配施熒光假單胞菌對采煤區復墾土壤化學及生物學特性的影響

摘要：為探討無機肥、有機肥配施熒光假單胞菌對采煤區復墾土壤化學生物學特性的影響，以復墾5 a 的土壤為研究對象，設置單施無機肥（CF）、熒光假單胞菌劑配施無機肥（CFB）、單施有機肥（M）、熒光假單胞菌劑配施有機肥（MB）、不施肥（CK）共5 個處理。結果表明，MB 處理較M 處理有機質、堿解氮、有效磷、微生物量碳氮含量顯著增加了5.57%～21.30%，堿性磷酸酶、脲酶、轉化酶活性顯著增加了15.44%～18.68%；而CFB 處理較CF 處理僅堿解氮含量、脲酶活性分別顯著增加了4.77%、12.62%，表明熒光假單胞菌可以在一定程度上提高復墾土壤化學生物指標。復墾土壤的優勢菌門為放線菌門、變形菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門，優勢菌屬為節桿菌屬、芽生球菌屬、KD4-96、芽單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、類諾卡氏菌屬、Vicinamibacterales、Vicinamibactera?ceae、JG30-KF-CM45。施加熒光假單胞菌對復墾土壤細菌多樣性指數和優勢菌門、菌屬組成無顯著影響，但可在一定程度上改變細菌屬水平相對豐度。冗余分析結果表明，有機質、堿解氮對復墾土壤細菌群落的影響程度較高，脲酶、堿性磷酸酶、轉化酶對復墾土壤細菌群落的影響程度較低。主成分分析表明，與M 處理相比，MB 處理的綜合得分增加了2.92；與CF 處理相比，CFB 處理的綜合得分增加了1.82。綜上，熒光假單胞菌的施用有利于采煤復墾區土壤的熟化，且熒光假單胞菌與有機肥配施效果優于熒光假單胞菌與無機肥配施。

關鍵詞：熒光假單胞菌；采煤復墾區；土壤化學特性；土壤生物學特性

中圖分類號：TD88 文獻標識碼：A 文章編號：1002?2481（2024）04?0001?08

我國作為世界上最大的煤炭生產國和消費國，截至2020 年底，煤炭資源查明儲量為1.73 萬億t，占世界儲量的13.3%，預計2024 年全國煤炭產量將維持在47.0 億t 左右[1-2]。由于大量的煤炭開采對農田造成了嚴重的損毀，僅山西一省因采煤而損毀的農田面積就超過10 萬hm2。在對這些農田復墾過程中由于施工工藝等原因，造成了復墾土壤養分流失、孔隙比例失調，微生物數量銳減等[3-4]。

目前，我國主要采取施用有機肥、無機肥的方式來熟化采煤復墾區土壤，對有機肥、無機肥施用下復墾土壤物理、化學特性的變化規律已進行了較為詳盡的研究[5-6]，但對包括細菌群落在內的土壤生物學特性研究較少。細菌作為土壤微生物的重要組成部分，直接參與了土壤生態系統的物質循環和能量流動，在維持和改善土壤肥力等方面發揮著至關重要的作用[7]。因此，土壤生物學特性亦是采煤區復墾成功與否的關鍵指標。由于有機肥、無機肥缺少微生物等生物活體物質，導致物質能量轉化緩慢，復墾土壤生物學特性恢復時間較長[8-9]。

微生物復墾技術不僅可以利用微生物的接種優勢活化土壤養分、改良土壤生態環境等[10]，而且在保證土壤化學特性快速增加的同時可加快土壤細菌群落等土壤生物學特性恢復和重建。熒光假單胞菌作為一種重要的植物根際促生細菌，具有營養需求簡單、繁殖快、競爭定殖力強等特點[11]。在采煤復墾區的研究已表明，單施熒光假單胞菌可以活化土壤磷素，促進玉米生長[12]。熒光假單胞菌與硝態氮、銨態氮肥配施可以提高復墾土壤溶解性總氮、銨態氮量[13]，與有機肥配施可以提高復墾土壤微生物量碳、氮含量和酶活性[14]。這些研究表明，熒光假單胞菌在采煤區復墾土壤熟化方面具有極大的應用潛力。

