紫蘇PfPIN基因家族的全基因組鑒定與生物信息學(xué)分析

山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)43（3）：21～26，2024Journal of Mountain Agriculture and Biology山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)43（3）：～，2024Journal of Mountain Agriculture and Biology

接收日期：2023-07-10

基金項(xiàng)目：貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合支撐[2021]一般128;黔科合服企[2021]13）；貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院項(xiàng)目（黔農(nóng)科院科技創(chuàng)新[2022]12；黔農(nóng)科種質(zhì)資源[2023]15）；銅仁市市級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目（銅市科研[2023]73）

*通訊作者：王文華（1975—），男，碩士，研究員，主要從事土壤肥料及農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究，E-mail：394115604@qq.com.

摘要：植物的生長(zhǎng)發(fā)育與內(nèi)源生長(zhǎng)素的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，PIN作為生長(zhǎng)素輸出載體在生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸中起關(guān)鍵作用，調(diào)節(jié)不同組織的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究基于紫蘇全基因組數(shù)據(jù)鑒定PfPIN基因家族，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：PfPIN基因家族共有15個(gè)成員，分布在8個(gè)染色體上，可劃分為6個(gè)不同的分支，PfPIN蛋白長(zhǎng)度在350～653 aa之間，分子量在38.10～70.71 kDa之間，等電點(diǎn)在7.18～9.58之間，內(nèi)含子數(shù)量為3～6個(gè)，均定位在細(xì)胞膜上且具有典型的跨膜結(jié)構(gòu)。啟動(dòng)子順式作用元件中包括與光、激素、脅迫響應(yīng)等相關(guān)順式作用元件，其中，光、植物激素響應(yīng)元件最為常見(jiàn)。本研究將為紫蘇生長(zhǎng)素相關(guān)研究提供方向，為后續(xù)紫蘇PfPIN基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：紫蘇；生長(zhǎng)素；PfPIN基因

中圖分類號(hào)：S567.219文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008－0457（2024）03－0021－06國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2024.03.004

紫蘇（Perilla frutecens）是唇形科一年生草本植物，起源于中國(guó)，已有兩千多年的種植歷史，并在亞洲國(guó)家（中國(guó)、韓國(guó)、日本、越南等）廣泛種植［1］。紫蘇的葉、梗、種子、根均可入藥，作為一種藥食同源作物，也是一種時(shí)尚蔬菜和保健品，具有抗炎、抗菌、解毒、抗氧化、抗癌和保肝等諸多藥理作用［2］。目前，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)紫蘇的需求巨大，而得益于我國(guó)豐富的紫蘇種質(zhì)資源優(yōu)勢(shì)，國(guó)內(nèi)很多省市已建成一批種植基地滿足紫蘇內(nèi)銷和出口的需要［3］。紫蘇產(chǎn)業(yè)在我國(guó)出口創(chuàng)匯、帶動(dòng)就業(yè)和增收致富的能力顯著，紫蘇種植已成為我國(guó)重要的特色優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)之一。而市場(chǎng)上的紫蘇品種供應(yīng)不足，品種使用混亂，種子退化嚴(yán)重［4］，由此，貧乏的紫蘇品種成為了制約紫蘇種植業(yè)發(fā)展的主要因素之一［5］。目前，紫蘇育種仍主要采用傳統(tǒng)育種方法，其周期長(zhǎng)、效率低，故而亟需開(kāi)展紫蘇優(yōu)良性狀相關(guān)基因資源的挖掘工作，以加快其生物育種產(chǎn)業(yè)化步伐。

