微型月季小伊甸園組織培養研究

摘" "要" "為解決微型月季小伊甸園規模化擴繁以及利用細胞工程進行后續品種改良等問題，對其進行組織培養研究。結果表明，以帶芽莖段為外植體時，合適的滅菌方式為75%乙醇消毒30 s后升汞浸泡滅菌8 min;適合腋芽萌發誘導的培養基為MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA3 3 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，pH 5.8;適合腋芽增殖繼代的培養基為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，pH 5.8;適宜生根的培養基為1/2MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L+活性炭1 g/L，pH 5.8;組培苗合適的移栽基質為蛭石，成活率達95%，且植株長勢良好。

關鍵詞" "微型月季;組織培養;繼代增殖;生根誘導

月季（Rosa chinensis）為世界著名鮮切花，有極高的觀賞價值。在品種繁多的月季中，微型月季（Rosa chinensis minima）植株矮小、花色繁多，非常適合盆栽，市場價值巨大。傳統微型月季種苗多采用扦插進行生產，相關研究集中在插穗的篩選、扦插基質、激素處理等方面。由于微型月季植株矮小，莖節較短，因此剪取插穗的量受限，制約了規模化繁殖。微型月季離體培養是解決其規模化繁殖問題的可行方法。微型月季“小伊甸園”株形緊湊，葉片油亮，花形標準，花期長，關于其離體培養技術尚未見到相關報道。對微型月季的離體培養雖有一定研究，但不同基因型響應培養條件有一定特異性，有必要對“小伊甸園”進行離體培養研究。我們用帶芽莖段作為外植體，探究合適的消毒滅菌方式，而后進行腋芽萌發誘導，隨后進行繼代增殖和生根誘導，進一步進行移栽種植，完善了“小伊甸園”組織培養體系，為種苗規模化生產以及遺傳轉化研究奠定基礎。

1" "材料與方法

1.1" "試驗材料" "選擇無病蟲害、生長良好的“小伊甸園”植株，取半木質化中段枝條為外植體，去掉葉片，剪成帶1個芽的莖段，洗去表面污漬，沖洗干凈后吸干水分，置于培養瓶中備用。

1.2" "試驗方法

1.2.1" "外植體消毒滅菌處理" "將清洗好的莖段外植體用升汞（0.1% HgCl2溶液）浸泡滅菌（浸泡時間梯度設置為3、5、8、12 min），無菌水沖洗6次，洗去殘余升汞，避免對外植體持續毒害，即得到滅菌后的莖段外植體（處理編號為A1-A4）。同時將清洗好的莖段外植體采用75%乙醇浸泡消毒（浸泡時間30 s），無菌水沖洗3次，再用升汞滅菌（浸泡時間梯度設置為3、5、8、12 min），最后用無菌水沖洗6次，得到無菌外植體（處理編號為A5-A8）。

外植體消毒滅菌后接種至培養基（MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，pH 5.8）進行培養。接種2周后統計污染率（污染率=污染外植體數/接種外植體總數×100%）和褐化率（褐化率=褐化外植體數/接種外植體總數×100%），綜合得到合適的滅菌條件。

1.2.2" "腋芽萌發誘導" "利用1.2.1中篩選得到的合適滅菌條件進行莖段外植體滅菌，得到無菌莖段外植體，然后以形態學上端向上接種至含有不同濃度6-BA、NAA和GA3的MS培養基（培養基設定為：MS+激素組合+蔗糖30 g/L +瓊脂6 g/L，pH 5.8）中，進行腋芽萌發誘導試驗。

腋芽萌發誘導培養基中的激素組合編號及濃度分別為：

B1：6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA3 1 mg/L;

B2：6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA3 3 mg/L;

B3：6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA3 3 mg/L;

B4：6-BA 3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA3 3 mg/L。

接種3周后統計腋芽萌發率（萌發率=萌發外植體數/接種外植體總數×100%），同時測量腋芽高度。

1.2.3" "叢生芽繼代增殖" "將萌發的腋芽切下接種于繼代增殖培養基（培養基設定為：MS+激素組合+蔗糖30 g/L +瓊脂6 g/L，pH 5.8）中，進行繼代增殖誘導得到叢生芽。激素濃度組合編號及濃度分別為：

C1：1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA;

C2：2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA;

C3：3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA;

C4：1 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA;

C5：2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA;

C6：3 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA。

培養4周后統計增殖倍數和株高。

1.2.4" "生根誘導" "以1.2.3中增殖的叢生芽為外植體，待其長至2～3 cm時，切割成單苗轉接到生根培養基（培養基設定為：基本培養基+激素組合+蔗糖30 g/L +瓊脂6 g/L+活性炭1 g/L，pH 5.8）上誘導生根。基本培養基及激素濃度組合編號及濃度分別為：

D1：MS+IBA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L;

D2：MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L;

D3：MS+IBA 0.8 mg/L+NAA 0.3 mg/L;

D4：1/2MS+IBA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L;

D5：1/2MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L;

