根結線蟲病對煙草植株根際土壤微生物群落及其功能的影響

摘要： 為明確煙草植株根際土壤微生物對煙株根結線蟲病的響應特征，采用Illumina MiSeq高通量測序技術測定健康煙株（FH-H）、發病煙株（FH-D）根際土壤細菌16S rDNA和真菌內轉錄間隔區（ITS）序列，測定其根際土壤理化性質和酶活性，并借助PICRUSt2軟件和FUNGuild數據庫進行分析。結果表明，與健康煙株相比，發病煙株根際土壤pH、硝態氮含量、堿解氮含量、過氧化氫酶活性和微生物群落α多樣性顯著降低；發病煙株根際土壤微生物種類和相對豐度發生改變，細菌群落中放線菌門、厚壁菌門、芽孢桿菌屬和Unclassified_Ktedonobacteraceae屬相對豐度均顯著升高，真菌群落中子囊菌門、擔子菌門、青霉屬、粗糙孔菌屬相對豐度均顯著升高。發病煙株根際土壤細菌群落在碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔助因子和維生素代謝等功能豐度上顯著高于健康煙株根際土壤，功能真菌類型的相對豐度明顯區別于健康煙株根際土壤，其中腐生營養型功能真菌相對豐度顯著高于健康煙株根際土壤。方差分解分析結果表明，土壤有效磷含量對煙株根際土壤細菌相對豐度影響最大，煙株根際土壤真菌相對豐度主要與土壤脲酶活性、土壤硝態氮含量和土壤酸堿度有顯著相關性。本研究結果為根結線蟲病的綠色防控和土壤保育提供了理論依據。

關鍵詞： 根結線蟲；煙草；根際土壤；微生物群落；微生物功能

中圖分類號： S572.04"" 文獻標識碼： A"" 文章編號： 1000-4440（2024）06-0993-11

Effects of root-knot nematode disease on microbial community and function in rhizosphere soil of tobacco plants

WANG Xingsong1， LI Enxing1， YANG Shihan2， YANG Yuan2， CHEN Jiangzheng2， LI Hanmei2， WANG Ge1， WANG Na1， BAI Yuxiang1， ZHOU Peng1， DU Yu1， LI Jie2

（1.College of Tobacco， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China;2.Yunnan Tobacco Company Kunming Branch， Kunming 650051， China）

Abstract： In order to clarify the response characteristics of rhizosphere soil microorganisms of tobacco plants to its root-knot nematode disease， Illumina MiSeq high-throughput sequencing technology was used to determine the bacterial 16S rDNA and fungal internal transcribed spacer （ITS） sequences in the rhizosphere soil of healthy tobacco plants （FH-H） and diseased tobacco plants （FH-D）. The physicochemical properties and enzyme activities of the rhizosphere soil were determined， and PICRUSt2 software and FUNGuild database analysis were performed. The results showed that compared with healthy tobacco plants， the pH， nitrate nitrogen content， alkali-hydrolyzable nitrogen content， catalase activity and microbial community α diversity of rhizosphere soil of diseased tobacco plants decreased significantly. The microbial species and relative abundance changed. The relative abundances of Actinobacteria， Firmicutes， Bacillus and Unclassified_Ktedonobacteraceae in the bacterial community increased significantly， and the relative abundances of Ascomycota， Basidiomycota， Penicillium and Trechispora in the fungal community increased significantly. The abundances of carbohydrate metabolism， amino acid metabolism， cofactors and vitamin metabolism of the bacterial community in the rhizosphere soil of diseased tobacco plants were significantly higher than those in the rhizosphere soil of healthy tobacco plants. The relative abundance of functional fungal types in the rhizosphere soil of diseased tobacco plants was obviously different from that of healthy tobacco plants. The relative abundance of saprophytic functional fungi in the rhizosphere soil of diseased tobacco plants was significantly higher than that of healthy tobacco plants. The results of variance decomposition analysis showed that the soil available phosphorus content had the greatest influence on the bacterial relative abundance in the rhizosphere soil of tobacco plants. The fungal relative abundance in the rhizosphere soil of tobacco plants was mainly correlated with soil urease activity， soil nitrate nitrogen content and soil pH. The results of this study provide a theoretical basis for the green prevention and control of root-knot nematode disease and soil conservation.