目前，針對熒光假單胞菌應用于復墾土壤的研究多集中在土壤化學特性方面，關于其對復墾土壤細菌豐富度、多樣性等生物學特性的影響以及化學生物學特性間的相互關系還未見報道。本研究以山西省屯蘭煤礦填埋區復墾5 a 的土壤為對象，分析配施熒光假單胞菌對復墾土壤化學及生物學特性的影響，以揭示復墾土壤化學與生物學特性間的關系，進而為熒光假單胞菌在采煤復墾區的應用及復墾土壤的快速熟化提供理論依據和技術支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于山西省古交市以南6 km 的屯蘭煤礦廢棄物（風化煤、煤泥、煤矸石）填埋區，屬于暖溫帶半濕潤大陸性季風氣候。年平均氣溫9.50 ℃，年平均降水量475.00 mm。2012 年煤礦廢棄物堆置填埋完成后，取附近山體土壤覆蓋煤礦廢棄物，覆土類型為石灰性褐土，覆土厚度約1.00 m。同時采用混勻、翻耕等方式，使試驗地土壤具有相似的化學性質：pH 值為8.53，有機質含量為3.45 g/kg，全氮含量為0.19 g/kg，全磷含量為0.25 g/kg，全鉀含量為11.97 g/kg，堿解氮含量為9.58 mg/kg，有效磷含量為2.51 mg/kg，速效鉀含量為55.46 mg/kg。本次試驗于2016 年開始。

1.2 供試材料

供試作物為玉米（大豐30）。供試菌種為2 株于2014 年分離自山西省農田土壤的熒光假單胞菌（P. fluorescens），編號為N64-1、N137-1，由北京美吉桑格生物醫藥科技有限公司鑒定（2015），現保存于山西農業大學資源環境學院微生物實驗室。經檢測，N64-1、N137-1 均具有固氮解磷能力（固氮量分別為4.54、4.44 mg/L（半微量開氏法），D/d 值分別為1.39、1.57（平板溶磷圈法）），在0～40 ℃ ，pH值為6～9，呈現較好的生長態勢，可利用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇等多種碳源，且2 株菌間無拮抗作用。將2 株菌分別接種至LB 液體培養基，在28 ℃條件下，150 r/min 搖床培養至活菌數為1.0×108 cfu/mL，然后等體積混合制成熒光假單胞菌劑。供試肥料為尿素（N 46%）、過磷酸鈣（P2O516%）、氯化鉀（K2O 60%）、腐熟雞糞（N 1.45%、P2O5 1.14%、K2O 0.85%）。

1.3 試驗設計

以等量施肥為原則（約周邊正常農田施肥量的1.5 倍），共設5 個處理：單施無機肥（CF）、熒光假單胞菌劑配施無機肥（CFB）、單施有機肥（M）、熒光假單胞菌劑配施有機肥（MB）、不施肥（CK）。每個處理重復3 次，小區面積為100 m2。各施肥處理均在播種前一天，將肥料以旋耕播撒方式作為底肥一次性施入，施肥量如表1 所示。玉米拔節期除草1 次，玉米生育期均未進行灌溉。播種密度為6.0 萬株/hm2。

1.4 樣品采集及指標測定

土壤樣品于2020 年玉米收獲后采集，為試驗第5 年土壤樣品。按照農化分析樣品的要求進行采集，采樣深度0～20 cm，將土壤樣品分為3 份。一份4 ℃保存，用于測定土壤微生物量碳氮（采樣后12 h 完成），一份-80 ℃保存，用于高通量測序，一份經風干后，研磨過1.00 mm 篩，用于其余土壤化學特性和生物學特性測定。

土壤pH 值采用電極法（水∶土＝2.5∶1）測定，有機質（SOM）采用重鉻酸鉀容量法（外加熱）測定，堿解氮（AN）采用堿解擴散法測定，有效磷（AP）采用0.5 mol/L 碳酸氫鈉法測定，速效鉀（AK）采用醋酸銨浸提-火焰光度法測定[15]，微生物量碳（MBC）、微生物量氮（MBN）含量采用氯仿熏蒸-浸提法測定[16]，過氧化氫酶（Catalase）活性采用容量法測定，脲酶（Urease）活性采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定，堿性磷酸酶（Phosphatase）活性采用磷酸苯二鈉比色法測定，轉化酶（Invertase）活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定[17]。

