浙江道地延胡索優質品種性狀及其生物堿含量研究

延胡索是我國傳統中藥材中的常用大宗藥材之一，產地多且適應性強，其中浙江省為其主要的道地產區之一.延胡索生產中多采用自繁自種的無性繁殖，易產生種質退化等問題，導致其產量和品質良莠不齊.采用基因條形碼ITS2序列檢測技術、田間延胡索性狀記錄及高效液相色譜分析等技術，對浙江省3個主要品種來源的延胡索浙胡1號（YHS-1）、浙胡2號（YHS-2）和延胡索3號（農戶自保種，YHS-3）進行延胡索的基源鑒定、田間性狀分析和主要芐基異喹啉型生物堿的含量分析，以篩選浙江地區延胡索的優良品種.基源鑒定數據結果顯示，YHS-2與延胡索Corydalis Yanhusuo W. T. Wang（NCBI編號MH260617.1和MH260618.1）的親緣關系較近，YHS-3次之，而YHS-1親緣關系較遠.田間數據結果顯示，與另外2個品種相比，YHS-2具有花多且密，花期短以及塊莖產量高的優良生產性狀.建立6種芐基異喹啉型生物堿的快速檢測方法分析3個品種中生物堿的含量.結果顯示，YHS-2中各生物堿的含量顯著優于YHS-1和YHS-3（plt;0.05）.表明3個品種中YHS-2更為適合浙江地區的生存環境，可作為目前延胡索浙江栽培的優質品種推廣種植和使用.

延胡索; 基因條形碼; 田間性狀; 生物堿含量

Q948

A

0779-07

06.007

延胡索又名元胡、玄胡等，是我國傳統藥材中常用大宗藥材之一.由于藥用歷史悠久、各地用藥習慣不同，目前有超過15種延胡索類植物的球莖在不同地區作為延胡索藥材使用，品種較為混亂[1].藥材使用的混亂對藥物使用的安全性及有效性埋下巨大隱患.因此，自2020版《中華人民共和國藥典》起將正品延胡索藥材規定為罌粟科紫堇屬多年生草本植物延胡索Corydalis Yanhusuo W. T. Wang（NCBI編號MH260617.1和MH260618.1）的干燥塊莖[2].據《本草綱目》記載，延胡索能行血中氣滯，氣中血滯，專治一身上下諸痛，具有活血、行氣、止痛之功效[3].在我國及東亞等地，延胡索被廣泛用于治療胸脅、脘腹疼痛、經閉通經、產后瘀阻、跌撲腫痛等疾病[3-7].現代藥理和藥效分析表明：延胡索的主要藥用成分為芐基異喹啉型生物堿，包括延胡索乙素、延胡索甲素、四氫小檗堿等成分，具有潛在的抗腫瘤、抗心肌缺氧缺血、抗炎、抗腫瘤、抑制血小板聚集、鎮痛和鎮靜安眠等作用[8-11].

延胡索多生于蔭蔽、潮濕的山林等地，喜溫暖濕潤氣候，怕干旱＼，畏強光＼，能耐寒，因其適應性強、栽培周期短等特點，全國產地分布廣泛，在我國南方和北方皆有種植[12-15].目前延胡索的主要種植區有浙江、安徽、陜西及三峽庫區等地[12].而浙江省因氣候和地理等因素一直是延胡索的主要道地產區，浙江產的延胡索與白術、白芍、浙貝母、杭白菊、玄參、筧麥冬、溫郁金并稱“浙八味”.目前市場上流通的延胡索大多數以人工無性繁殖（塊莖繁殖）的種植方式為主，且農戶多為自家留種，種質資源混亂，藥材質量良莠不齊[12].因此，規范延胡索的種植品種，選取優質的延胡索品種，對延胡索的中藥材產業的發展具有極其重要的意義[1].

本實驗以浙江地區的常用品種浙胡1號（YHS-1）、浙胡2號（YHS-2）以及隨機從農戶手中收集延胡索3號（YHS-3）進行基因條形碼基源鑒定和田間實驗，觀察延胡索遺傳背景、田間生產形狀和藥效成分含量分析，為獲得浙江產區的優質延胡索種質資源提供實驗依據.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試品種：浙胡1號，源于地方品種，2007年通過浙江省認定［審定編號：浙認藥2007002］;浙胡2號，來源于本地種變異株，2015年通過浙江省審定［審定編號：浙（非）審藥2014001］;延胡索3號，農戶自保品種.