D6：1/2MS+IBA 0.8 mg/L+NAA 0.3 mg/L。

生根培養6周后統計生根率（生根率=生根外植體數/接種外植體總數×100%），隨后將生根苗從培養瓶中取出，清洗干凈瓊脂，后統計測量平均生根數、平均根長及株高。

以上除特別說明外，各處理均在培養室內培養，培養室溫度控制在25±2 ℃，空氣濕度控制在60%～70%，光照強度為2 000～3 000 lx，光照周期為12 h/d。

1.2.5" "組培苗移栽" "當組培苗在生根培養基中長至3～4 cm高，有兩條以上正常根時，可進行煉苗移栽試驗。先將組培瓶置于非恒溫環境、自然光照條件下煉苗2 d，后打開瓶蓋煉苗7 d，其間不定時觀察并噴水保濕。之后將長勢基本一致的試管苗取出，洗凈殘留瓊脂，移入基質中，基質設定為沙子、蛭石、園土與木屑1︰1混合基質3種類型。組培苗移栽后置于溫室中，初期每天少量多次噴水保濕，濕度保持在80%以上，遮陽網適當遮光。移栽21 d后統計成活率（成活率=成活組培苗數/種植組培苗總數×100%）和平均株高。

1.3" "數據處理及分析" "以上所有試驗均重復3次，所得數據用Excel及SPSS軟件進行統計分析，所展示數據為平均值±標準差。

2" "結果與分析

2.1" "外植體消毒滅菌處理" "不同消毒滅菌處理方式對污染率和褐化率影響如表1所示。

由表1可見，對比A1-A4處理，隨著升汞處理時間的增加，污染率逐漸降低，褐化率則有上升趨勢。同時對比A5-A8處理，也有相應的趨勢。在相同升汞處理時間下，預先經過75%乙醇消毒處理，污染率低于單用升汞滅菌，而在褐化方面無顯著差異。由此可見，先用75%乙醇消毒處理，再經升汞滅菌效果更好，不但污染率更低，而且對褐化率沒有顯著影響。綜合考慮，A7處理，即75%乙醇消毒30 s后升汞浸泡8 min滅菌，在污染率低的同時褐化率控制得也較好，是合適的消毒滅菌處理方式。

2.2" "腋芽萌發誘導" "接種后每天觀察腋芽萌發情況。接種培養3 d后，腋芽部位膨大，5 d后腋芽開始萌發。接種培養21 d后，由表2可知，處理B3的誘導率優于其他處理，達到100%，差異顯著，且腋芽高度也顯著高于其他處理。因此在腋芽誘導時可使用處理B3培養基，即MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA3 3 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，pH 5.8。

2.3" "叢生芽繼代增殖" "由表3可知，6種激素配比下增殖倍數有顯著差異，其中C2增殖倍數最高，達4.49，顯著高于其他處理，同時在株高方面表現最好。可見6-BA與NAA濃度比值在一定范圍內可達到較好效果。在繼代增殖時可選用C2培養基，即MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，pH 5.8。

2.4" "生根誘導" "生根誘導培養9 d后，D5培養基中的組培苗最先生根，之后其他處理陸續生根。6周后生長情況見表4。

由表4可知，當基本培養基為1/2MS時，同時添加IBA和NAA，均可達到較好的生根效果;當基本培養基為MS時，在IBA和NAA濃度較低時生根效果更好，可見基本培養基和激素濃度對生根均有一定影響。總體來看，當基本培養基為1/2MS時，生根率要顯著優于MS。此外，平均根數和平均根長均有類似趨勢。

株高則有相反趨勢。可能是因為基本培養基為1/2MS時，較低的離子濃度有利于生根誘導及根部生長，而MS培養基有較高的離子濃度，有利于植株上部生長。

以生根率和生根情況考察，誘導生根合適的培養基為D5，即1/2MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L+活性炭1 g/L，pH 5.8，此條件下生根率及根數根長表現最好，株高也表現不錯。

2.5" "組培苗移栽" "由表5可知，成活率方面，蛭石為栽培基質時達95%，顯著高于其他基質，沙子為基質時次之，土壤與木屑（1︰1）混合基質移栽成活率最低，僅有70%。此外在株高方面，蛭石為基質栽培時最高，因此在組培苗移栽時適宜選用蛭石為栽培基質。

3" "小結與討論

以帶芽莖段為外植體，得到合適的滅菌方式為75%乙醇消毒30 s后升汞浸泡滅菌8 min。同樣以莖段為外植體，有研究稱只需升汞滅菌3 min，還有研究稱需10 min。因此，實際處理時可根據污染情況采用不同的滅菌方法。

有報道表明，6-BA、NAA和 GA3組合對腋芽萌發誘導有良好效果，本研究結果與現有報道一致。有研究表明，低溫有利于腋芽萌發，而本研究在常溫下得到了100%的誘導率，可見低溫對“小伊甸園”腋芽萌發不是必需條件。

不同品種增殖倍數差異較大，有的只有2.1左右，有的則高達9.8，本試驗得到的結果為4.49，為比較合適的增殖倍數。

本試驗在同時添加IBA和NAA情況下，生根效果較好，與現有報道一致。

當基本培養基為1/2MS時，生根率總體顯著優于MS時，有報道表明基本培養基為1/4MS或WPM時生根效果較好，與本試驗結果有出入，后續可進一步研究。

本研究顯示合適的移栽基質為蛭石，成活率高、長勢好，與現有報道一致。

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