九香蟲脂肪酸合酶基因克隆、生物信息學分析及時序表達譜研究

山地農業生物學報43（3）：15～20，2024Journal of Mountain Agriculture and Biology山地農業生物學報43（3）：～，2024Journal of Mountain Agriculture and Biology

接收日期：2023-09-19

基金項目：國家自然科學基金（82160743）

*通訊作者：郭建軍（1974—），男，博士，教授，主要從事資源昆蟲及其利用研究，E-mail：jjguo@gzu.edu.cn.

摘要：九香蟲Aspongopus chinensis Dallas，1851是中國傳統藥食兩用資源昆蟲，其需求量日增。然其存在嚴格的生殖滯育現象，脂肪酸合酶（Fatty Acid Synthase，FASN）與昆蟲滯育關系密切。本文根據九香蟲轉錄組數據設計了FASN特異性引物，提取九香蟲總RNA，利用PCR技術克隆出九香蟲脂肪酸合酶基因（AcFASN），利用生物信息學軟件對其進行了生物信息學和同源進化樹分析，并通過實時熒光定量試驗獲取了AcFASN在九香蟲中的時序表達圖譜。結果顯示：九香蟲AcFASN基因全長7092 bp，編碼2363個氨基酸；九香蟲AcFASN是親水性蛋白質，亞細胞主要定位于細胞質，是一種無信號肽、非跨膜、非分泌型蛋白。同源進化樹分析表明，AcFASN氨基酸序列與茶翅蝽Halyomorpha halys的FASN氨基酸序列進化關系較近。時序表達譜顯示AcFASN基因在滯育期表達量較高，預示著AcFASN基因極可能通過改變九香蟲體內AcFASN的表達量來影響九香蟲滯育等生命活動。

關鍵詞：脂肪酸合酶; 九香蟲; 基因克隆; 時序表達譜

中圖分類號：S899.9文獻標識碼：A

文章編號：1008－0457（2024）03－0015－06國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2024.03.003

九香蟲Aspongopus chinensis Dallas，1851是我國傳統的藥用昆蟲和食用昆蟲，屬昆蟲綱Insecta半翅目Hemiptera兜蝽科Dinidoridae［1］?，F代研究發現九香蟲具有良好的抗癌效用［2-3］和抗菌作用［4-5］。同時，在西南地區九香蟲還是一道地方傳統特色食品［6］。作為藥食兩用昆蟲，九香蟲的被需求量日益增加。

然而九香蟲成蟲存在嚴格的越冬滯育現象，滯育期長達7～8個月［7］。野生資源的日益減少以及滯育引起的難以人工養殖致使九香蟲市場供不應求，成為了九香蟲進一步研究應用的瓶頸，九香蟲滯育解除研究勢在必行。

脂肪酸合成酶（Fatty Acid Synthase，FASN）是FASN基因編碼的一種多功能蛋白，與昆蟲滯育密切相關，通過合成脂肪酸對昆蟲滯育進行調控。該功能已經在多種昆蟲中有體現，如滯育期七星瓢蟲Coccinella septempunctata體內FASN基因表達量高于正常發育期的七星瓢蟲［8］；在尖音庫蚊Culex pipiens早期滯育中FASN表達量上調［9］，敲除FASN I后導致蟲體內脂肪貯存量下降，進一步影響尖音庫蚊的越冬存活量［10］；甘藍跳甲Colaphellus bowringi中FASN基因通過影響脂質儲備量，進而調節滯育準備期時長和雌性中的滯育發生率等［11］。

為了明確FASN基因與九香蟲滯育的關系，為九香蟲滯育解除研究奠定基礎，本研究通過克隆九香蟲脂肪酸合酶基因、對其進行生物學特性分析以及其在九香蟲各齡期中表達變化研究，以期為九香蟲的滯育終止提供參考和理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗中使用的九香蟲采集于貴州省遵義市習水縣習酒鎮（東經106°15′，北緯28°20′），隨后在人工氣候室（寧波產江南儀器廠380A，具多段編程、低濕度調控、植物生長燈等功能）中，在溫度（28±1） ℃，相對濕度（85±5）%，光周期16L∶8D的條件下，以南瓜幼苗（密本南瓜，翁源得寶種業有限公司提供）喂養。

1.2試驗試劑

SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）、2×TSINGKE Master qPCR Mix（SYBR GreenI）（北京擎科生物科技有限公司）、pClone007 Versatile Simple Vector Kit（北京擎科生物科技有限公司）、2×Taq預混液（染料）（北京康潤誠業生物科技有限公司）、TSINGKE TSC-C14 DH5α Chemically Competent Cell（北京擎科生物科技有限公司）、High-Capacity cDNA反轉錄試劑盒（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）。