Key words： root-knot nematodes; tobacco；rhizosphere soil; microbial community;microbial function

煙草根結線蟲病是一種以根結線蟲（Meloidogyne spp.）為病原物的典型土壤病害，它在煙草生長的不同階段感染煙株根系，嚴重影響了煙葉的質量[1]。根結線蟲侵染煙草根系會導致其受到機械損傷，利于其他病原微生物侵入煙草，從而形成復合侵染類型的病害[2]，這會進一步影響煙葉的正常生長過程，并降低其產量和質量[3]。

煙株根際是根結線蟲的主要活動空間，也是根系與土壤相互作用的重要場所[4]。根際土壤微生態的變化與根結線蟲的生存及活動密切相關[5]。土壤微生物對土壤微生態系統的平衡具有重要意義，其群落組成結構和多樣性與植物病害的發生息息相關[6]。前人研究結果表明，患病植株根際土壤微生態環境會發生一定改變[7-8]，根結線蟲侵染后土壤微生物的豐富度和多樣性顯著降低[9]，感染根結線蟲病后土壤脲酶活性和堿解氮含量降低。常海娜[10]發現番茄根系感染根結線蟲后，土壤pH值、硝態氮含量會受到顯著影響，植物根際土壤微生物與環境因子共同作用，影響病害的發生與流行[11]。因此，本研究擬通過探究感病土壤與健康土壤微生物生態特征及其土壤理化性質的差異，系統解析土壤理化性質、土壤酶活性、微生物生態特征與煙草根結線蟲病發生的相關性，探究植煙土壤微生態環境對根結線蟲病的響應特征，為煙草根結線蟲病的精準防控與植煙土壤可持續利用提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于昆明市尋甸縣鳳合鎮（N25°51′2.88，E103°4′0.48），海拔2 072 m，烤煙種植年限為10年。

1.2 土壤樣品采集

土壤樣品采集時間為2022年9月12日，在試驗地尋找3株感染煙草根結線蟲病的感病煙株（發病等級范圍為5～9級）（標記為FH-D）和3株未感染煙草根結線蟲病的健康煙株（標記為FH-H），采取抖根法[12]收集根際土，先去除煙株表土雜草，緩緩拔出煙株，將附著于根系的大塊顆粒土輕輕抖落，再將附著于根系的根際土收集于自封袋中，充分混勻后，一部分置于液氮中保存，帶回實驗室于超低溫（-80 ℃）保存，用于提取土壤基因組DNA和對土壤微生物群落進行分析；一部分用于二齡幼蟲的分離；其余土樣置于室溫自然風干，去除雜質并研磨過40目篩，用于土壤化學性質和酶活性的測定。

1.3 土壤二齡線蟲的分離與計數

采用貝曼漏斗法[13]各稱取發病和未發病土壤100 g進行土壤中線蟲的分離和計數。

1.4 土壤化學性質的測定

參照《土壤農化分析》[14]進行土壤pH值、有機質含量、硝態氮含量、銨態氮含量、速效鉀含量、堿解氮含量、有效磷含量的測定。

1.5 土壤酶活性的測定

參照《土壤酶學》[15]中的方法進行土壤酶活性的測定，采用高錳酸鉀滴定法進行過氧化氫酶活性測定，采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法進行脲酶活性測定，采用磷酸苯二鈉比色法進行酸性磷酸酶活性測定，蔗糖酶活性測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法。

1.6 土壤微生物的測定與分析

采用PowerSoil DNA提取試劑盒提取土壤DNA。經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度及含量。將DNA冷凍于-20 ℃用于后續PCR擴增。利用引物341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′）擴增根際土壤細菌16S基因，利用引物ITS3_KYO2（5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴增根際土壤真菌內轉錄間隔區（ITS）基因。經過實時熒光定量PCR儀驗證文庫合格后，使用NovaSeq 6000對DNA文庫進行測序。測序數據通過 Qiime V1.9.1 去除平均質量分數低（Qlt;20）和長度短（lt;100 bp） 的低質量序列，得到最終的有效數據。使用 Usearch 軟件進行聚類，去除聚類過程中檢測到的嵌合體，獲得操作分類單元（OTU）的相對豐度和序列。

1.7 數據處理與分析

采用 Microsoft Excel 2019 和GraphPad Prism 8.0.2進行數據統計分析和作圖；基于QIIME 2平臺進行α多樣性分析，基于SIMCA軟件進行β多樣性分析；用OmicShare平臺R包進行線性判別分析（LEfSe），即LEfSe豐度差異分析；通過計算樣本間的Bray-Curtis距離進行PCA（主成分分析）計算及作圖；基于R語言Random Forest包計算物種對分組差異的貢獻度，采用PICRUSt2軟件進行細菌功能預測，基于FUNGuild（真菌功能類群）數據庫對真菌進行功能預測。

