糯玉米和普通玉米籽粒蛋白差異分析

摘" " 要：為了探討玉米糯性是否會影響籽粒儲藏蛋白組成及含量，明確糯玉米與普通玉米在基因表達上的差異，為糯玉米育種提供更多的基因資源，通過使用A-PAGE和轉錄組測序分析等技術，對普通玉米和糯玉米的籽粒儲藏蛋白組成及基因表達模式進行了分析。結果表明：糯玉米在籽粒儲藏蛋白組成上與普通玉米接近，同時糯玉米和普通玉米的醇溶蛋白遷移速率明顯快于小麥籽粒醇溶蛋白。基因表達上，玉米醇溶蛋白Zm00001d005793（mc1）在糯玉米和普通玉米上的表達模式上基本吻合，未見明顯差異；玉米醇溶蛋白Zm00001d049243（fl2）和Zm00001d048851（fl4）在糯玉米中表達豐度顯著低于普通玉米。以上結果說明，玉米糯性所在的調控通路可能影響籽粒儲藏蛋白編碼基因的表達。在育種過程中，應關注糯性和籽粒儲藏蛋白的變化，從而提升育種產品的多樣化，提高市場競爭力。

關鍵詞：玉米；籽粒儲藏蛋白；醇溶蛋白；加工品質

中圖分類號：S326； S513" " " "文獻標識碼：A" " " DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2024.06.002

Differential Analysis of Gene Expression in Kernels of Glutinous Maize and Common Maize after Pollination

CHEN Huafeng LIU Ying YUAN Yue ZHANG Xiao ZHANG Jianing LIU Dan

（1.Tianjin Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding， Tianjin Crop Research Institute， Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300384， China 2. Tianjin Zhongtiandadi Technology Company Limited， Tianjin 300384， China; 3. Hebei Normal University of Science amp; Technology， Qinhuangdao， Hebei 066000， China）

Abstract： In order to explore whether waxy properties of maize can affect the composition and content of storage protein， and to clarify the difference of gene expression between waxy maize and common maize， so as to provide more gene resources for waxy maize breeding. In this study， A-PAGE and transcriptome sequencing techniques were used to analyze the composition and gene expression patterns of seed storage proteins in common maize and waxy maize.. The results showed that the grain storage protein composition of waxy maize was identical to that of common maize， and the gliadin migration rate of waxy maize and common maize was faster than wheat grain gliadin. The expression pattern of Zm00001d005793（mc1） in waxy maize was comparable to that of common maize， although its expression abundance was lower. The expression patterns of zein Zm00001D005793（mc1） in waxy maize and common maize were similar， with no significant difference discovered. The expression of zein Zm00001D049243（FL2） and Zm00001D048851（FL4） was considerably lower in waxy maize than in common maize The results indicated that the regulation pathway of waxy traits in maize may affect the expression of genes encoding grain storage proteins. In breeding， we should pay attention to the changes of waxy properties and seed storage protein， so as to enhance the diversification of breeding products and enhance market competitiveness.

Key words： maize; seed storage protein; gliadin; end-use quality

玉米（Zea mays L.）是我國的第三大糧食作物，種植面積呈現逐年上升趨勢[1]。玉米起源于美洲，隨著人類對玉米的馴化，栽培逐漸發展成為糧飼（普通）玉米、糯玉米、甜玉米等類型[2]。糯玉米首次在中國發現，云南、廣西被認為是公認的糯玉米起源中心。研究表明，糯玉米（Zea mays L.sinensis Kulesh）由于籽粒淀粉類型多為支鏈淀粉，在支鏈淀粉提取中被廣泛應用，被我國農業合作社廣泛種植，地位逐漸上升[3]。隨著糯玉米的廣泛種植與應用，其形成的分子機理和表型特征也受到科研工作者的廣泛關注。

糯玉米9號染色體短臂上的Waxy基因發生功能缺失突變，導致GBSS1基因表達受到抑制，造成直鏈淀粉合成能力降低或缺失，從而產生籽粒蠟質、蒸煮后口感粘糯的表型[4]。但是，目前對于糯玉米籽粒儲藏蛋白與普通玉米籽粒儲藏蛋白在含量、種類上的差異研究鮮有報道。根據谷物籽粒蛋白的溶解性分類標準，可將作物籽粒蛋白分為溶于水的清蛋白（Albumin）、溶于NaCl的球蛋白（Globulin）、溶于醇類物質的醇溶蛋白（Gliadin）和溶于酸或者堿溶液的谷蛋白（Glutenin）[5-6]。其中，清蛋白和球蛋白為非儲藏蛋白，主要為細胞質中的酶類。玉米籽粒儲藏蛋白主要是醇溶蛋白，不含有谷蛋白。