土壤DNA 提取及高通量測序。稱取0.25 g 土壤樣本，按照Power soil DNA isolation kit（MoBioLaboratories，USA）試劑盒說明，提取土壤總DNA，并采用Nano Drop ND-2000（Thermo Fisher Scientific，USA）微量分光光度儀定量并檢測純度。提取的DNA 存儲于-80 ℃ 冰箱，用于后續的高通量測序分析。16S V3+V4 區PCR 擴增正向引物為341F：5'-CCTACGGGNBGCASCAG-3'，反向引物為806R：5'-GACTACNVGGGTATCTAATCC-3'。PCR反應體系總體積為25 μL。PCR 反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個循環；最后72 ℃延伸5 min。產物利用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR 的凝膠電泳產物委托廣州基迪奧生物科技有限公司使用Illumina MiSeq 測序平臺測序。

1.5 數據處理

采用SPSS 25.0 軟件進行數據統計分析，采用Origin 2021 處理數據并制圖，單因素方差分析檢驗處理間差異，差異性顯著水平為Plt;0.05。數據均為3 次重復后的平均值，表中數據為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 熒光假單胞菌對復墾土壤化學特性的影響

不同施肥處理下復墾土壤化學特性分析結果如表2 所示。從表2 可以看出，有機質、堿解氮、有效磷含量最高的施肥處理均為MB 處理，且MB 處理與CF、CFB、M 處理相比差異達顯著水平（Plt;0.05）。M 處理速效鉀含量最高，但只與CF、CFB 處理差異達顯著水平（Plt;0.05）。各施肥處理的pH 值相似。CFB處理與CF 處理相比僅堿解氮含量顯著增加了4.75%（Plt;0.05）。MB 處理與M 處理相比，有機質、堿解氮、有效磷含量分別顯著增加了7.82%、14.29%、15.91%（Plt;0.05）。

2.2 熒光假單胞菌對復墾土壤生物學特性的影響

2.2.1 熒光假單胞菌對復墾土壤微生物量及酶活性的影響

由表３可知，MB 處理與CF、CFB、M 處理相比，微生物量碳含量分別顯著增加了46.26%、40.82% 和21.30%，微生物量氮含量分別顯著增加了29.90%、20.67% 和6.68%，堿性磷酸酶活性分別顯著增加了67.27%、50.82% 和16.46%，脲酶活性分別顯著增加了52.43%、35.34% 和15.44%，轉化酶活性分別顯著增加了73.73%、66.18% 和18.68%（Plt;0.05）。各施肥處理間的過氧化氫酶活性無顯著差異。CFB 處理與CF 處理相比，僅脲酶活性顯著增加了12.62%（Plt;0.05）。

2.2.2 熒光假單胞菌對土壤細菌群落的影響

從表4 可以看出，土壤樣品的覆蓋度均高于99.70%，且各處理間覆蓋度無顯著性差異，表明測序深度可以滿足分析要求。土壤細菌豐富度指數大小表現為MBgt;Mgt;CFBgt;CKgt;CF，其中，CF 處理較CK顯著降低了3.53%（Plt;0.05）；MB、M、CFB 處理較CK 增加了2.47%～4.64%，且MB、M 處理與CK 相比差異達顯著水平（Plt;0.05）。多樣性指數的大小順序為MBgt;Mgt;CFBgt;CFgt;CK，其中，MB、M 處理較CK 多樣性指數分別顯著增加了4.14%、2.48%。CFB 處理與CF 處理相比，多樣性指數無顯著性差異。MB 處理的豐富度指數、多樣性指數與M 處理相比均未達顯著性水平。

