SNP分子標記結合表型性狀鑒別小豆種質資源

摘要： 為建立科學可靠的小豆種質資源鑒定方法，本研究利用單核苷酸多態性（SNP）分子標記，對102份小豆種質資源進行聚類分析并構建指紋圖譜，同時結合質量性狀對小豆種質資源進行鑒定。結果發現，在102份小豆種質資源中26個SNP分子標記表現出多態性，平均多態信息含量為0.28。61份小豆種質資源的SNP指紋圖譜具有唯一性，可以被準確鑒別，剩余41份小豆種質資源的SNP指紋圖譜不唯一。進一步對102份小豆種質資源的6個質量性狀進行遺傳變異分析，平均遺傳多樣性指數為1.224 5，6個性狀均具有豐富的多態性。結合以上6個性狀，可對SNP指紋圖譜相同的種質資源進行進一步區分。本研究開發的SNP分子標記結合表型性狀的鑒別方法，可為小豆種質資源遺傳鑒定和科學利用奠定基礎。

關鍵詞： 小豆；指紋圖譜；質量性狀；種質資源鑒定

中圖分類號： S521"" 文獻標識碼： A" "文章編號： 1000-4440（2024）06-0975-09

Identification of adzuki bean （Vigna angularis） germplasm resources based on SNP molecular markers and phenotypic traits

ZHANG Mingyuan， LENG Miao， SUN Weina， KE Xiwang， XU Xiaodan， ZUO Yuhu

（Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Crop-Pest Interaction Biology and Ecological Control/National Coarse Cereals Engineering Research Center/Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China）

Abstract： In order to establish a scientific and reliable method for identification of adzuki bean [Vigna angularis （Willd） Ohwi ＆ H. Ohashi] germplasm resources， 102 adzuki bean germplasm resources were clustered and fingerprinted by single nucleotide polymorphism （SNP） molecular markers， at the same time， the germplasm resources of adzuki bean were identified combined with qualitative traits. The results showed that 26 SNP molecular markers in 102 adzuki bean germplasm resources showed polymorphism， and the average polymorphism information content was 0.28. The SNP fingerprints of 61 adzuki bean germplasm resources were unique and could be accurately identified. The SNP fingerprints of the remaining 41 adzuki bean germplasm resources were not unique. The average genetic diversity index of six qualitative traits was 1.224 5 in 102 germplasm resources through further analysis of genetic variation， and all of the six traits were highly polymorphic. Combined with the above six traits， germplasm resources with the same SNP fingerprints can be further distinguished. The identification method of SNP molecular markers combined with phenotypic traits developed in this study can lay a foundation for genetic identification and scientific utilization of adzuki bean germplasm resources.

Key words： adzuki bean；fingerprint；qualitative traits；germplasm resource identification

小豆[Vigna angularis （Willd） Ohwi ＆ H. Ohashi]是菜豆族（Phaseoleae）豇豆屬（Vigna）的栽培種，由于種皮顏色多為紅色，也被稱為紅豆、紅小豆、赤豆等[1]。中國是最大的小豆生產國和出口國，年種植面積約3×105 hm2，年出口量達4×104～8×104 t[2]。由于小豆是小宗作物，相關研究較少，其種質資源與大作物相比欠缺系統規范的研究，同名異種、同種異名現象較為普遍[3]。因此，準確鑒別小豆種質資源，對小豆種質資源管理、品種鑒定、品種追溯、學術交流、知識產權保護和科學利用等具有重要意義。

目前小豆種質資源鑒別主要包括形態學和分子生物學2種方法。形態學方法主要借助植物的外部形態特征，該方法操作簡單、直接，因此被廣泛應用于種質資源鑒別和評價領域[4]。但形態特征尤其是數量性狀遺傳特征易受環境條件和其他修飾基因的影響，并且部分由多基因控制的數量性狀，表現出來的并不是簡單的性狀差異，而是一個變化范圍[4]，因此形態特征不穩定，不適合作為種質資源的鑒別指標。白鵬等[5]連續2年對來自全國的262份小豆種質資源進行農藝性狀鑒定后發現，用包括數量遺傳性狀的農藝性狀進行品種鑒定有一定局限性。何偉鋒等[6]認為試驗條件、土壤及氣候條件等的不同會導致數量性狀發生變化，而質量性狀沒有變化。分子生物學的方法主要依靠分子標記對種質資源進行鑒別，分子標記指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，直接反映基因組DNA間的差異，可以更準確、客觀、科學地評價小豆種質的起源進化與遺傳差異[7]。其中簡單重復序列（Simple sequence repeat，SSR）分子標記和單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism，SNP）分子標記是國際植物新品種權保護聯盟（UPOV，International union for the protection of new varieties of plants）BMT分子測試指南中構建DNA指紋數據庫和中國《植物品種鑒定 DNA分子標記法 總則》（NY/T 2594-2016）僅有的2種推薦標記[8]。