2 結果與分析

2.1 健康煙株與發病煙株根際土壤根結線蟲數量

健康煙株與發病煙株土壤根結線蟲二齡幼蟲數量見圖1，發病煙株根際土壤根結線蟲數量顯著高于健康土壤，為健康土壤的526.36%。

2.2 健康煙株與發病煙株根際土壤理化性質測定結果

由表1可知，與健康煙株土壤相比，發病煙株土壤pH值、硝態氮含量、堿解氮含量顯著降低，降低幅度分別為13.92%、48.08%、20.49%。銨態氮含量、有機質含量和有效磷含量無顯著差異。

2.3 健康煙株與發病煙株根際土壤酶活性測定結果

煙株感染根結線蟲病后土壤過氧化氫酶活性、酸性磷酸酶活性、蔗糖酶活性、脲酶活性均降低（表2），其中，過氧化氫酶活性顯著降低，而土壤酸性磷酸酶活性、蔗糖酶活性、脲酶活性無顯著變化。

2.4 健康煙株與發病煙株根際土壤 OTU 聚類結果

高通量測序結果（圖2）表明，在各分類水平上，與健康煙株土壤相比，感病煙株土壤細菌特有菌群數量均有所減少。其中，門分類水平上減少3個，綱分類水平上減少13個，目分類水平上減少31個，科分類水平上減少32個，屬分類水平上減少67個，種分類水平上減少69個，OTU減少1 996個。與健康煙株土壤相比，在發病煙株土壤中，真菌特有菌群數量除在門水平增加外，其余分類水平均表現為減少，具體表現為：綱分類水平上減少1個，目分類水平上減少10個，科分類水平上減少29個，屬分類水平上減少55個，種分類水平上減少37個，OTU減少283個。

2.5 健康煙株與發病煙株根際土壤微生物多樣性指數

與健康煙株根際土壤相比，發病煙株根際土壤細菌多樣性指數及真菌多樣性指數均降低（圖3）。其中，發病煙株土壤細菌和真菌Chao 1指數（P=0.009 1，P=0.002 2）、ACE指數（基于豐度的覆蓋估計值）（P=0.010 1，P=0.003 4）顯著降低，其余指數同樣表現為降低趨勢，但與健康煙株土壤微生物多樣性指數相比未達到顯著水平（Pgt;0.05）。

2.6 健康煙株與發病煙株根際土壤微生物PCA分析

健康煙株與發病煙株根際土壤細菌和真菌群落組成顯著分散。在土壤細菌群落中，第一坐標軸和第二坐標軸分別解釋了39.86%和38.98%的原有變量，累積解釋度為78.84%（圖4）；在土壤真菌群落中，第一坐標軸和第二坐標軸分別解釋了37.01%和24.26%的原有變量，累積解釋度為61.27%（圖4）。

2.7 煙草根結線蟲病發病煙株根際土壤微生物群落組成分析

2.7.1 細菌群落組成分析 由圖5可知，門分類水平下，發病煙株根際土壤放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、浮霉菌門、厚壁菌門細菌群落的相對豐度分別比健康煙株根際土壤高5.49個百分點、0.48個百分點、1.62個百分點、1.90個百分點和6.90個百分點。屬分類水平下，發病煙株根際土壤細菌群落的相對豐度前5的細菌屬為鏈霉菌屬（25.73%）、芽孢桿菌屬（5.50%）、鞘氨醇單胞菌屬（4.10%）、布氏桿菌屬（2.48%）和Unclassified_Ktedonobacteraceae（1.33%），發病煙株根際土壤的芽孢桿菌屬、Unclassified_Ktedonobacteraceae相對豐度分別為健康煙株根際土壤的6.10倍、10.66倍。

2.7.2 真菌群落組成分析 由圖6可知，門分類水平下，發病煙株根際土壤真菌群落的子囊菌門、擔子菌門、毛囊菌門相對豐度分別比健康煙株根際土壤高5.17%、4.80%、4.61%。

屬分類水平下，發病煙株根際土壤真菌群落相對豐度排名前5的真菌屬為鐮刀菌屬（10.05%）、青霉屬（6.22%）、粗糙孔菌屬（6.18%）、Setophoma（4.93%）和Saitozyma（4.03%），發病煙株根際土壤的青霉屬、粗糙孔菌屬相對豐度分別為健康煙株根際土壤的14.22倍、16.34倍。