生長(zhǎng)素幾乎參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的每一個(gè)過(guò)程，已在植物中得到廣泛的研究［6］。其在自然界中主要以吲哚-3-乙酸（IAA）形式存在。植物不同組織中生長(zhǎng)素不同濃度梯度的差異分布影響細(xì)胞的伸長(zhǎng)、分裂和分化，進(jìn)而調(diào)節(jié)胚胎發(fā)生、根系、花序、葉序發(fā)育、維管組織分化等［7］。生長(zhǎng)素濃度梯度的差異分布主要通過(guò)生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸實(shí)現(xiàn)，這依賴于質(zhì)膜上的生長(zhǎng)素輸入載體和生長(zhǎng)素輸出載體的分布實(shí)現(xiàn)。目前已經(jīng)研究了生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族包括AUX1/LAX、PIN、PILS及一些ABCB/PGP成員［8］，其中PIN蛋白家族是最主要的生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也是研究最為廣泛的生長(zhǎng)素輸出載體，PIN蛋白家族在擬南芥中由8個(gè)成員組成［9］。其中，AtPIN5和AtPIN8定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的穩(wěn)態(tài)；AtPIN6根據(jù)其磷酸化狀態(tài)在質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上雙重定位，參與生長(zhǎng)素運(yùn)輸及植物細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)素穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)；AtPIN1-4和AtPIN7定位在質(zhì)膜，控制細(xì)胞間生長(zhǎng)素定向轉(zhuǎn)運(yùn)，指導(dǎo)生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸［10］，這是生長(zhǎng)素梯度以及生長(zhǎng)素最大值形成的關(guān)鍵因素。PIN基因功能已在多種植物中得以驗(yàn)證，例如在擬南芥中，AtPIN1參與葉片形狀及葉脈結(jié)構(gòu)的形成［11］及重力和光響應(yīng)［12-13］等過(guò)程，AtPIN6參與花序梗伸長(zhǎng)［14］，花蜜的產(chǎn)生和短雄蕊發(fā)育［15］。ZmPIN1可調(diào)控玉米的花序分枝［16］，在水稻中OsPIN5b基因的過(guò)表達(dá)可引起多性效應(yīng)，可降低株高、葉片和分蘗數(shù)、地上部和根部生物量、結(jié)實(shí)率、穗長(zhǎng)和產(chǎn)量參數(shù)［17］。楊樹(shù)PtPIN5基因影響次生細(xì)胞壁的過(guò)早沉積和形成額外的纖維束［18］。由此推測(cè)在紫蘇中，生長(zhǎng)素可能具有應(yīng)用于籽粒、株型、葉形改良的潛力。

到目前為止，已通過(guò)全基因組鑒定了30多種植物物種的PIN基因［19］。由于紫蘇基礎(chǔ)研究仍相對(duì)薄弱，優(yōu)異基因挖掘和功能解析工作滯后，與生長(zhǎng)素運(yùn)輸載體相關(guān)基因家族的研究仍未見(jiàn)報(bào)道。本研究以四倍體紫蘇品種P.frutescens基因組為搜索對(duì)象，通過(guò)全基因組分析鑒定紫蘇PfPIN基因家族，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，本工作可為生長(zhǎng)素通路研究奠定基礎(chǔ)，有望為紫蘇提供優(yōu)良的基因資源。

1材料與方法

1.1紫蘇PfPIN基因家族的鑒定

從GenBank（http：//WWW.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/）下載P.frutescens的完整基因組、氨基酸和cds序列。從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)獲得PIN基因的隱馬爾可夫模型（PF03547）（http：//pfam.xfam.org），以擬南芥AtPIN氨基酸序列作為參考序列，通過(guò)HMMER和BLASTP搜索紫蘇的氨基酸序列。通過(guò)TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）、DeepTMHMM（https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM）分析推定的紫蘇PfPIN蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域［20］，含有生長(zhǎng)素運(yùn)輸載體保守跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白鑒定為紫蘇PfPIN基因。

1.2系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

選擇MEGA 11軟件［21］的ClustalW功能，將紫蘇與擬南芥的PIN氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，將比對(duì)后的序列以Neighbor-joining（NJ）方法，1000次重復(fù)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3紫蘇PfPIN基因結(jié)構(gòu)和氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)分析將PfPIN基因家族的cds序列和基因組序列通過(guò)Gene Structure Display Server（GSDS）（http：//gsds.gao-lab.org/）在線比對(duì)，獲得PfPIN基因的外顯子與內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖［22］。PfPIN蛋白保守基序通過(guò)MEME 5.5.4［23］分析（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）獲得。

1.4紫蘇PfPIN亞細(xì)胞定位及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

通過(guò)CELLO v2.5［24］（http：//cello.life.nctu.edu.tw）對(duì)PfPIN蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過(guò)ProtParam tool［25］（http：//web.expasy.org/protparam）在線預(yù)測(cè)PfPIN蛋白長(zhǎng)度、分子量和等電點(diǎn)。

1.5紫蘇PfPIN基因啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)

在紫蘇基因組序列中調(diào)取已鑒定的15個(gè)PfPIN基因起始密碼子ATG上游2000 bp的核苷酸序列。啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)通過(guò)PlantCare網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線完成，其可視化通過(guò)TBtools［26］軟件完成。

