白蕓豆淀粉酶抑制劑提取工藝優化及與左旋肉堿復配物功效評價

摘" " 要：為優化白蕓豆淀粉酶抑制劑提取物（α-AI）的提取工藝，并探究白蕓豆α-AI-左旋肉堿復配物的減質量效果及安全性，以白蕓豆α-AI提取物活性為檢測指標，以白蕓豆粉碎粒度、浸提液pH、料液比、浸提溫度、浸提時間為單因素，在單因素的基礎上設計響應面優化白蕓豆α-AI提取工藝；通過減肥功能評價方法、大鼠急性經口試驗，驗證復配物的減質量效果及安全性。結果表明：白蕓豆提取物在浸提粉碎粒度為80目、浸提液pH值為6、溫度為53℃、浸提時間為3.3 h、料液比為1：7條件下提取工藝最佳；對照組與模型組體質量差異顯著，且復配物的急性毒性試驗未見異常。本研究可為白蕓豆提取物的高效提取及減質量配方的開發提供新思路與數據支撐。

關鍵詞：白蕓豆；淀粉酶抑制劑提取物；提取工藝優化；左旋肉堿；減肥功效

中圖分類號：Q51；S643.1" " " " " 文獻標識碼：A" " " " "DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2024.06.013

Optimization of Extraction Process for α-AI from White Kidney" Beans and Evaluation of Its Efficacy in Combination with L-carnitine

AN Qi DU Yang

（1. Beijing Shijing Technology Company Limited， Beijing 102400， China; 2. Institute of Food and Nutrition Development， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Beijing 100801， China）

Abstract： To optimize the extraction process of white kidney bean amylase inhibitor extract （α - AI） and explore the weight loss effect and safety of white kidney bean α - AI - L-carnitine complex， this study used the activity of white kidney bean α - AI extract as the detection indicator， and used white kidney bean powder particle size， extraction solution pH， solid-liquid ratio， extraction temperature， and extraction time as single factors. Based on these single factors， a response surface methodology was designed to optimize the extraction process of white kidney bean α - AI. Verify the weight loss effect and safety of the compound through weight loss function evaluation methods and acute oral tests in rats. The results showed that the optimal extraction process for white kidney bean extract was as follows： extraction powder with a particle size of 80 mesh， extraction solution pH=6， temperature of 53 ℃， extraction time of 3.3 hours， and solid-liquid ratio of 1：7. There was a significant difference in body weight between the control group and the model group， and no abnormalities were observed in the acute toxicity test of the compound. This study can provide new ideas and data support for the efficient extraction of white kidney bean extract and the development of weight loss formulas.

Key words： white kidney bean extract; response surface; L-carnitine; weight loss

隨著人們生活水平的提高，膳食搭配不合理、飲食不規律、運動量少等因素導致體內脂肪組織過量堆積，肥胖人群急劇增加[1-2]。肥胖不僅影響體態，還會引發一系列心腦血管疾病，例如高血壓、高血脂等，被公認為是威脅人體健康的重要因素。因此，消費者對低糖、低GI食品，以及具有減肥功效的食品需求不斷升高，探究安全高效的減質量功能成分及提取工藝意義重大[3-4]。

白蕓豆（Phaseolus vulgaris L.）又稱四季豆[5]，含有豐富的蛋白質、脂肪、多種維生素、礦物質成分，具有極高的藥用價值和保健功效[6-9]。研究表明，白蕓豆具有降血脂、減肥、降糖和調節腸道菌群等多種保健功效[10-11]，且功效主要來源于α-淀粉酶抑制劑（α-amylase inhibitor， α-AI）[12]。α-AI是一種酶抑制活性強、安全性高的復合糖蛋白，餐前服用相應劑量可抑制淀粉的吸收與轉化，從而達到血糖控制和減質量作用，具有廣泛的應用和開發前景[13-16]。此外，左旋肉堿（L-carnitine）是一種類氨基酸，它可以使機體水分和肌肉質量不變的條件下，將體內脂肪轉化為能量，由此達到降脂減肥的保健功能[17-21]。研究表明，左旋肉堿使用安全、效果顯著，是一種安全、天然、高效、無毒副作用的減肥營養補充品[22-23]。

因此，本研究通過單因素試驗和響應面法優化白蕓豆提取物的提取條件，進一步探究白蕓豆提取物與左旋肉堿聯用的協同作用，以期為減質量配方的研發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料包括白蕓豆（產地云南，線上購買）、左旋肉堿白蕓豆減肥咀嚼片（北京澳特舒爾保健品開發有限公司）、α-淀粉酶（50 U·mg^-1，美國Sigma公司）、可溶性淀粉（天津市精細化工研究所）、碘（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）、磷酸氫二鈉、乙醇、檸檬酸、氫氧化鈉、碘化鉀（均為分析純，上海易恩化學技術有限公司）、濃鹽酸（北京市通廣精細化工公司）。

1.2 試驗儀器

試驗儀器包括：A11高速多功能粉碎機（德國 IKA 公司）、SIGMA3-16P高速離心機（美國 Sigma 公司）、1550型酶標儀（賽默飛世爾科技公司）、ML204電子分析天平（梅特勒-托利多（上海）有限公司）、HS-7 磁力攪拌器（德國 IKA 公司）、3-16P電熱恒溫水浴鍋（科偉自動化設備有限公司）、B-100 旋轉蒸發儀（瑞士BUCHI）、DHG-9123A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 白蕓豆提取物粗提液的制備 精選顆粒飽滿、白而亮的白蕓豆，用高速粉碎機將白蕓豆打碎成粉，過40目篩，準確稱取白蕓豆粉50 g，水提，料液比為1∶5（W/V），pH 值為6.0，將樣品液于55 ℃水浴中提取2 h，4 200 r·min^-1離心10 min，取上清液；在55 ℃、90 Mpa條件下，將上清液旋轉蒸發至原體積的80%，所得液體即為粗提液[24]。

