蘋果雙脫毒矮化自根砧苗繁育保存技術(shù)

摘" "要" "病毒病對(duì)蘋果產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展構(gòu)成極大威脅，采用科學(xué)繁育、保存方法，利用雙脫毒苗木建園是防治蘋果病毒病的核心技術(shù)。從雙脫毒、檢測(cè)、微繁、建脫毒圃、無(wú)毒接穗保存等方面總結(jié)了蘋果雙脫毒矮化自根砧苗木繁育與保存技術(shù)，以期為雙脫毒苗生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞" "雙脫毒苗;熱處理;蘋果矮化自根砧;微繁;接穗保存

病毒病是影響蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。據(jù)報(bào)道，病毒病對(duì)我國(guó)不同蘋果產(chǎn)區(qū)造成的減產(chǎn)達(dá)到20%～35%。引起蘋果病毒病的病毒類型較多，國(guó)內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)并鑒定有39種病毒病類型侵染蘋果樹，我國(guó)蘋果產(chǎn)區(qū)已有17種，其中包含6種重點(diǎn)病毒類型，分別是蘋果銹果類病毒（ASSVd）、蘋果綠皺果類病毒（AGCV）、蘋果花葉病毒（AMV）3 種顯性病毒病和蘋果莖溝病毒（ASGV）、蘋果莖痘病毒（ASPV）和蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）3種潛隱性病毒。這6種病毒是目前蘋果苗脫毒檢測(cè)的對(duì)照依據(jù)。其中，潛隱病毒病相對(duì)于顯性病毒病發(fā)病和傳播能力更強(qiáng)，約占病毒病總發(fā)病的50%～80%，分布范圍也更廣，在我國(guó)的遼寧、陜西、吉林、山東等地都可以檢測(cè)到，給當(dāng)?shù)靥O果產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展造成了嚴(yán)重制約。病毒一般通過(guò)昆蟲或螨類傳播或通過(guò)修剪嫁接工具傳播。重茬地建園的，以前殘留的根系或帶病的植株根系直接接觸也可以傳播病毒。蘋果樹通過(guò)接觸感染病毒病后，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間侵染，隨樹液流動(dòng)，病毒很快遍布植株體，影響蘋果樹正常生理機(jī)能，如光合作用、養(yǎng)分合成運(yùn)輸?shù)龋瑥亩鹕L(zhǎng)緩慢、植株矮小、缺素等一系列問(wèn)題，甚至造成產(chǎn)量品質(zhì)下降。目前尚無(wú)良藥、良法防控病毒病，解決苗木帶毒問(wèn)題是最根本的辦法。生產(chǎn)無(wú)毒苗木首先要通過(guò)組織培養(yǎng)對(duì)品種和砧木脫毒，再使用嫁接繁育保存等技術(shù)獲得品種和砧木雙脫毒苗木。生產(chǎn)實(shí)踐表明，采用無(wú)病毒苗具有樹勢(shì)強(qiáng)、新梢生長(zhǎng)量大、萌芽率高，早花、早果、豐產(chǎn)，果實(shí)品質(zhì)優(yōu)等特點(diǎn)。

矮化自根砧苗木有矮化效果明顯、早果性強(qiáng)的特點(diǎn)。蘋果矮化自根砧雙脫毒苗木生產(chǎn)流程大致可以分成五個(gè)部分：一是砧木與品種脫毒;二是檢測(cè);三是微繁;四是建立脫毒圃;五是脫毒接穗保存。

1" "砧木與品種脫毒

1.1" "砧木與品種的嫩梢準(zhǔn)備" "在蘋果生長(zhǎng)季，分別從健壯的母體植株上采集長(zhǎng)勢(shì)健康的矮化砧木（如M9T337、M26、GM256等）和栽培品種（如瑞雪、瑞香紅、秦脆等）的嫩梢，取前端3～5 cm。