由圖1 可知，復墾土壤的優勢菌門均為放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadota）和擬桿菌門（Bacteroidota）（相對豐度≥3%），占比超過總細菌群落的90.82%。CFB 處理較CF處理放線菌門、變形菌門、擬桿菌門相對豐度分別降低了0.74%、3.48%、0.25%，綠彎菌門、芽單胞菌門分別增加了3.87%、0.36%。MB 處理與M 處理相比，放線菌門、綠彎菌門相對豐度分別降低了0.85%、0.75%，變形菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門相對豐度分別增加了0.36%、0.56%、0.42%。

如圖2 所示，在屬水平上，節桿菌屬（Arthro?bacter）、芽生球菌屬（Blastococcus）、KD4-96、芽單胞菌屬（Gemmatimonadaceae）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、Vicinamibacterales、Vicinamibacteraceae、JG30-KFCM45為優勢菌屬（相對豐度≥2%）。從聚類分析發現，CF、M 處理聚為一簇，CFB、MB 處理聚為一簇，CK 處理單獨為一簇。

2.3 復墾土壤特性因子與細菌群落的關系

對復墾土壤特性因子與細菌群落進行RDA 分析，結果如圖3所示，RDA1解釋總變異量的34.68%，RDA2 解釋總變異量的15.63%，二者共同解釋了細菌群落變異量的50.31%。在屬水平上，有機質、堿解氮對細菌群落的影響程度較高，pH 值、脲酶、堿性磷酸酶、轉化酶對細菌群落的影響程度較低。

2.4 復墾土壤化學及生物學特性的主成分分析

為進一步直觀了解熒光假單胞菌對復墾土壤化學及生物學特性的影響，對土壤有機質等因子進行主成分分析。根據特征值gt;1，提取出2 個主成分。第1 主成分（PC1）的特征值為8.74，方差貢獻率為79.49%，第2 主成分（PC2）的特征值為1.60，方差貢獻率為14.57%，二者共解釋了方差變量94.06% 的變異，可以代表系統內的所有信息。施肥處理及CK 在2 個主成分上的得分如圖4 所示，各處理的綜合得分大小依次為MBgt;Mgt;CFBgt;CFgt;CK。其中，MB 處理綜合得分較M 處理提高了1.78，CFB 處理綜合得分較CF 處理提高了0.50，表明熒光假單胞菌與有機肥配施對復墾土壤特性的影響高于熒光假單胞菌與無機肥配施。

3 結論與討論

熒光假單胞菌作為一種重要的植物根系促生菌，已被證明，其在農業生產、復墾土壤熟化方面具有巨大的應用潛力。與大多數微生物菌劑類似，以熒光假單胞菌菌種制成的菌劑也存在穩定性差的缺點，尤其是養分貧瘠的復墾土壤環境更不利于其生存[18]，因此，本研究采用熒光假單胞菌與無機肥、有機肥結合施用的方式[19-20]，增加其在復墾土壤中的定殖時間，用以保持肥效的穩定。研究結果表明，各施肥處理較不施肥處理顯著提高了復墾土壤的有機質、堿解氮、有效磷、速效鉀、微生物量碳氮含量及堿性磷酸酶、脲酶、轉化酶活性，其中熒光假單胞菌與有機肥配施效果最佳，這與大多數研究結果一致[21]。本研究還發現，復墾土壤pH 值、過氧化氫酶活性并無顯著變化，這是由于熒光假單胞菌配施的無機肥、有機肥均呈堿性，無機肥、有機肥中含有的OH-會與熒光假單胞菌等土壤微生物分泌的有機酸以及呼吸產生的CO2 在土壤溶液中溶解形成的H+發生酸堿中和反應[22]；過氧化氫酶的輔基則是遭到了無機肥、有機肥中陰離子的封阻[23]。這與袁玲等[24]的研究結果相一致。不同處理在2 個主成分上的綜合得分結果進一步表明，熒光假單胞菌與有機肥配施對復墾土壤熟化的效果優于熒光假單胞菌與無機肥配施。這是由于無機肥僅能為熒光假單胞菌提供氮源、碳源及少量無機鹽，而有機肥可以通過增加土壤有機膠體，把土壤顆粒膠結起來使其變成穩定的團粒結構，提高了復墾土壤保肥能力[25]，持續不斷提供熒光假單胞菌生長所需的碳源、氮源、無機鹽、生長因子等營養要素，使復墾土壤中微生物數量有了顯著提高，改善了土壤微生物區系，增強了土壤生物和生化活性，直接增加了微生物量和酶的分泌[23]。同時熒光假單胞菌生長繁殖又促進了有機養分的釋放，形成良性循環，從而加速了復墾土壤的熟化。