2.8 煙草根結線蟲病發病煙株根際土壤微生物屬水平LEfSe物種差異分析

土壤細菌群落的線性判別分析（LDAgt;4.00，Plt;0.05）結果（表3）表明，綱水平的纖線桿菌綱、目水平的纖線桿菌目、科水平的纖線桿菌科與JG30_KF_AS9在發病煙株根際土壤富集。

土壤真菌群落的線性判別分析（LDAgt;4.00，Plt;0.05）結果（表4）顯示，門水平的毛霉門，綱水平的藍藻綱，目水平的爪甲團囊菌目、糙孢孔目、毛霉目，科水平的Onygenales_fam_Incertae_sedis、線蟲草科、刺孢菌科，屬水平的Spiromastix、粗糙孔菌屬在發病煙株根際土壤富集。

2.9 煙草根結線蟲病發病煙株根際土壤微生物功能預測分析

2.9.1 細菌功能預測分析 為了進一步確定感染煙草根結線蟲對根際土壤細菌群落功能的影響，采用Welch’s T檢驗功能豐度差異。通過PICRUSt2軟件注釋出16個二級功能（圖7），其中，與健康煙株根際土壤相比，發病煙株根際土壤共有11個功能豐度顯著提高，包括碳水化合物代謝，氨基酸代謝，輔助因子和維生素的代謝，能量代謝，其他氨基酸的代謝，核苷酸代謝，復制與修復，折疊、分類和降解，細胞運動，跨膜運輸，信號轉導。

2.9.2 真菌功能預測分析 采用 FUNGuild數據庫預測健康煙株與感病煙株根際土壤真菌功能。結果（圖8）表明，真菌營養型可分為病原營養型、病原-腐生營養型、病原-腐生-共生營養型、病原-共生營養型、腐生營養型、腐生-共生營養型和共生營養型7種，從營養類型來看，病原-腐生-共生營養型為主要營養型。發病煙株根際土壤的腐生營養型相對豐度高于健康煙株根際土壤。

2.10 微生物群落與土壤理化因子相關性分析

在方差分解分析（VPA）中，貢獻度數值越大表示環境因子對物種分布的影響越大，數值為負表示該環境因子對物種分布無影響。土壤理化因子對根際土壤細菌門水平豐度的貢獻度分析結果（圖9）表明，土壤有效磷含量對土壤細菌豐度貢獻度最高；土壤環境因子對土壤真菌門水平豐度貢獻度由高到低排序為土壤脲酶活性、硝態氮含量、pH 值、有效磷含量等。

3 討論

根際是根系與土壤相互作用的空間，是物質循環與養分轉化的窗口[16]，也是根結線蟲的主要活動空間[17]。當土壤病原體入侵植株根系時，由煙株、土壤微環境組成的微生態環境將發生改變[18]，而根結線蟲的侵染勢必會打破土壤環境的平衡[19]。本研究發現，發病煙株根際土壤pH顯著低于健康煙株根際土壤。究其原因，一方面，煙株根系分泌物中存在多種有機酸，土壤酸堿度能直接影響土壤中的線蟲群落組成[20]，另一方面，土壤中的有機酸與土壤pH呈顯著負相關，而水楊酸作為土壤中普遍存在的化感物質，由其合成的水楊酸甲酯有助于二齡幼蟲對宿主的識別行為，促進了根結線蟲感染[21]。前人研究結果表明，長期連作導致土壤理化性質變差，進而加劇煙草根結線蟲病的發生[22]。本研究也發現，感病煙株根際土壤硝態氮含量、堿解氮含量均顯著低于健康煙株根際土壤，Lu等[8]的研究結果也表明，硝態氮能有效抑制線蟲的發育，且抑制作用隨著濃度的增加而增大。

土壤酶在土壤物質循環和能量轉化中起到十分重要的作用 [23-24]。本試驗發現，發病煙株根際土壤過氧化氫酶活性顯著低于健康煙株根際土壤，可能是煙株根系遭受侵染后，影響其抗氧化系統，使植株體內過氧化氫酶釋放水平下降所致。研究結果表明，根結線蟲數量的增多會導致微生物活性降低，從而使發病土壤酶活性降低[25]；另一方面根結線蟲的感染會導致煙株根系受損，使煙株難以通過分泌根系分泌物來提高土壤酶活性，此消彼長之下，便使得感病土壤中土壤酶活性下降，對其他作物的研究結果也表明，感染土傳病害會降低土壤酶活性[26-27]。