目前在小豆種質資源的鑒別中，SSR分子標記的應用較少。趙波等[9]利用7個SSR分子標記對49份小豆種質資源構建指紋圖譜，其中8份小豆種質資源沒有差異位點，無法區分。顏軍等[10]利用28個SSR分子標記對182份小豆種質資源構建DNA指紋圖譜，其中有9份小豆種質資源沒有被區分開，表明分子標記技術在種質資源鑒定方面存在一定局限性[11]。本實驗室利用前期開發的6個SSR分子標記對36份小豆種質資源進行鑒別，結果發現僅有16份種質資源可以被完全區分[12]。SNP分子標記因在生物基因組上具有分布廣、數量多、多態性豐富等優點[13]，在小豆基因定位方面的應用逐漸增加[14-15]，然而在小豆品種鑒別上還未有應用。近年來有多項研究結果表明，分子標記和表型性狀可以在植物相似種的分類[16]和品種鑒別[17]中起到互補作用。本研究利用SNP分子標記對收集、保存的102份小豆種質資源進行鑒別，并結合質量性狀進行分析，以期尋找合適的鑒定和區分小豆種質資源的方法，為種質資源管理、品種鑒定、品種保護、種質資源交流和利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

102份小豆種質資源，由國家雜糧工程技術研究中心種質資源研究室提供，主要收集于黑龍江省（51份）、吉林省（12份）、遼寧省（23份）、河北省（11份）、重慶市（1份）、北京市（2份）和天津市（2份）（表1）。在同名品種后加（2）進行區分，如小豐2號（2）。

1.2 研究方法

1.2.1 小豆田間種植 供試小豆種植于黑龍江八一農墾大學安達市農業科技園區試驗基地（N46°24′9.42″，E125°20′57.46″）。每份小豆種質資源播種15行，行長6 m，行距0.6 m，株距0.2 m。于2022年6月19日播種，9月18日收獲，按照當地大田模式管理。

1.2.2 小豆種質資源的基因組DNA提取 于人工氣候室盆栽種植供試小豆，于幼苗期每個品種取5株，每株取真葉葉片1張。采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[18]提取102份供試小豆的基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，使用Nanodrop檢測DNA濃度。

1.2.3 小豆SNP分子標記的基因分型 以102份小豆種質資源的基因組DNA為模板，利用26個本研究團隊自主設計的SNP分子標記引物進行分型檢測，所用儀器為BIO-RAD CFX96熒光定量PCR儀。PCR擴增體系為DNA模板1 μl（30 ng/μl），SNP Primer Mix 1.4 μl（10 μmol/l），HiGeno 2×Probe Mix B（北京嘉程生物科技有限公司產品）5 μl，dd H2O補足至10 μl。PCR反應條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性20 s，61～55 ℃復性和延伸40 s，10個循環（每循環1次降低 0.6 ℃）；95 ℃變性20 s，55 ℃擴增40 s，30～34個循環，最后于25 ℃讀取熒光信號數據。擴增結果利用Bio-Rad CFX Manager 3.0軟件Allelic Discrimination選項的熒光分型結果，對小豆種質資源的SNP位點進行基因分型，根據分型結果結合引物序列末端堿基統計每個SNP位點的基因型，計算缺失率和多態信息含量[19]。將位點信息轉化為二元編碼數據，利用MEGA X64中鄰接（NJ）法進行聚類分析，利用iTOL（https：//itol.embl.de/itol.cgi）繪制聚類分析圖[20]。根據聚類結果結合小豆種質資源的基因型繪制SNP指紋圖譜。

多態信息含量PIC計算公式如下：

PIC=1-1i=1P2i-l-1i=1lj=i+12P2iP2j

式中，Pi和Pj分別為第i個和第j個等位基因的頻率。

1.2.4 小豆質量性狀調查及聚類分析 小豆質量性狀調查參照《小豆種質資源描述規范和數據標準》[21]，隨機選取成熟期小豆種質資源15株，調查生長習性、結莢習性、莢形、粒形、單葉葉色、單葉葉形，部分小豆質量性狀表型見圖1，共計6個質量性狀，對其進行非數值型性狀賦值，記錄標準和賦值數據見表2。計算頻率分布和多樣性指數（H′，香農-維納指數，Shannon-Wiener diversity index）[5]，利用Excel繪制SNP分子標記結合表型性狀圖譜。