1.2" "枝條消毒培養(yǎng)與無(wú)菌體系建立" "首先對(duì)砧木和品種接穗枝條嫩梢用酒精進(jìn)行表面消毒處理，然后放到裝有MS營(yíng)養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，待3～5 d發(fā)芽1 cm后取前端0.5～2 mm的頂芽。得到的嫩梢頂芽先用75%酒精浸泡30 s，然后用滅菌水沖洗4次，再用無(wú)菌吸水紙吸干表面水分，浸入0.1%升汞中消毒10 min，再用滅菌水沖洗5次，用無(wú)菌吸水紙吸干表面水分，最后接種在配好的培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L）中進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，組培苗自身的激素被消耗后，培養(yǎng)基中的激素對(duì)其生長(zhǎng)起到至關(guān)重要的作用。

1.3" "剝?nèi)∏o尖與接種培養(yǎng)" "無(wú)菌培養(yǎng)20 d后，在超凈工作臺(tái)上用鑷子和解剖刀仔細(xì)剝開幼葉，小心切下帶最頂部生長(zhǎng)點(diǎn)，長(zhǎng)0.3～0.5 mm（帶1～2個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)）的莖尖，將其放入調(diào)配好培養(yǎng)基（MS+6-BA 2 mg/L+IBA 0.5 mg/L+瓊脂7 g/L+30 g/L蔗糖）的培養(yǎng)瓶進(jìn)行二次培養(yǎng)，培養(yǎng)成無(wú)菌瓶苗。此時(shí)需要用光強(qiáng)為2 000～3 000 lx的日光燈照明，10 h/d，溫度保持在25 ℃左右。

1.4" "熱處理鈍化" "熱處理脫毒的原理是利用正常的植物細(xì)胞和病毒對(duì)溫度忍耐極限的不同，經(jīng)過(guò)一定的溫度和時(shí)長(zhǎng)的處理，使正常植物細(xì)胞生長(zhǎng)速度快于病毒發(fā)展速度，從而讓新長(zhǎng)出的幼嫩組織不帶毒。此方法對(duì)溫度和時(shí)間的掌控要求非常嚴(yán)格，溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響組培苗成活率，溫度過(guò)低或時(shí)間短又會(huì)影響脫毒效果。有報(bào)道顯示，34～38 ℃是合適的熱處理溫度，處理30 d后，組培苗存活率高達(dá)90%以上。具體操作方法：無(wú)菌瓶苗長(zhǎng)到2 cm左右時(shí)，先放在34 ℃環(huán)境中生長(zhǎng)7 d左右，再放在38 ℃環(huán)境中生長(zhǎng)30 d左右。

1.5" "二次莖尖剝離" "熱處理一段時(shí)間后，先觀察并統(tǒng)計(jì)無(wú)菌瓶苗的存活率，在無(wú)菌臺(tái)的解剖鏡下，對(duì)還存活的無(wú)菌瓶苗進(jìn)行莖尖采集（二次莖尖剝離），處理方法同第1次，得到0.2～1 mm長(zhǎng)的莖尖（此時(shí)的莖尖經(jīng)過(guò)莖尖培養(yǎng)和熱處理，基本可實(shí)現(xiàn)無(wú)毒），再次轉(zhuǎn)移到原培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

2" "病毒檢測(cè)

組培苗高度達(dá)到2 cm后，采用SiO2吸附法提取RNA，采用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)進(jìn)行病毒檢測(cè)。

3" "微繁與生根

3.1" "無(wú)毒莖尖接種快繁" "經(jīng)過(guò)病毒檢測(cè)，得到理想的脫毒組培苗材料后，需要利用植物“克隆”技術(shù)進(jìn)行微繁，以獲得大批量的無(wú)毒苗木。

操作方法：先在無(wú)菌操作臺(tái)上取下脫毒苗的莖尖，置于事先準(zhǔn)備好的快繁培養(yǎng)基（MS+6-BA 0.8～1.5 mg/L+ IBA 0.1～0.3 mg/L+GA3 0.3 mg/L+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L，采用該配方組培材料繁殖系數(shù)較高，且因玻璃化苗死亡的概率較小）上進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)。