根際微生物是連接植株與土壤的重要介質[28]，根系是植株塑造根際微生物群落的重要器官，當植株根系被根結線蟲感染后，其微生物群落也將受到影響[29-30]。在本研究中，發病煙株根際土壤細菌和真菌群落豐富度和多樣性都顯著低于健康煙株根際土壤。通過主成分分析發現，患病煙株根際土壤和健康煙株根際土壤細菌和真菌分布存在顯著差異，表明為響應根結線蟲感染，煙株根系土壤的微生物群落發生了顯著改變。與健康煙株根系土壤相比，發病煙株根系土壤細菌群落的放線菌門、酸桿菌門、芽孢桿菌屬具有明顯優勢。放線菌次生代謝產物能抑制病原微生物生長[31]，酸桿菌門的次生代謝產物也起到抗菌效果[32]。

在本研究中，發病煙株根際土壤真菌群落中子囊菌門、擔子菌門的相對豐度較高，而子囊菌多為寄生菌或腐生菌，能增強土壤抵抗侵蝕的能力[33]，隨著根結線蟲種群密度的增大，土壤真菌種類更加豐富，子囊菌門的相對豐度有所增加[34]，擔子菌作為土壤中的重要分解者，對于土壤碳循環具有重要作用。鐮刀菌屬、青霉屬、粗糙孔菌屬在發病煙株根際土壤中占優勢地位；鐮刀菌屬是一類植物病原菌[35]，前人研究結果也表明，鐮刀菌屬病原菌可能與煙草根結線蟲的發生有關。青霉屬、粗糙孔菌屬病原菌均具有腐生菌功能，對纖維素具有明顯降解作用[36]。

利用PICRUSt2 對感病煙株與健康煙株根際土壤細菌功能進行預測，細菌群落中新陳代謝（碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔助因子和維生素的代謝、能量代謝、其他氨基酸的代謝、核苷酸代謝）豐度顯著升高，新陳代謝作為細菌群落的核心功能，在促進植物土壤物質循環、促進植物生長中發揮重要作用[37]。發病煙株根際土壤新陳代謝功能的豐度顯著高于健康煙株根際土壤，這可能是土壤細菌群落中有益菌拮抗線蟲侵染和某些細菌通過降解植物組織幫助線蟲在根系形成根結的共同結果[38]。采用 FUNGuild 預測不同地塊發病煙株與健康煙株根際土壤不同功能真菌的相對豐度變化，發病煙株根際土壤腐生營養型真菌相對豐度顯著高于健康煙株根際土壤，研究結果表明，一些真菌可以通過改變營養類型來適應環境變化，同時，具有競爭性腐生能力的真菌能通過與植物病原體競爭營養物質和寄生空間（如植物根部）來抑制病原菌的生長[7]。

病原體作為生物多樣性-生態系統功能關系的重要驅動因素，積極影響了包括有益微生物和病原體在內的關鍵微生物群落相對豐度；另外，微生物和環境因素也會積極響應根結線蟲的侵染，減少或促進病害的發生[39]。在本研究中，煙株根際土壤細菌和真菌微生物群落對土壤指標的響應不一致，土壤細菌群落主要與土壤有效磷含量相關，而真菌群落主要與土壤脲酶活性、硝態氮含量、pH 值相關。表明土壤理化性質的改變影響著土壤微生物群落的構建，可能導致土壤微生物功能的改變，進而響應根結線蟲的侵染。

4 結論

土壤有效磷含量對細菌群落分布的影響最明顯，而土壤脲酶活性、土壤硝態氮含量以及土壤酸堿度對真菌群落的影響最為明顯。與健康煙株根際土壤相比，在發病煙株根際土壤細菌群落中，放線菌門、厚壁菌門、芽孢桿菌屬以及Unclassified_Ktedonobacteraceae屬的相對豐度顯著提高；而在真菌群落中，與健康煙株根際土壤相比，子囊菌門、擔子菌門、毛囊菌門、青霉屬以及粗糙孔菌屬的相對豐度也顯著提高；與健康土壤相比，發病煙株根際土壤細菌群落代謝功能有明顯增強，而真菌群落的腐生營養型功能相對豐度則顯著高于健康土壤。

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（責任編輯：陳海霞）

收稿日期：2023-08-04

基金項目：國家自然科學基金項目（32160517）；云南省煙草公司昆明市公司科技計劃項目[昆煙科（2022）12號KMYC202207]

作者簡介：王興松（1997-），男，云南曲靖人，碩士研究生，研究方向為煙草栽培與植煙土壤保育。（E-mail）2962435088@qq.com

通訊作者：李 杰，（E-mail）lijie1245@163.com