多樣性指數（H′）的計算公式如下：

H′=-Pi×lnPi

式中，Pi為某一性狀第i個級別出現的頻次。

2 結果與分析

2.1 基于SNP分子標記的小豆種質資源鑒別

2.1.1 SNP分子標記的多態性分析 本研究團隊基于小豆種質資源的重測序數據，開發了32個小豆SNP分子標記，利用這些分子標記對供試的102份小豆種質資源進行基因分型，發現其中的26個SNP分子標記表現出豐富的多態性，占供試標記數的81%。依據26個SNP分子標記對基因進行分型，結果顯示26個SNP分子標記的檢測缺失率為0～15.69%，平均缺失率為4.18%，其中分子標記SNP-4和SNP-30的缺失率較高，分別為15.69%和11.76%（表3）。26個SNP分子標記的多態信息含量為0.06～0.36，平均為0.28，其中SNP-15、SNP-34、SNP-35標記的多態信息含量最低，SNP-19、SNP-22、SNP-30標記的多態信息含量最高。

2.1.2 小豆種質資源SNP指紋圖譜構建 利用26個SNP分子標記，結合SNP分子標記聚類結果，構建小豆種質資源的SNP分子標記指紋圖譜（圖2）。供試的26個SNP分子標記可以準確區分61份小豆種質資源。其中遼紅1號和遼紅3號的SNP指紋圖譜相同，遼V2白紅1號、吉綠5號和寶清紅系選的SNP指紋圖譜相同，012-27和天津紅（2）的SNP指紋圖譜相同，LZX051、大紅袍、小豐2號（2）和012-8的SNP指紋圖譜相同，白紅9號和冀紅0007-5的SNP指紋圖譜相同，紅豆XD04-07、北4 NL8、北23、北25 F174、保M908-15、遼紅08712和京農6號的SNP指紋圖譜相同，建265、品紅23129-1、小豐2號和遼紅7號的SNP指紋圖譜相同，QH2、GN05和遼紅7號的SNP指紋圖譜相同，TL01、遼V5和TL06的SNP指紋圖譜相同，GN02、系選大紅袍-1和吉林362的SNP指紋圖譜相同，保876-16（2）、品紅2011-18和JHPX01的SNP指紋圖譜相同，TL04、極旱紅小豆、北6 JN003、龍墾早紅和北13 F015的SNP指紋圖譜相同。

2.2 基于質量性狀的小豆種質資源鑒別

2.2.1 小豆種質資源質量性狀遺傳變異分析 對易于區分小豆不同類型的6個質量性狀（生長習性、結莢習性、莢形、粒形、單葉葉色、單葉葉形）進行多態性分析。由分布頻率（表4）可以看出，102份小豆種質資源的生長習性以蔓生為主，占比44.12%；結莢習性以無限結莢為主，占比76.47%；莢形以鐮刀形為主，占比60.78%；粒形以長圓柱形為主，占比43.14%；單葉葉色以綠色為主，占比57.84%；單葉葉形以圓形為主，占比68.63%。6個質量性狀的遺傳多樣性指數為0.787 1～1.548 7，平均值為1.224 5。其中，生長習性的遺傳多樣性指數最高，結莢習性的遺傳多樣性指數最低。

2.2.2 SNP分子標記結合表型性狀鑒別小豆種質資源 SNP指紋圖譜相同的種質資源，可以進一步結合表型性狀進行劃分（圖3）。SNP指紋圖譜相同的小豆種質資源在生長習性、結莢習性、莢形、粒形、單葉葉色和單葉葉形方面不完全相同。SNP指紋圖譜相同的遼紅1號和遼紅3號，生長習性、單葉葉色和單葉葉形不同。SNP指紋圖譜相同的遼V2白紅1號和吉綠5號生長習性、結莢習性、粒形、單葉葉色和單葉葉形不同。SNP指紋圖譜相同的天津紅（2）和012-27的粒形、單葉葉色和單葉葉形不同。SNP指紋圖譜相同的LZX051、大紅袍、小豐2號（2）和012-8的生長習性、結莢習性和莢形相同。SNP指紋圖譜相同的白紅9號和冀紅0007-5的生長習性、結莢習性和莢形不同。SNP指紋圖譜相同的保M908-15、遼紅08712和京農6號結莢習性和莢形相同，紅豆 XD04-07、北4 NL8、北23和北25 F174莢形和單葉葉形相同。SNP指紋圖譜相同的遼紅7號、小豐2號和品紅23129-1莢形相同，建265與品紅23129-1結莢習性和莢形不同。SNP指紋圖譜相同的遼紅7、GN05和QH2粒形相同。SNP指紋圖譜相同的TL01、遼V5和TL06的單葉葉形相同。SNP指紋圖譜相同的GN02、系選大紅袍-1和吉林362結莢習性相同。SNP指紋圖譜相同的JHPX01和品紅2011-18生長習性、結莢習性、莢形、粒形、單葉葉色、單葉葉形均不相同。品紅2011-18和保876-16（2）生長習性和粒形不同。SNP指紋圖譜相同的北13 F015、龍墾早紅、北6 JN003和極旱紅小豆結莢習性、單葉葉色和單葉葉形相同，極旱紅小豆和TL04莢形相同。