按照分子量大小，玉米醇溶蛋白大體分為4類，即α（21～27 kDa）、β（17～18 kDa）、γ （27～28 kDa）和δ（10～14.4 kDa），不同醇溶蛋白之間存在相互作用[7-8]。編碼玉米醇溶蛋白基因數量范圍為75～100個，分布在玉米1、2、4、6、7、9號染色體上，其中編碼α醇溶蛋白的基因位于1、4、7號染色體上，編碼β醇溶蛋白的基因位于6號染色體上，編碼γ醇溶蛋白的基因位于2、7號染色體上，編碼δ醇溶蛋白的基因位于6、9號染色體上[9]。

目前，玉米上明確鑒定到的醇溶蛋白突變體約300個，包含opaque、emb、dek等。Opaque系列突變體為α醇溶蛋白隱性突變，通過減少α醇溶蛋白的含量，可以增加賴氨酸和色氨酸相對含量[10-12]。Floury為α醇溶蛋白半顯性突變，通過改變α醇溶蛋白的信號肽，可以改變其累積狀態[13-14]。Mucuronate（Mc）和De-B30突變體為顯性突變。這些突變體中，有些是蛋白的總量發生了變異，有些是氨基酸比例發生了變異。目前，關于這些突變體與玉米糯性之間的關系尚未見報道。floury2、floury4、De-B30和Mc為醇溶蛋白自身發生了變化，形成了粉質表型。這些基因的報道為研究糯性玉米種醇溶蛋白基因的表達變化提供了可能。

本研究以3個普通玉米、1個黃糯玉米、4個白糯玉米為研究對象，對其籽粒進行表型分析，明確其籽粒醇溶蛋白帶譜，進而以普通玉米B73和糯玉米SWL01為代表，對授粉后2、4、8、16、24 d的籽粒轉錄組數據進行籽粒不同發育時期的差異表達基因分析，從而明確糯玉米與普通玉米在基因表達上的差異，為糯玉米育種提供更多的基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為普通玉米自交系和糯玉米自交系，共8份玉米種子，由天津市農業科學院農作物研究所提供，2024年種植于天津市農業科學院農作物研究所植物生長室。

1.2 試驗方法

1.2.1 醇溶蛋白提取及鑒定（A-PAGE） （1）將種子研磨成粉末，放入2.0 mL離心管中。

（2）加入400 μL醇溶蛋白提取液（表1），90°放置在搖床上。室溫條件下，200 r·min^-1振蕩1 h，加入400 μL loading buffer（表2），12 000" r·min^-1離心2 min。

（3）采用A-PAGE電泳技術對醇溶蛋白帶譜進行鑒定。在30 mL預制膠溶液（表3）中加入75 μL H₂O₂，用藍槍頭快速攪拌均勻，并倒入兩板之間，插好梳子。待燒杯中殘留的膠液凝固后，拔掉梳子。

（4）加入1×A-PAGE電極液（表4，使用前將20×電極液稀釋為1×），電極液沒過膠孔。

（5）點樣：從左往右上樣，上樣4 μL。

（6）跑膠：電壓設置500 V，時間20 min。

（7）起膠、染色：考馬斯亮藍R-250染液（表2）沒過膠面，染色15 min。

（8）脫色、讀帶：將膠塊從染液中取出，放入清水中，脫色后讀帶，并記錄和照相。

1.2.2 玉米醇溶蛋白基因及Waxy基因信息 根據已經公布的玉米參考基因組（B73）調取玉米醇溶蛋白序列及Waxy基因（表5）。

1.2.3 轉錄組分析 （1）轉錄組數據來源于公共數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/，PRJNA625943）[3]，對測序獲得的原始數據進行過濾、處理后，得到后續分析使用的高質量數據。

