轉(zhuǎn)接于優(yōu)化培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)并調(diào)整OD600 = 1.0 （約1.0×108 cfu/mL）備用。選取大小一致、健康飽滿的黑麥草及苜蓿種子經(jīng)20%過氧化氫消毒40 min、無菌水浸泡過夜［27］，分別浸入2個(gè)菌株的發(fā)酵液中浸種3 h、之后以滅菌濾紙吸干表面菌液后擺放在鋪有2層濾紙及4.0 mL無菌水的無菌培養(yǎng)皿中；每一皿放置黑麥草種子30?；蜍俎７N子100粒，每一處理3個(gè)重復(fù)，以無菌水作對(duì)照；置于28 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，保持濾紙濕潤。每隔24 h觀察并記錄種子萌發(fā)數(shù)、以胚根突破種子1 mm計(jì)為萌發(fā)，并計(jì)算種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)；發(fā)芽7 d后，從每個(gè)培養(yǎng)皿中隨機(jī)取出均勻一致的3～5株幼苗測定根長和芽長［28］。

種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)的計(jì)算方法如下：

種子發(fā)芽率＝（發(fā)芽7 d的正常發(fā)芽粒數(shù)/供試種子粒數(shù)） × 100%

種子發(fā)芽勢＝（發(fā)芽3 d正常發(fā)芽粒數(shù)/供試種子粒數(shù)） × 100%

種子發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑Gt/Dt （公式中Dt為發(fā)芽時(shí)間，Gt為Dt相對(duì)應(yīng)的每天的發(fā)芽種子數(shù)）［29］。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 24.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，利用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 具溶磷及氨化作用的根際促生菌的篩選

將4株根際促生菌菌株經(jīng)點(diǎn)種法接種于蒙吉娜卵磷脂固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)耐酪氨酸束村氏菌P9、吡咯伯克霍爾德氏菌P10、惡臭假單胞菌HGD3及貝萊斯芽孢桿菌HP9可以在有機(jī)磷培養(yǎng)基上生長良好，且呈現(xiàn)明顯的水解圈（圖1）；經(jīng)納氏試劑分光光度法定量測定氨氮含量，4個(gè)菌株均具有較強(qiáng)的氨化能力（表3）；綜合分析，選擇P10和HGD3進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 黃漿水、碳源及氮源對(duì)2個(gè)菌株氨化作用的影響

將不同濃度的黃漿水添加到氨化培養(yǎng)基中，分析其對(duì)2個(gè)菌株氨化作用的影響。結(jié)果（表4）表明，在添加黃漿水后，2株根際促生菌的產(chǎn)氨氮能力均有不同程度的下降，但P10和HGD3在40%黃漿水的氨化培養(yǎng)基中氨化作用最強(qiáng)。在含有40%黃漿水的培養(yǎng)基中，分析不同碳源和氮源對(duì)2個(gè)菌株氨化作用的影響，結(jié)果表明，添加碳源和氮源對(duì)P10和HGD3菌株的氨氮產(chǎn)量產(chǎn)生明顯不同的影響（圖2）。與不添加黃漿水的氨化培養(yǎng)基相比，果糖可以顯著促進(jìn)2株菌株產(chǎn)氨氮的能力，而蔗糖和麥芽糖產(chǎn)生明顯抑制效應(yīng)；酵母浸膏和硫酸銨的添加明顯提高了HGD3培養(yǎng)液的氨氮產(chǎn)量，而僅有硫酸銨對(duì)提高P10菌株培養(yǎng)液的氨氮產(chǎn)量有明顯影響。