3 討論

國際植物新品種權保護聯盟（UPOV）BMT分子測試指南中，構建DNA指紋數據庫的標記包括SSR和SNP 2種[8]，與SSR相比，SNP在基因組中含量更豐富。張昆鵬[22]比較SSR分子標記與SNP分子標記構建的指紋圖譜時發現，使用SNP分子標記分析品種間遺傳相似系數，計算更精準，結果更可靠。2021年6月20日全國農技中心組織專家組在北京召開農業行業標準審定會議，通過了《水稻品種真實性鑒定 SNP標記法》（NY/T 2745-2021）和《小麥品種真實性鑒定 SNP標記法》（NY/T 4021-2021），標志著利用SNP技術進行農作物品種真實性鑒定將成為今后的主流方法。王澤涵等[23]利用24個SNP分子標記鑒別出74份茶樹種質資源。顏廷進等[24]利用46個SNP分子標記，鑒別出198份菜豆種質資源。而本研究所開發的26個SNP分子標記，可以鑒別出61份小豆種質資源，這可能是由于選用的標記中有些標記為功能基因相關標記，多態性相對較低。另外41份小豆種質資源的分子標記指紋圖譜有重復，無法區別，這可能是由于親緣關系較近或所選取的標記數量較少。在前人的研究中也有類似情況，José等[25]利用48個SNP分子標記對200個葡萄品種進行了基因分型，有5份親緣關系極其相近的葡萄品種沒有被區分開。Jing等[26]利用40個SNP標記對辣椒的栽培品種進行分析，可以鑒別出97.5%的辣椒栽培品種以及全部的甜椒栽培品種。增加SNP分子標記的數量或許可以進一步區分小豆種質資源，但是SNP分子標記仍難以區分親緣關系較近的小豆種質資源[27]，且成本較高[24]。

形態性狀的鑒定和描述是種質資源研究最基本的方法和途徑，是種以上或種內分類的重要依據之一[28]。小豆具有豐富的遺傳多樣性，本研究所選取的質量性狀的遺傳多樣性指數為0.787 1～1.548 7，其中生長習性、莢形、粒形、單葉葉色的多樣性指數＞1.000 0，可以看出這些質量性狀變異幅度較大，這與龍玨臣等[29]的研究結果一致。金文林等[30]對小豆農藝性狀的遺傳參數變化規律的研究結果表明，主莖節數、單莢粒數、單株產量、株高和單株莢數等均為數量遺傳性狀，受環境影響大，表現不穩定。Aoyama等[31]對小豆矮化突變體的研究結果表明，矮小的表型是通過有絲分裂和減數分裂遺傳的，由遺傳不穩定的基因座控制。鑒于表型數量遺傳性狀的遺傳不穩定性，本研究進行表型鑒別時僅選取質量性狀，未選擇受環境條件影響較大的數量性狀，避免在種質資源鑒定中出現誤差 [5-6]，保證鑒定結果的可靠性。

SNP指紋圖譜已被應用于長節耳草[16]和漆樹[17]的分類中。SNP指紋圖譜相同的種質資源具有不同的形態學特征，這是因為所開發的分子標記所在位點與表型性狀之間不具備足夠的關聯性[14]，這與劉洪等[11]、呂建珍等[32]對花生和谷子的研究結果一致。本研究采用的SNP分子標記結合質量性狀分析可對小豆種質資源進行準確鑒別，在供試的102份小豆種質資源中未出現重復種質資源，并準確鑒別重名種質資源，為小豆種質資源遺傳鑒定、交流和科學利用提供了技術支撐。

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（責任編輯：成紓寒）

收稿日期：2023-07-05

基金項目：黑龍江八一農墾大學校啟動計劃項目（2031011068）；大慶市科學技術局指導項目（zd-2020-45）

作者簡介：張明媛（1996-），女，河北邢臺人，碩士研究生，主要從事植物病理學研究。（E-mail）zhangmingyuan2333@gmail.com

通訊作者：徐曉丹，（E-mail）xxdalice@163.com；左豫虎，（E-mail）zuoyuhu@byau.edu.cn