已有研究表明，礦區經過煤炭資源開采等嚴重擾動后，細菌群落多樣性呈現降低的趨勢[26]，但隨著外源微生物肥料的加入提高了土壤養分含量、微生物代謝功能和利用碳源的能力，以及復墾年限增加導致的土壤微生物生存環境不斷改善，致使土壤細菌的多樣性、豐富度呈現提高的趨勢。本研究結果還表明，復墾土壤的優勢菌門均為放線菌門、變形菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門和擬桿菌門。這是由于放線菌門等具有相當大的生理、形態和代謝多樣性，能夠在惡劣的環境條件下生存，是復墾土壤中數量最多、代謝多樣性最豐富的細菌門[27]。其中，綠彎菌門含有綠色色素，與作物地上部生物量呈顯著正相關關系[28]，熒光假單胞菌可以通過影響作物生長來促進綠彎菌門繁殖和生長。芽單胞菌門因其具有特殊的生理結構，可以適應復墾土壤惡劣環境，是典型的旱地優勢菌門[29]。但作為農田土壤中的第二大細菌類群的酸桿菌門，因其主要生存在酸性土壤環境中[30]，而本試驗土壤呈堿性，因此使酸桿菌門喪失了在復墾土壤中優勢菌門的地位。相較于菌門水平，熒光假單胞菌對細菌種群分布的影響更突出地表現在屬水平上。本研究聚類分析發現，CF、M 處理聚為一簇，CFB、MB 處理聚為一簇，熒光假單胞菌的施用使Vicinamibacterales、Vicinamibacteraceae、JG30-KF-CM45 的相對豐度增加。孟會生等[31]研究結果表明，微生物菌肥與有機肥配施會使對土壤熟化有利的諾卡氏菌屬等細菌群落明顯增加，因此，推測Vicinamibacterales、Vicinamibacteraceae、JG30-KF-CM45 中是含有某些有利于土壤熟化的細菌，但其正確性還需進一步研究驗證。土壤細菌作為地表下數量巨大的生命形式，廣泛參與了土壤氧化、硝化、氨化等土壤發生發育全過程，土壤又反作用于其活性、群落結構和功能狀態[32]。本研究結果表明，土壤化學特性指標對細菌群落的影響程度高于土壤生物學特性指標。這是由于有機質、堿解氮等通過提供養分的方式，直接提高了土壤細菌的數量、活性[33]，而脲酶、堿性磷酸酶等主要取決于土壤微生物的數量、活性。張洋等[34]研究發現，養分含量貧瘠的土壤具有相似的生物細菌群落，該結論也印證了土壤化學特性是影響細菌群落的重要因子[35]。

不同施肥處理對復墾土壤化學及生物學特性的影響由強到弱依次為熒光假單胞菌配施有機肥gt;單施有機肥gt;熒光假單胞菌配施無機肥施gt;單施化肥。其中，熒光假單胞菌配施有機肥較其他施肥處理土壤有機質、堿解氮、有效磷含量顯著增加了7.82%～52.41%，微生物量碳氮含量顯著增加了6.68%～46.26%，堿性磷酸酶、脲酶、轉化酶活性顯著提高了15.44%～73.73%。配施熒光假單胞菌對復墾土壤細菌多樣性指數無顯著影響，在菌門水平上，各處理優勢菌門均為放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadota）和擬桿菌門（Bacteroidota）（相對豐度≥3%）。在菌屬水平上，熒光假單胞菌可以改變土壤細菌的聚類結果。相較于菌門水平，熒光假單胞菌對細菌種群分布的影響更突出地表現在菌屬水平上。有機質、堿解氮等土壤化學特性對細菌群落的影響程度明顯高于脲酶、堿性磷酸酶、轉化酶等土壤生物學特性。

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基金項目：國家自然科學基金重點項目（U1710255）