對照品：非洲防己堿（成都普思生物科技股份有限公司，CAS：3621-36-1）、鹽酸巴馬汀（源葉生物，CAS：10605-02-4）、脫氫紫堇堿（成都普思生物科技股份有限公司，CAS：30045-16-0）、延胡索乙素（成都普思生物科技股份有限公司，CAS：2934-97-6）、四氫小檗堿（源葉生物，CAS：522-97-4）、延胡索甲素（成都普思生物科技股份有限公司，CAS：518-69-4）純度≥98%.乙腈為色譜級;水為超純水.DNA聚合酶（美國APE×BIO，編號：K103445133F073）、CTAB提取液（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，編號：NEP044）、DNA抽提液Ⅱ（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，編號：NEP040）.

1.2 方法

1.2.1 3種延胡索DNA的提取

延胡索的基因提取采用CTAB法提取DNA.取延胡索塊莖，粉碎機粉碎，稱取約0.5 g粉末.將粉末移入1.5 mL離心管，加入800 μL CTAB（65 ℃預熱）分離緩沖液，上下顛倒離心管，混合均勻.將盛有樣品的離心管置于65 ℃水浴中保溫1 h，其間每隔3～4 min輕搖混勻.12 000 r/min離心5 min，將上層水相轉移至新的離心管中.加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇（體積比25∶24∶1），上下顛倒離心管，混合均勻;低溫12 000 r/min離心5 min，將上層水相轉移至新的離心管中.加入2/3倍體積的異戊醇，輕輕混勻，置于-20 ℃沉淀30 min.加500 μL體積分數75%無水乙醇清洗DNA，12 000 r/min離心5 min去上清，沉淀盡量干燥.加入適量的DEPC-Water（20～50 μL）溶解沉淀.取適量基因組DNA樣品，電泳檢測.

1.2.2 基因條形碼ITS2序列基因的PCR擴增

反應體系：模板DNA1 μL，2×PCR Mixture 25 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，無菌水20 μL.正向引物ITS2F：5′-ATG CGA TAC TTG GTG TGA AT-3′.反向引物ITS2R：5′-GAC GCT TCT CCA GAC TAC AAT-3′.PCR反應條件：95 ℃，5 min（95 ℃，30 s;50 ℃，30 s;72 ℃，90 s）循環30次;72 ℃，10 min.反應體系一共50 μL，置于200 μL PCR管中，混勻離心，進行PCR反應.反應結束后，立即進行瓊脂糖凝膠（質量分數1%）電泳，根據電泳結果，將PCR條帶位置正確的樣品，送擎科基因測序公司測序.

1.2.3 序列鑒別及基源鑒定

根據測序結果獲得ITS2序列基因，并與NCBI數據庫的延胡索（Corydalis Yanhusuo W. T. Wang）序列進行對比，利用mega軟件進行進化關系分析.

1.2.4 "3種延胡索的種植和大田實驗觀察

2020年10月8日將3種延胡索（YHS-1、YHS-2和YHS-3）播種于浙江省農業科學院試驗田，觀察3個品種的出芽和開花情況，并于2021年5月15日進行采收烘干，并統計塊莖直徑、單位畝產量.

1.2.5 標準溶液的制備

稱取非洲防己堿0.003 4 g;鹽酸巴馬汀0.007 8 g;脫氫紫堇堿0.005 1 g;四氫小檗堿0.007 6 g;延胡索甲素0.002 6 g;延胡索乙素0.001 5 g;一起混合加入10 mL容量瓶中定容，搖勻，得混合對照品溶液，再依次逐級稀釋.

1.2.6 色譜條件

流動相：乙腈（A）-體積分數0.1%磷酸水溶液（B）（三乙胺調節pH=6.03），梯度洗脫條件（0～16 min，體積分數24%～29%（A）;16～40 min，體積分數29%～70%（A））;體積流量1.0 mL/min;柱溫35 ℃;檢測波長280 nm;進樣量20 μL.

1.2.7 延胡索藥效成分的提取

根據藥典方法[2]，3種延胡索的干燥跨境粉碎機粉碎，過3號篩，稱取約0.5 g，精密稱定于平底燒瓶中，精密加入濃氨試液∶甲醇體積比1∶20混合溶液50 mL，稱定質量，冷浸1 h后加熱回流1 h，放冷，再稱定質量，用濃氨試液∶甲醇體積比1∶20混合溶液補足減失的質量，搖勻，濾過.精密量取續濾液25 mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，過膜，即得.