山地農業生物學報2024年第3期馮芷汀，等：九香蟲脂肪酸合酶基因克隆、生物信息學分析及時序表達譜研究1.3試驗方法

1.3.1九香蟲AcFASN的基因克隆

將九香蟲整蟲在液氮中碾碎至粉狀后，使用Trizol法提取RNA，隨后在1.0 %的瓊脂糖膠介導下電泳檢測RNA產物，同時使用分光光度儀檢測RNA產物以和測量其濃度。利用反轉錄試劑盒將九香蟲總RNA反轉錄合成為cDNA。

通過Primer Primier 5.0在AcFASN基因開放閱讀框內分段并設計引物（表1）。引物序列從上海生工生物工程公司合成。

以反轉的cDNA為模板，進行PCR擴增，反應體系（20 μL）（表2），擴增程序為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，Tm值下復性30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環，72 ℃延伸10 min，于4 ℃保存備用。PCR產物經1.0%的瓊脂糖電泳電泳檢測后，對目的片段進行膠回收。

回收產物連接到pClone007 kit并轉化至DH5α感受態細胞，復蘇1 h后，涂布到含有Amp抗性的LB平板培養基，37 ℃過夜培養后，挑單菌落至含Amp的LB液體培養基中擴增培養，進行菌液PCR驗證。挑選PCR驗證正確的菌液，送至生工生物有限公司進行測序，并將測序結果拼接后同轉錄組原始序列進行比對。

1.3.2九香蟲AcFASN基因編碼區序列的生物信息學分析利用轉錄組數據中得到的九香蟲AcFASN基因核苷酸序列的開放閱讀框，用SignalP 5.0 Server（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）對九香蟲脂肪酸合酶蛋白進行信號肽分析；用ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）預測九香蟲AcFASN相應的理化性質，通過ExPasy-ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）分析AcFASN蛋白親水或疏水性。糖基化位點和磷酸化位點分別采用NetOGlyc 4.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc）和NetPhos 3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos進行預測。使用predictprotien（https：//predictprotein.org/）九香蟲脂肪酸合酶蛋白的亞細胞定位預測，使用TMHMM Server v.2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）對AcFASN蛋白跨膜結構域預測。通過NCBI對九香蟲AcFASN蛋白結構域計算分析。同時使用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）的同源建模法預測AcFASN的三維分子結構，并使用predictprotien（https：//predictprotein.org/）在線工具對蛋白質的二級結構進行計算。

使用MEGA_64與Chiplo（https：//www.chiplot.online/tvbot.html）將AcFASN氨基酸序列與茶翅蝽Halyomorpha halys（XP_014291398）、豌豆蚜Acyrthosiphon pisum（XP_029346913.1）、煙蚜Myzus persicae（XP_024217508）、埃及伊蚊Aedes aegypti（XP_001659008）、異柄匙胸癭蜂Leptopilina heterotoma（XP_043482252）、黑腹果蠅Drosophila melanogaster（NP_647613.1）、西花薊馬Frankliniella occidentalis（KAE8736668）、凡納濱對蝦Penaeus vannamei（ROT68596）、褐家鼠Rattus norvegicus（CAA44679）和智人Homo sapiens（NP_004095）共11種物種進行比對分析；同時使用MEGA_64對其氨基酸序列計算得出進化樹。

1.3.3九香蟲AcFASN基因時序表達分析

Trizol法提取各齡期和滯育前后的九香蟲RNA，并進行cDNA鏈的合成，每組3次重復。通過Primer Primier 5.0于開放閱讀框內設計qPCR引物（表3）。

引物序列由生工生物有限公司合成，以反轉錄的九香蟲各齡期的cDNA為模板，按照2×TSINGKE Master qPCR Mix（SYBR GreenI）試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR，反應體系（20 μL）（表4），其擴增程序為：95 ℃預變性1 min。95 ℃循環反應中變性15 s，60 ℃退火處理30 s，72 ℃延伸30 s，循環40次。使用GraphPad 8.0.2、Eecel 2016對熒光定量PCR數據進行計算、分析和處理。

2結果與分析

2.1九香蟲AcFASN基因克隆與序列分析

2.1.1總RNA的提取

九香蟲成蟲總RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見到清晰、單一、明亮的28 S和18 S條帶（圖1），說明RNA未在提取途中降解。同時使用紫外分光光度儀測定其A260/A280為2.01，說明RNA純度符合后續試驗所需。