2結(jié)果與分析

2.1紫蘇PfPIN基因家族信息及蛋白理化性質(zhì)分析在紫蘇基因組中，共鑒定到15個(gè)PfPIN基因，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，根據(jù)其與擬南芥AtPIN基因的同源性進(jìn)行命名，當(dāng)多個(gè)紫蘇基因與同一擬南芥基因同源時(shí)，在基因后加a、b、c、d等來(lái)區(qū)分。其中，通過(guò)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果分析，AtPIN3、AtPIN4和AtPIN7與4個(gè)PfPIN基因聚集，根據(jù)進(jìn)化關(guān)系將這4個(gè)基因命名為PfPIN4a、PfPIN4b、PfPIN7a和PfPIN7b。鑒定的15個(gè)PfPIN基因分布在紫蘇1、2、5、6、7、10、15、17、20號(hào)染色體上。PfPIN蛋白長(zhǎng)度在350～653 aa之間，分子量在38.10～70.71 kDa之間，等電點(diǎn)在7.18～9.58之間，內(nèi)含子數(shù)量為3～6個(gè)。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，紫蘇PfPIN蛋白均定位在細(xì)胞膜上。PfPIN蛋白均具有典型的跨膜結(jié)構(gòu)，即在N-和C-末端具有兩個(gè)高度保守的疏水性跨膜區(qū)和一個(gè)中心親水環(huán)，通過(guò)DeepTMHMM預(yù)測(cè)的跨膜結(jié)構(gòu)均有10個(gè)（圖1）。

2.2紫蘇PfPIN蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

通過(guò)對(duì)紫蘇與擬南芥AtPIN家族進(jìn)化關(guān)系研究，有助于了解紫蘇PfPIN蛋白可能的生物學(xué)功能。從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，可以將PIN蛋白分為6組（圖2）：Ⅰ（AtPIN1、PfPIN1a/PfPIN1b/PfPIN1c/PfPIN1d）、Ⅱ（AtPIN2、PfPIN2a/PfPIN2b）、Ⅲ（AtPIN3/4/7、PfPIN4a/PfPIN4b/PfPIN7a/PfPIN7b）、Ⅳ（AtPIN5、PfPIN5）、Ⅴ（AtPIN6、PfPIN6a/PfPIN6b）、Ⅵ（AtPIN8、PfPIN8a/PfPIN8b）。本研究選用的P.frutescens基因組為紫蘇四倍體基因組，因此鑒定到的基因數(shù)量為15個(gè)，多于二倍體的擬南芥的8個(gè)。

2.3紫蘇PfPIN基因結(jié)構(gòu)及氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)分析將cds序列和基因組序列進(jìn)行比較，我們獲得了PfPIN基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)（圖3），可幫助我們理解PfPIN基因結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，PfPIN基因內(nèi)含子數(shù)量在3～6個(gè)之間。紫蘇PfPIN氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，所有PfPIN都具有3個(gè)高度保守的基序。

2.4紫蘇PfPIN基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

為進(jìn)一步了解PfPIN基因潛在的調(diào)控機(jī)制，了解其是否被植物激素、逆境等反應(yīng)元件調(diào)控，通過(guò)Plantcare預(yù)測(cè)的可能的順式作用元件如圖4所示，包含大量的光響應(yīng)元件，與激素響應(yīng)元件（如茉莉酸甲酯、生長(zhǎng)素、脫落酸、水楊酸、赤霉素等）明顯富集，此外還包括脅迫相關(guān)（低溫、防御和應(yīng)激、干旱響應(yīng)）的順式作用元件。其中，光、植物激素響應(yīng)元件最為常見(jiàn)。