1.2.83種延胡索6種生物堿含量測定

線性關系：稱取非洲防己堿0.003 4 g;鹽酸巴馬汀0.007 8 g;脫氫紫堇堿0.005 1 g;四氫小檗堿0.007 6 g;延胡索甲素0.002 6 g;延胡索乙素0.001 5 g;溶解在10 mL容量瓶中，定容到10 mL，按等級逐級稀釋得到7個質量濃度梯度的對照品，依次進行上樣，得到其峰面積，進而算出線性關系.

精密度實驗：取同一份對照品（混合液），連續重復進樣6次，得到6種生物堿的峰面積，進行精密度計算.

穩定性實驗：將供試品溶液置于室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣6次，測得鹽酸巴馬汀、四氫小檗堿、脫氫紫堇堿、非洲防己堿、延胡索甲素、延胡索乙素峰面積，進行穩定性計算.

重復性實驗：取3種延胡索樣品各6份，制備成供試品，連續進樣6次，分別測得各自的峰面積，并進行重復性計算.

加樣回收率：精密稱取已測定含量的延胡索樣品0.5 g，每種各3份，依次加入“1.2.5”的對照品溶液中，制備加樣回收率的供試品溶液，按照“1.2.6”的條件進樣，以外標法計算加樣回收率.

2 結果與分析

2.1 3種延胡索基源鑒定和進化關系

利用CTAB法提出的3種延胡索的DNA，通過ITS2基因條形碼引物進行PCR反應擴增，并進行質量分數1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，結果發現：擴增獲得目的ITS2基因序列的大小在500 bp左右（圖1A）.將擴增的ITS2序列進行DNA測序，并于延胡索Corydalis Yanhusuo（MH260617.1和MH260618.1）進行對比和進化樹分析，結果顯示：YHS-2與該延胡索基因序列有93%的基因序列相同，進化親緣關系較為接近;而YHS-1和YHS-3與該延胡索基因序列的進化親緣關系疏遠（圖1B）.

2.2 3種延胡索的田間生產數據

經延胡索種植田間數據收集顯示：3種延胡索種植后在2個半月左右的時間均見新葉，但3個品種的開花時間和花期不同.其中YHS-1的開花期較早，并且花期較長約38 d;YHS-2的開花時間比YHS-1晚，但花期最短僅約15 d;而YHS-3的開花時間最晚，花期約18 d（表1）.同時發現：YHS-1的地上部分和花均較小，YHS-2的地上部分中等但花較為茂盛，而YHS-3的地上部分較為茂盛（圖2A和B）.3種延胡索塊莖的產量結果顯示：YHS-2的橫截面最大，約為1.38 cm2，產量最高，單顆質量約1.005 g，YHS-3的橫截面次之，約為1.19 cm2，但產量最低，單顆質量約0.836 g，而YHS-1的橫截面最低，約為1.14 cm2，單顆質量約0.870 g;同時YHS-1與YHS-2的橫截面具有極顯著性的差異（plt;0.05），而YHS-3與YHS-2的橫截面無顯著差異（表2）.但3個品種干燥后的單顆質量差異不顯著（表1＼，表2和圖2C）.

2.3 HPLC色譜分析

通過“1.2.6”色譜條件進行液相分析，獲得了1-非洲防己堿、2-鹽酸巴馬汀、3-脫氫紫堇堿、4-四氫小檗堿、5-延胡索甲素和6-延胡索乙素6種混合標準品較好的分離結果（圖3A）.同時對YHS-1、YHS-2和YHS-3提取物的6種物質分離效果也較為理想（圖3B～D）.

2.4 精密度試驗

取同一份對照品，連續重復進樣6次，測得鹽酸巴馬汀、四氫小檗堿、脫氫紫堇堿、非洲防己堿、延胡索甲素、延胡索乙素峰面積RSD分別為0.77%、0.31%、0.96%、0.93%、0.46%、0.34%.表明儀器精密度良好.