2.3 含黃漿水氨化培養(yǎng)基的優(yōu)化

按極差大小決定因素的影響順序，對(duì)HGD3和P10菌株氨化能力影響的主次順序均為：A、C、B，即：碳源、碳氮比、氮源。根據(jù)正交試驗(yàn)確定最優(yōu)組合（表5， 表6），HGD3菌株為A2B1C2，即以葡萄糖為碳源、硫酸銨為氮源、碳氮比 5∶1；P10菌株的最優(yōu)培養(yǎng)基為 A2B2C2，即以葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源、碳氮比 5∶1；。綜上可知，HGD3的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分為：葡萄糖32.4 g，硫酸銨6.48 g，NaCl 0.25 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，400 mL豆油廢水，蒸餾水600 mL。P10的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分為：葡萄糖 50 g，蛋白胨10 g，NaCl 0.25 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，400 mL豆油廢水，蒸餾水600 mL。進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果表明，在含40%黃漿水的優(yōu)化培養(yǎng)基中，HGD3菌株發(fā)酵48 h的氨氮濃度為894.92 mg/L，P10在最佳培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h的氨氮濃度為546.49 mg/L，相較于優(yōu)化前HGD3和P10菌株48 h發(fā)酵液的氨氮濃度114.81 mg/L、151.69 mg/L （表2） 分別提高了6.79和2.60倍。

2.4 2個(gè)促生菌菌株發(fā)酵液對(duì)黑麥草及苜蓿種子萌發(fā)的影響

以含黃漿水的優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，經(jīng)2個(gè)菌株的發(fā)酵液浸種處理后，測定其對(duì)黑麥草和苜蓿種子萌發(fā)的影響。通過黑麥草種子促萌發(fā)試驗(yàn)（表7，圖3，圖4）發(fā)現(xiàn)，與CK相比，HGD3和P10發(fā)酵液浸種處理的種子發(fā)芽率分別提高了32.66%和18.85%，發(fā)芽勢分別提高了91.28%和47.81%，芽長分別增長了1.57倍和0.77倍，根長分別增長了1.53倍和0.91倍；且HGD3發(fā)酵液處理的黑麥草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、芽長和根長均較對(duì)照組顯著提高（Plt;0.05）；除發(fā)芽率外，P10發(fā)酵液浸種的種子其余指數(shù)也與對(duì)照呈現(xiàn)顯著差異（Plt;0.05）。對(duì)苜蓿種子萌發(fā)的影響結(jié)果表明（表8），HGD3發(fā)酵液浸種的苜蓿種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)分別提高了34.51%、61.04%和28.61%，與對(duì)照呈現(xiàn)顯著差異（Plt;0.05）；經(jīng)P10發(fā)酵液浸種處理后，苜蓿種子的發(fā)芽率提高了24.36%、相較于對(duì)照組顯著提高（Plt;0.05），發(fā)芽勢與發(fā)芽指數(shù)增長不明顯。

3 討論與結(jié)論

我國是大豆加工和消費(fèi)大國，每年因大豆加工產(chǎn)生的黃漿水?dāng)?shù)量巨大。2018年全國豆制品加工大豆700萬t計(jì)，一年產(chǎn)生黃漿水的量達(dá)2100萬t以上［30］。據(jù)檢測，每100 mL大豆黃漿水中蛋白質(zhì)約占3.07 g、還原糖2.14 g，此外還包括總酚、脂肪、可溶性固形物及無機(jī)鹽［31］。本研究以黃漿水為發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分，對(duì)2個(gè)PGPR菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了黃漿水的資源再利用。在氨化能力測定中，HGD3和P10菌株對(duì)不同濃度黃漿水中的含氮有機(jī)物降解能力存在明顯差異。據(jù)報(bào)道，不同種屬菌株對(duì)有機(jī)氮的降解能力不同，不同發(fā)酵條件對(duì)菌株的氨化能力也具有重要影響［32］。Hokamura等［33］的研究表明，在有機(jī)碳源存在時(shí)，假單胞菌還可利用無機(jī)氮源進(jìn)行生長和繁殖，且菌體生長量與氮源的濃度呈正相關(guān)，這使得其在含氨氮廢水的處理上具有極大的潛力。本試驗(yàn)在40%黃漿水氨化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行輔助碳氮源的添加，黃漿水中富含的蛋白質(zhì)和低聚糖，不僅可為HGD3提供一定量有機(jī)氮，還可促進(jìn)菌株對(duì)銨鹽的進(jìn)一步利用與轉(zhuǎn)化；而且伯克霍爾德氏菌P10也表現(xiàn)出類似的利用特點(diǎn)。在較高濃度黃漿水下菌株產(chǎn)生的氨氮濃度測定為負(fù)值，這可能是由于大豆加工廢水是一種典型的高濃度有機(jī)廢水［34］，有機(jī)物濃度過高對(duì)于微生物的生長產(chǎn)生底物抑制，限制了菌株的生長發(fā)育及氨化作用的進(jìn)行［35］。