不同蘋果砧木和品種的擴(kuò)繁培養(yǎng)基最佳配方存在差異。有研究表明，蘋果砧木M9T337的擴(kuò)繁配方為MS+BA 0.8 mg/L+NAA 0.15 mg/L+IAA 0.05 mg/L時(shí)，其擴(kuò)繁系數(shù)為5.4，較為適宜;B9、GM256砧木的擴(kuò)繁配方為MS+BA 0.8 mg/L+NAA 0.05 mg/L+IAA 0.1 mg/L時(shí)，其擴(kuò)繁系數(shù)分別為4.2、4.6;M26砧木擴(kuò)繁配方為MS+NAA 0.15 mg/L+BA 0.5 mg/L+IAA 0.15 mg/L，其繁殖系數(shù)為4。

培養(yǎng)環(huán)境溫度25 ℃左右為宜，利用日光燈，光強(qiáng)1 800～2 500 lx下，14 h/d，培養(yǎng)1個(gè)月。此時(shí)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)會(huì)分生大量不定芽或不定苗，在無(wú)菌操作臺(tái)上完成分瓶接種。

3.2" "生根培養(yǎng)" "分瓶接種后的瓶苗長(zhǎng)到3 cm左右后，需要進(jìn)行生根培養(yǎng)，即把瓶苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上使其繼續(xù)生長(zhǎng)16～20 d，不定根長(zhǎng)到1 cm。培養(yǎng)室溫度23±2 ℃，光強(qiáng)1 000～2 500 lx，日光燈照明，12 h/d。

一般認(rèn)為適合蘋果的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IAA 1～1.5 mg/L+IBA 0.15～0.2 mg/L+瓊脂5.3 g/L+蔗糖20 g/L，pH值5.8。有研究表明，不同蘋果品種或砧木的最佳生根培養(yǎng)基存在較大差異，長(zhǎng)富1號(hào)適合在1/2MS+IBA1.5 mg/L培養(yǎng)基上生根;早喬納金適合在1/2MS+IBA 1 mg/L培養(yǎng)基上生根。培養(yǎng)基中IBA的濃度對(duì)生根率有很大影響，其值在1～1.5 mg/L范圍內(nèi)生根效果好。培養(yǎng)基中IAA的濃度對(duì)蘋果無(wú)菌瓶苗生根效果影響不大。但有研究表明，在王林、5D2-36和秦月等品種的生根培養(yǎng)基中加入0.5 mg/L IBA，其無(wú)菌瓶苗生根效果最好，蜜脆在0.7 mg/L" IBA培養(yǎng)基中生根率高。

3.3" "溫室馴化穴盤苗" "生根培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)根系生長(zhǎng)到理想狀態(tài)，就得到了完整的無(wú)毒組培苗。此時(shí)即可開始苗木馴化。先在溫室內(nèi)讓生根瓶苗帶蓋生長(zhǎng)1周，然后打開瓶蓋生長(zhǎng)4 d左右。將苗從培養(yǎng)瓶中取出，放到干凈的托盤中，用凈水沖洗掉根上粘連的培養(yǎng)基，放入0.1%多菌靈溶液中3 s，防止病菌感染。最后將苗小心移栽到消過(guò)毒的營(yíng)養(yǎng)盤內(nèi)。待苗生長(zhǎng)到5片葉時(shí)，轉(zhuǎn)移到溫室外的遮陽(yáng)網(wǎng)下適應(yīng)3～5 d，逐漸從弱光到強(qiáng)光、變溫（18～35 ℃）適應(yīng)自然環(huán)境。

4" "建脫毒圃

4.1" "建立脫毒品種、砧木母本采穗圃" "經(jīng)過(guò)馴化，即可得到正常的無(wú)毒品種和砧木苗。3月下旬至5月上旬將其定植到防蟲網(wǎng)室中（防止昆蟲傳毒），分別建立砧木和品種母本脫毒采穗圃。在苗圃生長(zhǎng)50 d 左右，苗木粗度達(dá)到0.6 cm以上，芽體成熟，就可以提供母本采穗圃無(wú)毒苗木接穗。為保證采穗圃的純度，母本脫毒采穗圃每3～5年進(jìn)行更新。