2.5 穩定性試驗

將供試品溶液置于室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣6次，測得鹽酸巴馬汀、四氫小檗堿、脫氫紫堇堿、非洲防己堿、延胡索甲素、延胡索乙素峰面積RSD分別為0.68%、1.01%、1.77%、1.78%、1.72%、1.54%.表明供試品溶液穩定性在24 h內良好.

2.6 重復性試驗

取3種延胡索樣品各6份，制備成供試品，連續進樣6次，測得YHS-1中鹽酸巴馬汀、四氫小檗堿、脫氫紫堇堿、非洲防己堿、延胡索甲素、延胡索乙素峰面積RSD分別為2.12%、0.60%、2.81%、1.34%、1.68%、2.68%;YHS-2中鹽酸巴馬汀、四氫小檗堿、脫氫紫堇堿、非洲防己堿、延胡索甲素、延胡索乙素峰面積RSD分別為1.32%、0.73%、1.67%、1.20%、0.54%、0.72%;YHS-3中鹽酸巴馬汀、四氫小檗堿、脫氫紫堇堿、非洲防己堿、延胡索甲素、延胡索乙素峰面積RSD分別為0.85%、1.63%、2.00%、1.33%、1.81%、1.76%.表明該條件下的供試品溶液重復性良好.

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已測定的含量的延胡索樣品0.5 g，每種各3份，依次加入“1.3.5”的對照品溶液中，制備加樣回收率的供試品溶液，按照“1.2.6”的條件進樣，計算加樣回收率.YHS-1中鹽酸巴馬汀、四氫小檗堿、脫氫紫堇堿、非洲防己堿、延胡索甲素、延胡索乙素的平均回收率為97.03%、97.87%、96.63%、98.93%、101.27%、96.97%，RSD分別為1.47%、1.51%、0.61%、2.83%、1.87%、1.40%;YHS-2中鹽酸巴馬汀、四氫小檗堿、脫氫紫堇堿、非洲防己堿、延胡索甲素、延胡索乙素的平均回收率為99.30%、97.83%、98.70%、97.90%、98.03%、97.70%，RSD分別為1.22%、1.02%、0.59%、1.28%、1.60%、0.90%;YHS-3中鹽酸巴馬汀、四氫小檗堿、脫氫紫堇堿、非洲防己堿、延胡索甲素、延胡索乙素的平均回收率為97.93%、98.20%、99.10%、95.90%、96.73%、99.57%;RSD分別為1.21%、1.50%、0.22%、0.92%、1.60%、0.20%.

2.8 線性關系考察

稱取非洲防己堿0.003 4 g;鹽酸巴馬汀0.007 8 g;脫氫紫堇堿0.005 1 g;四氫小檗堿0.007 6 g;延胡索甲素0.002 6 g;延胡索乙素0.001 5 g;溶解在10 mL的容量瓶中，定容到10 mL，按等級逐級稀釋得到7個質量濃度梯度的對照品.按“1.3.6”的條件進樣.以對照品峰面積作為縱坐標（y），質量（μg）為橫坐標（x）進行回歸，結果顯示6種成分的線性系數均達到0.999，實驗穩定性良好（表3）.

2.9 樣品含量測定

取3份延胡索各0.5 g，按照“1.2.5”的條件制備供試品溶液，按照“1.2.6”的條件進樣，用外標法計算3個延胡索品種樣品中鹽酸巴馬汀、四氫小檗堿、脫氫紫堇堿、非洲防己堿、延胡索甲素、延胡索乙素的含量，結果顯示非洲防己堿、鹽酸巴馬汀、脫氫紫堇堿、延胡索甲素、延胡索乙素和四氫小檗堿均在YHS-2中含量最高（表4），并且YHS-1/YHS-2和YHS-3/YHS-2的含量均具有顯著性差異（plt;0.05）.

3 討論

中藥的質量是保證臨床應用安全有效的前提，但由于中藥的基源復雜、產地和種植方式的不同，其不同批次存在顯著的藥效差異[16].此外，中藥的加工炮制過程也會因中藥材有效成分的減少與流失，造成質量與藥效的差異，如藥材的粉碎、貯藏條件、包裝材料等[17-18].隨著近些年來中藥材及飲片的研究不斷深入，其質量水平2013—2021年呈現穩步上升的趨勢[19].但同時不能忽視在中藥材生產過程中存在的明顯不足，其中一方面是資源環境的破壞導致部分中藥材資源的流失;另一方面是在中藥材生產中高合格率的趨勢下中藥整體質量的下降[20].因此挑選高質量中藥材原料是中藥材及飲片制作過程中最為關鍵的一步.