（2）使用DESeq2.0軟件進行差異Unigene表達分析，以|log₂（Fold Change）|gt;1，且FDR≤0.01為標準，對玉米籽粒不同發育時期差異基因表達分析，同時對差異表達基因進行GO功能分析。

2 結果與分析

為了明確糯玉米與普通玉米的差異，本研究利用表型分析、籽粒儲藏蛋白帶譜分析、籽粒醇溶蛋白表達模式分析，對收集的3個普通玉米、1個黃糯玉米、4個白糯玉米自交系進行對比，探明普通玉米和糯玉米在籽粒及相關基因上的差異，挖掘糯玉米育種可用的基因資源，輔助玉米育種。

2.1 玉米醇溶蛋白組成分析

為了挖掘糯玉米與普通玉米的差異，探究糯玉米與普通玉米在籽粒上的不同表型，本研究對3個普通玉米、1個黃糯玉米、4個白糯玉米進行了表型差異分析。在籽粒顏色上，黃糯玉米與普通玉米外觀顏色接近，白糯玉米與普通玉米僅存在顏色差異（圖1-A）。通過橫切籽粒，筆者發現，普通玉米和糯玉米籽粒結構接近，均由外圍角質層和內部淀粉層組成（圖1-B）。因此，在外觀和內部結構上，糯玉米和普通玉米未見明顯差異。

由于玉米籽粒儲藏蛋白主要是醇溶蛋白，本研究進一步分析了玉米籽粒醇溶蛋白的組成。結果發現，玉米的醇溶蛋白遷移率低于小麥醇溶蛋白。同時，本研究發現，普通玉米和糯玉米在醇溶蛋白上沒有特定的類型分化（圖1-C），說明糯玉米和普通玉米在醇溶蛋白組成上可能不存在差異。

2.2 糯玉米和普通玉米籽粒種子差異表達基因分析

由于糯玉米和普通玉米在籽粒外觀、內部結構和醇溶蛋白帶譜上未見明顯差異，本研究利用公共數據庫數據，進一步分析了糯玉米和普通玉米授粉后籽粒不同發育時期的轉錄組，進一步探索籽粒糯性形成的機制，從而挖掘可用于輔助玉米品質育種的基因，最終服務于分子標記輔助育種。

本研究利用DEseq2.0對糯玉米自交系SWL01和普通玉米自交系B73籽粒授粉后的轉錄組數據進行分析（以|log₂FC|≥1，且FDR≥0.01為標準）。為避免遺傳背景差異導致誤差，筆者以SWL01和B73各自授粉0 d的籽粒作為對照，分別對授粉后2、4、8、16、24 d的籽粒轉錄組與對照進行差異表達基因分析。結果顯示，授粉后4 d，SWL01和B73差異表達基因數目均呈小幅度增長的趨勢，但授粉后8 d，差異表達基因的數目快速增長，說明經過授粉后短時間的準備，籽粒進入快速生長發育及分化時期。

在糯玉米SWL01和普通玉米B73差異基因的數量對比上，授粉后8、16、24 d， SWL01明顯高于B73；但在增長的幅度上，SWL01明顯低于B73（圖2-A）。授粉后8 d，SWL01上調差異表達基因數目為2 280個，下調差異表達基因數目為2 308個，共計4 588個；而普通玉米B73上調差異表達基因數目為1 104個，下調差異表達基因數目為1 613個，共計2 717個；同時期，糯玉米差異表達數目是普通玉米的1.69倍。授粉后16、24 d，糯玉米差異基因表達數目分別是普通玉米的1.73倍、1.42倍（圖2-B）。這說明糯玉米和普通玉米在基因表達模式上存在一定的差異。

2.3 差異基因GO功能分析

由于糯玉米和普通玉米在發育中基因表達模式存在差異，本研究進一步分析差異基因所在的信號通路。差異基因GO富集分析顯示，授粉后2 d，普通玉米差異基因主要富集在與糖類物質積累轉運相關的信號通路上（GO：0050224、GO：0047668、GO：0033956、GO：0016798和GO：008422），而糯玉米SWL01僅有1個與糖相關的信號通路（GO：0008515）被富集（圖3-A）。這說明在籽粒發育過程玉米黏性的基礎上，通過對糯玉米籽粒醇溶蛋白的組成和含量的分析，可進一步拓寬糯玉米的研究思路，為糯玉米育種提供新的研究方向。

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