4.2" "建立雙脫毒苗圃" "經(jīng)過(guò)溫室和溫室外馴化鍛煉的矮化砧（如M9T337、M26、GM256）穴盤苗，于3月下旬至5月上旬移栽到育苗圃中，當(dāng)作繁育矮化自根砧苗的砧木，8月或翌年4月用脫毒品種的接穗（一般在脫毒母本采穗圃中采集）嫁接到砧木上，即可得到矮化雙脫毒苗木。注意嫁接操作中的嫁接刀要嚴(yán)格消毒，最好專用。

嫁接好的芽苗生長(zhǎng)1～2年后出圃。采穗圃和育苗圃內(nèi)都采用寬窄行栽植，寬行距60～80 cm，窄行距20～30 cm，株距5～10 cm。

5" "無(wú)毒接穗的保存

無(wú)毒接穗的保存環(huán)節(jié)非常關(guān)鍵，對(duì)后期嫁接成活率有很大影響，既要保護(hù)接穗芽體的生命力，又要防止感染病毒。

5.1" "無(wú)毒接穗的采集" "接穗采集一般在冬季果樹休眠期進(jìn)行，此時(shí)芽體養(yǎng)分已完成回流，芽體成熟度高、質(zhì)量好。蘋果樹正常落葉后，從脫毒苗圃中對(duì)應(yīng)品種編號(hào)尋找到已脫毒的母本樹，確保品種純正。選擇樹勢(shì)健壯、芽體飽滿、無(wú)病蟲害的1年生枝條。在母本樹上采集接穗時(shí)，要留5 cm左右短樁，確保下個(gè)生長(zhǎng)周期能發(fā)出更多的有效接穗。采好接穗后要對(duì)接穗進(jìn)行整理，先去掉基部老化彎曲、芽體瘦弱的部分，再去掉梢部幼嫩部分，去掉沒(méi)有自然脫落的葉片和其他異物，浸泡在0.1%多菌靈溶液中30 s，取出晾干，用蠟液密封住接穗兩端的剪口。封蠟后按照接穗長(zhǎng)短分類，一般分為長(zhǎng)、中、短三類，每50根為1捆，掛上標(biāo)簽牌，寫明是否無(wú)毒、采集地點(diǎn)、品種、數(shù)量等信息。

5.2" "無(wú)毒接穗的保存" "無(wú)毒接穗的采集和保存要與一般接穗?yún)^(qū)分開，不僅采集工具要單獨(dú)使用，接穗也要單獨(dú)存放。想要穩(wěn)妥且長(zhǎng)期存放，可選擇冷庫(kù)或冷柜，溫度-4～0 ℃，濕度70%～80%。先制作無(wú)毒濕沙或濕鋸末，濕度以手握成團(tuán)、松手即散為宜。將接穗放置在濕沙或濕鋸末中，保證接穗周圍有10 cm包裹。

6" "果園管理注意事項(xiàng)

建園時(shí)嚴(yán)禁選擇重茬地，防止苗木從土壤中感染病毒。所有接穗都應(yīng)來(lái)自網(wǎng)室脫毒采穗圃，以保證無(wú)病毒砧木和品種的純度。雙脫毒接穗采集和嫁接時(shí)要對(duì)刀剪等工具進(jìn)行酒精消毒處理，防止工具傳毒，最好使用脫毒苗專用刀具。果樹生長(zhǎng)期間重點(diǎn)防治蝽類、蚜蟲類、葉蟬類、螨類等刺吸式害蟲，防止害蟲傳毒。修剪期和腐爛病刮治期，要將修剪刀鋸、刮刀等工具進(jìn)行消毒處理，最好做到工具專用。后期若發(fā)現(xiàn)品種不良，需要高接換種，還應(yīng)選擇脫毒且保存完好的接穗。

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