2.1.2九香蟲AcFASN基因的擴增

以九香蟲成蟲cDNA為模板進行PCR檢測，擴增的各段條帶位置與之相對應大小基本一致，電泳檢測如圖2。

2.1.3序列分析

將陽性菌液的測序結果導入DNAMAN 7.0比對。比對結果表明，AcFASN基因核苷酸序列與測序結果相一致，氨基酸序列經與DANMAN比對，二者相似度為99.92%，且包含完整ORF序列，這表明九香蟲AcFASN基因克隆成功。

2.2九香蟲AcFASN基因生物信息學分析

2.2.1AcFASN蛋白的理化性質分析

九香蟲AcFASN蛋白的化學分子式為C11 496H18 328N3116O3491S88，分子量為258.87 kDa，經計算推測等電點為6.0。其中，AcFASN蛋白中有279個帶負電荷氨基酸殘基和252個帶正電荷氨基酸殘基；且蛋白質不穩定指數為38.24，小于參考值40，這說明AcFASN蛋白理化性質穩定。由親水性平均系數（GRAVY）為 -0.163可推測該酶蛋白為親水性蛋白。此外，在糖基化位點預測中得出，AcFASN蛋白有8個N-糖基化位點，但無O-糖基化位點；磷酸化位點分析出AcFASN蛋白共有214個磷酸化位點，其中絲氨酸（Ser）125個，蘇氨酸（Thr）65個，酪氨酸（Tyr）24個磷酸化位點。

2.2.2蛋白二級結構和三維結構預測

使用哺乳動物體內得到的相似度46.73%的AcFASN蛋白氨基酸序列進行同源建模分析和二級結構分析，其中α-螺旋占34.41%，β-折疊占21.20%，無規則卷曲占44.39%，并得到AcFASN蛋白的三維分子結構（圖3）。

2.2.3保守結構域預測

保守結構域預測顯示，九香蟲AcFASN蛋白具有PksD（聚酮合酶?；D移酶）結構域、PKS_ER（烯基還原酶聚酮合酶中的烯基還原酶）結構域和KR_1FAS_SDR_x（脂肪酸合成β-酮還原酶）結構域等結構域。

2.2.4亞細胞定位、跨膜結構域與信號肽計算推測九香蟲AcFASN蛋白亞細胞定位預測結果表明該蛋白主要定位于細胞質；九香蟲AcFASN蛋白跨膜結構和信號肽預測出AcFASN是一種無跨膜結構、不含信號肽的非分泌性蛋白。

2.2.5進化樹的構建

依據九香蟲轉錄組氨基酸序列與NCBI上茶翅蝽、豌豆蚜、煙蚜、埃及伊蚊、異柄匙胸癭蜂、黑腹果蠅、西花薊馬和凡納濱對蝦、褐家鼠、智人的FASN氨基酸序列構建進化樹，結果表明，九香蟲與茶翅蝽的脂肪酸合酶聚為一支，說明二者脂肪酸合酶極可能擁有同一祖先（圖4）。

九香蟲各齡期AcFASN基因在5齡前隨著齡期增長而增加，在4齡相對表達量激增，而在5齡時相對表達量驟降。其中AcFASN基因在4齡若蟲中的表達量極高，均顯著高于其他齡期（Plt;0.05）。且AcFASN在九香蟲的滯育期和生殖成蟲中均有表達，但表達程度存在明顯差異。其中在滯育成蟲和生殖成蟲之間，滯育成蟲體內AcFASN表達量顯著高于正常發育期（Plt;0.05）（圖5）。

注：柱上不同字母表示經Tukey多重比較檢驗差異顯著（Plt;0.05）。

3討論與結論

九香蟲具有藥用價值和食用價值，但目前九香蟲市場供應量不足，主要原因是九香蟲滯育過長而導致的一年一代。本研究顯示，AcFASN基因與九香蟲的滯育相關性高。

生物信息學分析發現九香蟲AcFASN是一種亞細胞定位于細胞質親水性蛋白質，與AcFASN蛋白在細胞質生成軟脂酸的功能相符，而序列比對可見昆蟲FASN基因的不同屬間的基因結構差異較大。通過對九香蟲AcFASN蛋白的保守結構域推測可知：九香蟲AcFASN蛋白具有一定保守性。如有著PksD（聚酮合酶?；D移酶）、PKS_ER（烯基還原酶聚酮合酶中的烯基還原酶）等保守結構域，這些在各類昆蟲FASN蛋白中均有。同時，九香蟲也有茶翅蝽所不具有的KR_1FAS_SDR_x（脂肪酸合成β-酮還原酶）結構域，而親緣關系較遠的七星瓢蟲FASN蛋白［8］具有此結構域。結構域的差別，可能與不同種間脂肪酸合酶所進行的功能的差別有關。