3討論與結(jié)論

栽培紫蘇為異源四倍體，其多倍體化發(fā)生在近1萬(wàn)年以內(nèi)［27］。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)有6個(gè)PfPIN基因均存在基因重復(fù)，基因重復(fù)是基因組進(jìn)化過(guò)程中的一個(gè)重要事件，已有研究表明，很多源自多倍體的重復(fù)基因在作物馴化中發(fā)揮重要作用［28］。因此，推測(cè)紫蘇PfPIN基因的重復(fù)可能參與了進(jìn)化過(guò)程中的物種多樣化、環(huán)境適應(yīng)過(guò)程。通過(guò)生物信息學(xué)分析表明，紫蘇PfPIN具有保守的跨膜結(jié)構(gòu)，即在N-和C-末端具有兩個(gè)高度保守的疏水性跨膜區(qū)和一個(gè)中心親水環(huán)，這與擬南芥和水稻等植物中已鑒定的生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的保守結(jié)構(gòu)相似。生長(zhǎng)素輸出載體在細(xì)胞膜上的分布決定了生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸方向，PfPIN蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)均定位在細(xì)胞膜上，符合其作為生長(zhǎng)素輸出載體的功能。在PfPIN基因啟動(dòng)子順式作用元件分析中，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的順式作用元件中富集了大量激素（如生長(zhǎng)素、水楊酸、脫落酸、茉莉酸甲酯、赤霉素等）、脅迫（低溫、防御和應(yīng)激、干旱響應(yīng)）響應(yīng)元件。以光、植物激素響應(yīng)元件最為常見(jiàn)。內(nèi)源性的激素與信號(hào)肽以及光、重力、鹽等環(huán)境信號(hào)均影響PIN運(yùn)輸，進(jìn)而影響生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸［29］。已有研究表明，生長(zhǎng)素是植物對(duì)非生物脅迫反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)［30］，許多植物中已報(bào)道了非生物脅迫與生長(zhǎng)素之間的關(guān)系，水稻中OsPIN2基因過(guò)表達(dá)可在缺磷條件下調(diào)節(jié)根系生長(zhǎng)發(fā)育［31］。擬南芥中，通過(guò)活細(xì)胞的顯微鏡觀察顯示在低溫脅迫后AtPIN2蛋白運(yùn)輸減少［32］。番茄多個(gè)SlPIN基因在低溫、干旱脅迫下表達(dá)上調(diào)［33］。玉米ZmPIN基因在地上部受到高鹽和干旱表達(dá)上調(diào)，在根部表達(dá)下調(diào)，且在響應(yīng)鹽和干旱脅迫時(shí)表達(dá)模式相似［34］。

PIN蛋白作為研究最為廣泛的生長(zhǎng)素輸出載體，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。本研究通過(guò)對(duì)紫蘇PfPIN基因家族鑒定和分析，挖掘出該基因家族的同源基因，通過(guò)對(duì)PfPIN基因家族各基因的生物信息學(xué)分析，并結(jié)合模式作物擬南芥或者其他物種的已知信息對(duì)PfPIN基因進(jìn)行可能的功能分析，揭示其可能的生物學(xué)功能。我們推測(cè)PIN基因在紫蘇中可能具有應(yīng)用于籽粒、株型、葉形改良的潛力，也可能參與非生物脅迫的過(guò)程。由于紫蘇的基礎(chǔ)研究相對(duì)滯后，功能基因挖掘仍欠缺，我們通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)素通路相關(guān)基因的研究，將為后續(xù)研究紫蘇PfPIN基因功能及生長(zhǎng)素調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為紫蘇分子育種提供優(yōu)異基因資源。

（責(zé)任編輯：嚴(yán)秀芳）

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Genome-wide Identification and Bioinformatics Analysis of PfPIN Gene Family in Perilla frutescens

Zou Yifei，Wen He，Shang Zhiwei，Yang Sen，Qin Jiahao，Yu Shunbo，Wang Wenhua*

（Rapeseed Research Instiute，Guizhou Academy of Agricultural Sciences，Guiyang 550008，Guizhou，China）

Abstract：The regulation of endogenous auxin closely influences the growth and development of plants.The PIN genes，a family of auxin efflux carrier genes，play a crucial role in the polar transport of auxin，which in turn regulates the growth and development of different tissues.Based on whole genome data of Perilla，this study identified the PfPIN gene family and conducted bioinformatics analysis.The results indicated that there were 15 members in the PfPIN gene family，which were spread across 8 chromosomes and categorized into 6 distinct branches.The PfPIN protein can vary in length from 350 to 653 aa，with molecular weights ranging from 38.10 to 70.71 kDa.Additionally，its isoelectric points can range from 7.18 to 9.58，and the number of introns can vary from 3 to 6.All PfPIN proteins were situated on the cell membrane and exhibit typical transmembrane structures.The cis-acting elements of the promoter were associated with light，hormone，stress response，and other factors.Light and plant hormone response elements were the most common among them.This study will offer guidance for further research on auxin-related factors in Perilla and establish the groundwork for future investigations into the function of the PfPIN gene in Perilla.

Keywords：Perilla frutecens; auxin; PfPIN gene