延胡索是傳統藥材中常用藥材之一，其主要藥用成分芐基異喹啉型生物堿，具有潛在的抗腫瘤、抗心肌缺氧缺血、抗炎、抗腫瘤、抑制血小板聚集、鎮痛和鎮靜安眠等作用[8-11].延胡索類藥材種類豐富、分布廣、產地多，各地生態習性有所不同，不同品種、同一品種不同產地藥材在化學成分上比較差異有統計學意義[21-25].在實際生產中又多采用自繁自種，種質退化嚴重，導致產量不穩定、質量參次不齊等問題[12].本研究利用基因條形碼ITS2序列[26-27]，對浙江省的3個延胡索品種：YHS-1、YHS-2和YHS-3進行延胡索的基源鑒定后發現：YHS-2與延胡索（MH260617.1和MH260618.1）親緣關系較近.同時通過田間數據結果發現YHS-2的各方面生產性狀在3種延胡索中最為突出.這可能與YHS-2為浙江省培育的適合浙江地域條件的延胡索的變異株有關[28].同時建立了可在40 min內檢測延胡索中6種芐基異喹啉型生物堿的快速高效液相的方法，較之前已報道的檢測方法（平均檢測時間在50 min以上）明顯縮短檢測時間[29-33].本實驗利用該法對3種延胡索品種中具有潛在藥用價值的6種生物堿含量進行了分析，結果發現YHS-2的各生物堿的含量，顯著高于YHS-1和YHS-3.因此，從本實驗結果來看，浙江省認定的浙胡2號（YHS-2）可能因突變原因適合浙江地區的生長環境，可作為目前延胡索浙江栽培的優質品種進行推廣和使用.但本實驗僅選取了3種延胡索品種進行了生物堿含量的測定，是否存在有比YHS-2更優質的延胡索品種仍需后續的實驗進行驗證，進一步推動浙江延胡索作為中藥材產品的質量提升.

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Study on Character and Alkaloid Content for High-quality Varieties

of Rhizoma Corydalis in Zhejiang Province

DONG Liyao1， LI Qun1， LI Jiacheng1， ZHAO Xinyun1， ZOU Hongling1， MA Huanyan2，CHEN Lin3， LI Mingqian4， ZHU Yongqiang4， WANG Shufang1

（1. School of Life Science， Sichuan Normal University， Chengdu 610101， Sichuan;

2. Zhejiang Agricultural Technology Extension Center， Hangzhou 310020， Zhejiang;

3. Sericultural Research Institute， Zhejiang Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310021， Zhejiang;

4. Cancer Institute， Zhejiang Academy of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou 310012， Zhejiang）

Corydalis Yanhusuo is one of the most commonly used popular medicinal materials in traditional Chinese medicine， with many producing areas and strong adaptability， among which Zhejiang Province is one of its primary areas. Self-seed and vegetative propagation in the production of C. Yanhusuo are prone to germplasm degradation， resulting in uneven yield and quality. In this study， the technique of gene bar code ITS2 sequence detection， field character recording and high-performance liquid chromatography were utilized to provide original identification， field character and main benzyl isoquinoline alkaloids content analysis for three principal C. Yanhusuo species from Zhejiang Province， including Zhejiang Hu 1 （YHS-1）， Zhejiang Hu 2 （YHS-2） and Corydalis 3 （farmers’ self-preservation varieties， YHS-3） were conducted， so as to screen the excellent varieties of C. Yanhusuo in Zhejiang area. Results of original identification showed that YHS-2 is close to the reported relatives of Wang et al.， and YHS-3 is second， while YHS-1 is distant. Field data revealed that compared with the other two varieties， YHS-2 had more flowers， shorter flowering period and higher tuber yield. A rapid assay method for 6 benzyl isoquinoline alkaloids was established to analyze the content of alkaloids in the three varieties. The findings reflected that the content of alkaloids in YHS-2 was significantly superior to that in YHS-1 and YHS-3（plt;0.05）. It is concluded that YHS-2 was more suitable for the living environment of Zhejiang area， and could be widely used as the high-quality varieties cultivated in Zhejiang province.

Rhizoma Corydalis; gene barcoding; field characters; alkaloid content

（編輯 周 俊）