黑麥草是一種品質(zhì)優(yōu)良的禾本科牧草，適應(yīng)能力強(qiáng)，鮮草產(chǎn)量高，廣泛種植于南方地區(qū)［36-37］；苜蓿是全世界栽培面積最大的飼料作物，也是我國優(yōu)質(zhì)的綠色飼料作物［38］；近年來，利用PGPR提高牧草產(chǎn)量及品質(zhì)的研究逐漸增多。具報(bào)道，接種不同組合的固氮菌（Rhizobium cauense， Burkholderia lata， Bacillus sp.）和溶磷菌（Pseudomonas kilonensis， Bacillus aryabhattai， Stenotrophomonas sp.）對(duì)黑麥草地上生物量和株高的增長具有顯著效應(yīng)［39］；假單胞菌屬、伯克霍爾德氏菌屬和腸桿菌屬菌株可以明顯促進(jìn)黑麥草的生長［40-41］。拜式不動(dòng)桿菌（Acinetobacter beijerinckii）、粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）、產(chǎn)氣腸桿菌（E. aerogenes）、劍菌屬（Ensifer sp.）、固氮菌屬（Azotobacter sp.）等均被報(bào)道可以促進(jìn)紫花苜蓿的生長［42-44，38］。

種子的萌發(fā)和幼苗早期生長是植物生活史的重要階段［45］，也決定了牧草的進(jìn)一步生長和草地的最終建植［46］。然而，報(bào)道稱接種假節(jié)桿菌屬菌株（Pseudarthrobacter sp.）可以增加黑麥草幼苗的根長和株高，但對(duì)種子萌發(fā)并無顯著影響［47］。黑曲霉（Aspergillus niger）的浸種雖抑制了種子的發(fā)芽率，但萌發(fā)后的黑麥草根長及根重顯著高于對(duì)照［48］；也有研究顯示黑曲霉的接種并不能顯著影響黑麥草種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)［49］。經(jīng)分離自不同牧草的內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸種后的黑麥草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)顯著提高，但對(duì)于發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的影響不一［50］。而對(duì)于苜蓿種子萌發(fā)的影響研究，李建偉等［51］發(fā)現(xiàn)動(dòng)性球菌屬（Planococcus sp.）菌株可以顯著提高苜蓿種子的萌發(fā)率，培養(yǎng)7 d的苗長增加了1.04倍，鮮重增加69.57%。假單胞菌屬、固氮菌屬、芽孢桿菌屬和中華根瘤菌屬（Sinorhizobium meliloti）、粘質(zhì)沙雷氏菌、拜氏不動(dòng)桿菌可以明顯促進(jìn)苜蓿的生長和品質(zhì)的提高［52-53］。本研究顯示吡咯伯克霍爾德氏菌P10和惡臭假單胞菌HGD3的黃漿水發(fā)酵菌液可以明顯促進(jìn)黑麥草和苜蓿種子的萌發(fā)，且發(fā)芽7 d后的芽長分別增長1.57倍和0.77倍，根長分別增長1.53倍和0.91倍，表現(xiàn)出優(yōu)良的促種子萌發(fā)效應(yīng)。伯克霍爾德氏菌是一類重要的植物相關(guān)的有益微生物，通過生物固氮、解磷等作用，促進(jìn)植物的生長并增強(qiáng)抗病性［54-55］；我們的前期研究已表明吡咯伯克霍爾德菌P10可以分泌ACC脫氨酶、具有溶磷、產(chǎn)生鐵載體及IAA的優(yōu)良促生特性［56］，可以定殖在花生的根莖組織和根圍土壤并且通過改變土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)來促進(jìn)花生的生長［57］。HGD3是實(shí)驗(yàn)室前期分離篩選的優(yōu)良促生菌菌株，其與芽孢桿菌屬菌株配制的復(fù)合菌劑可以明顯促進(jìn)田間條件下辣椒的生長及產(chǎn)量的提高［58-59］、與芽孢桿菌及伯克霍爾德氏菌的共發(fā)酵菌液還可顯著提高辣椒幼苗的生長指標(biāo)及葉綠素含量［60］。2個(gè)菌株展現(xiàn)出對(duì)花生、辣椒及牧草等多種植物的較好促生作用，表明這些優(yōu)良的促生菌進(jìn)一步利用的可能性。研究顯示氮在參與植物種子萌發(fā)方面具有重要作用［61］，而HGD3和P10菌株的促種子萌發(fā)除與其促生特性有關(guān)外，推測發(fā)酵液中較高的氨氮含量對(duì)種子萌發(fā)也有促進(jìn)作用。此外，HGD3表現(xiàn)出更為顯著的促牧草種子萌發(fā)效應(yīng)，對(duì)其促萌發(fā)機(jī)制的進(jìn)一步研究可以為其更好的利用奠定基礎(chǔ)。