九香蟲若蟲體型持續改變，會引起九香蟲對組成表皮的碳氫化合物需求量較大，而該化合物由AcFASN蛋白生成的脂肪酸參與合成［12］，因此在整個若蟲發育期間AcFASN基因在持續表達。同時，九香蟲AcJHEH基因的表達量在4齡時達到若蟲各齡期最大值，猜測其可能參與了脂肪酸的分解代謝［13］，這將直接導致4齡九香蟲體內脂肪酸含量降低。因此在4齡期間，九香蟲AcFASN基因表達量激增，以提高體內脂肪酸含量，供應蟲體正常發育。

而在滯育期間，脂肪作為九香蟲主要的能源物質儲存，能夠幫助九香蟲度過滯育期的不良環境［14］，可以由此推測脂肪的高需求導致了滯育期的AcFASN基因表達量較正常發育期高。在七星瓢蟲滯育中也有相同情況［8］。一方面，FASN蛋白能改變脂類物質的組成，調節細胞膜流動性，對提高生物體內環境穩定性和抗逆性有重要作用［15］，這可能是造成滯育期九香蟲AcFASN基因高表達的原因之一，從而有助于提高九香蟲在冬季的存活率。另一方面，有研究表明FASN基因的高表達與JH信號通路相關［11］，已證實JH信號對大猿葉蟲體內脂質積累起抑制作用［16］。同時，在九香蟲中注射外源JH會導致蟲體內AcFASN基因含量下降［17］，因此可推測在九香蟲體內JH信號也對脂質積累起抑制作用。在九香蟲滯育期中，由于AcJHEH基因的高表達，導致蟲體內JH信號含量下降［13］，進而減弱對脂質積累的抑制效果，從而促使AcFASN基因大量表達以貯存脂質，進一步提高了AcFASN的表達水平。AcFASN基因與九香蟲脂肪酸合成相關，進而影響九香蟲體內需脂肪酸的活動，如九香蟲生長、滯育和繁殖等。

本試驗對AcFASN基因時序表達的研究發現九香蟲的脂肪酸合酶基因從卵期到4齡依次增加，并且在4齡時達到最高水平；同時，滯育期蟲體內表達量顯著高于非滯育期。這為日后九香蟲滯育研究、人工飼養提供了一定的理論依據與數據支持。

（責任編輯：嚴秀芳）

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Cloning，Bioinformatics Analysis and Temporal Expression of the Fatty Acid Synthase Gene in Aspongopus chinensis Dallas

Feng Zhiting， Yin Zhiyong，Guo Jianjun*

（Institute of Entomology，Guizhou University/Guizhou Provincial Key Laboratory for Agricultural Pest Management of the Mountainous Region， Guiyang 550025，Guizhou，China）

Abstract：Aspongopus chinensis Dallas，1851，is a traditional medicinal and edible insect in China，with an increasing demand.Nevertheless，it shows strict reproductive diapause，which is influenced by Fatty Acid Synthase（FASN）.In this study，specific primers were designed for FASN based on the transcriptome data of A.chinensis， and total RNA was extracted and cloned using PCR.The FASN gene，known as AcFASN，was successfully cloned through the process of RNA extraction，reverse transcription，PCR，and ligation transformation.Bioinformatics and homologous evolutionary tree analysis were conducted using the gene sequence of FASN，while the temporal expression graphs of AcFASN were generated through real-time fluorescence quantitative PCR.The purpose of these analyses was to determine if AcFASN plays a role in diapause regulation.The results revealed that the AcFASN gene spans a total length of 7092 bp and codes for 2363 amino acids.Bioinformatics analysis showed that AcFASN was a hydrophilic protein that was non-secreted and was found in the cytoplasm without a transmembrane region or signal peptide.Phylogenetic tree analysis revealed a strong evolutionary connection between the FASN amino acid sequences of A.chinensis and Halyomorpha halys.Temporal expression analysis showed that the AcFASN expression level was elevated during diapause，suggesting that AcFASN may play a role in regulating the growth and development of A.chinensis by modulating its expression in the body.

Keywords：Fatty Acid Synthase；Aspongopus chinensis；gene cloning；temporal expression