本文對(duì)2個(gè)促生菌菌株的黃漿水發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，并利用發(fā)酵液對(duì)黑麥草和苜蓿種子進(jìn)行浸種，結(jié)果顯示HGD3和P10的黃漿水發(fā)酵液顯著地促進(jìn)了2種牧草種子的萌發(fā)，尤以HGD3處理的黑麥草為甚，這為黃漿水作為培養(yǎng)基組分以發(fā)酵促生菌、并用于牧草的促種子萌發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

（責(zé)任編輯：嚴(yán)秀芳）

作者簡介：

楊揚(yáng)（2002—），女，漢族，貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2020級(jí)生物技術(shù)專業(yè)本科生，E-mail：3323908396@qq.com.

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Optimization of Medium Containing Yellow Syrup Water and Effects of Growth-promoting Bacteria Culture on Seed Germination

Yang Yang1，" Long Kaili1，" Wen Jieshu1， Wang Siyuan1，" Xiong Muyu1，" Cheng Fangyao2，" Han Lizhen1*

（1.College of Life Science， Guizhou University， Guiyang 550025， Guizhou， China; 2.Guizhou Zunyi Shannabian Ecological Agriculture Co. Ltd.， Zunyi 563000， Guizhou， China）

Abstract：

Yellow syrup water contains a large number of nutrients， which is of great significance to the reuse of its resources. The screening of growth-promoting strains with ammoniation and phosphorus-solubility was carried out by qualitative analysis of hydrolysis circle and quantitative determination of NH4+-N content. The fermentation medium containing yellow syrup water of the two strains was optimized by single factor test and orthogonal test. Ryegrass and alfalfa seeds were soaked in the fermentation culture of the two strains to analyze their effects on seed germination. The results showed that Pseudomonas putida HGD3 and Burkholderia pyrrocinia P10 had the strong ammoniation ability and phosphorus solubility. The NH4+-N concent of HGD3 and P10 strains cultured for 48 h in the optimized medium containing 40% yellow syrup water was 894.92 mg/L and 546.49 mg/L， respectively， and which was 6.79 and 2.60 times higher than that before optimization. The soaking of HGD3 and P10 strains significantly increased the germination rate of ryegrass and alfalfa seeds， which were 22.66% and 16% higher than the control， respectively. After the treatments of HGD3 and P10 strains， the bud length of ryegrass increased by 2.57 times and 1.77 times， and root length increased by 2.53 times and 1.90 times， respectively. It showed that the culture of Pseudomonas putida HGD3 in medium containing yellow syrup water could significantly promote the germination of ryegrass and alfalfa seeds， especially ryegrass. The results provide a theoretical basis for the reuse of yellow syrup water and the promotion of the two strains on the seed germination.

Keywords：

yellow syrup water; growth-promoting strains; ryegrass; Alfalfa; seed germination