1.3.2 白蕓豆提取物酶抑制活性的檢測 參照T/CCCMHPIE 1.26—2018《植物提取物 白蕓豆提取物》并稍作修改。各溶液加入量及加入順序按照表1進行。混酶液37 ℃水浴溫度預熱8 min后加入混勻，將試管于相同水浴溫度下反應5 min，以稀鹽酸滅活，終止反應。取反應后的溶液與稀碘液混合顯色，660 nm處測樣品吸光度（A），同時作標準曲線圖。淀粉酶抑制活性按公式（1）計算。

U·mL^-1=A₂-A₁/M_取樣量×B×342.3×T103×106 （1）

式中，M_取樣量為白蕓豆提取物的取樣量（mL）；B為淀粉標準曲線回歸方程中的斜率；A1為淀粉酶對照品的吸光度；A2為白蕓豆提取物的吸光度；342.3為麥芽糖的摩爾質量（g·mol^-1）；T為反應時間（min）；U·mL^-1表示1 mL白蕓豆提取物在37 ℃、pH值為6.0的條件下，1 min內抑制a-淀粉酶將淀粉鏈切斷成1微摩爾（μmol）麥芽糖的量，即為淀粉酶抑制劑活性。

1.3.3 白蕓豆提取物單因素響應面優化試驗 單因素試驗分別考察白蕓豆提取物提取過程中5個因素，各因素水平見表2。

在單因素試驗基礎上，選取適宜參數范圍，以α-AI的抑制率為評估指標，針對白蕓豆提取工藝的中浸提溫度（A）、浸提時間（B）、料液比（C）3個指標進行Box-Behnken試驗優化，并對響應面試驗結果進行驗證。響應面因素與水平設計見表3。

1.3.4 大鼠急性經口毒性試驗 SD雄性大鼠75只，體質量范圍為140～170 g，生產許可證號為：SCXK（京）2021-0011，SPF級（北京維通利華實驗動物技術有限公司）。試驗過程符合動物倫理學要求。

樣品處理：由于白蕓豆提取物-左旋肉堿復配物成品人體攝入量較大，故試驗中使用去除全部輔料的非定型樣品，即非定型樣品3.199 8 g相當于成品9.000 0 g，非定型樣品為類白色顆粒。成人體質量按60 kg計算，折合劑量為0.053 33 g·kg^-1，現用現配。

大鼠急性經口毒性試驗選用SD大鼠共20只，雌雄各半，體質量范圍為191.1～212.4 g；在預試驗的基礎上，正式試驗按限量法將11.00 g·kg^-1（相當于成品劑量30.94 g·kg^-1，為人體推薦用量的206倍）作為灌胃劑量。稱取樣品110.00 g，用蒸餾水配制成濃度55.0%的混懸液。大鼠灌胃前禁食16 h，自由飲水，按20 mL·kg^-1劑量一次性灌胃樣品。灌胃后第7天和第14天稱量大鼠體質量。試驗結束后，將動物進行大體解剖[25]。

1.3.5 對體質量的影響 樣品：定型樣品為片劑。定型樣品中，左旋肉堿酒石酸鹽、白蕓豆提取物折合人體用量分別為2、1 g·d^-1，另外添加輔料組成。實驗動物：西安交通大學醫學部實驗動物中心提供的SD大鼠（質量合格證號：3 251、3 260）。高熱量模型飼料（北京科澳協力飼料有限公司提供，SPF級）：維持飼料中添加蔗糖15.0%、豬油15.0%、酪蛋白、磷酸氫鈣等，各指標均達到維持飼料的國家標準。維持飼料熱量3.4 Kcal·g^-1，高熱量飼料熱量4.29 Kcal·g^-1。

按預防肥胖模型法進行試驗。觀察適應5 d后，設計4.50 g·kg^-1、1.50 g·kg^-1、0.75 g·kg^-1 3個劑量組，同時設置及預防肥胖模型對照組（以下稱“模型對照組”）、空白對照組（純水）。按組分別給大鼠灌胃（10 mL·kg^-1），每組10只。選擇體質量范圍為183.1～215.7 g的大鼠70只，按體質量隨機分成2組，模型組大鼠60只進行高熱量飼料喂養，空白對照組大鼠10只進行飼料喂養。每2周根據體質量淘汰1/3增質量較少的肥胖抵抗大鼠，并將剩余大鼠按體質量隨機分成4組。每周記錄給食量、撒食量、剩食量，并稱量體質量[26]。

1.4 數據處理

本研究采用Design Expert 12軟件設計響應面試驗，采用Excel整合與分析數據匯總、制作單因素折線圖，用SPSS 17.0 軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 粉碎粒度對提取結果的影響 如圖1所示，隨著粉碎程度的增加，白蕓豆粉的細度逐漸增大，白蕓豆酶抑制活性逐漸升高，從（389.3±0.021） U·mL^-1升高到（420.9±0.018） U·mL^-1。白蕓豆粉碎程度范圍為40～80目時，酶抑制活性的升高程度不大；當粉碎程度從80目升高到120目時，酶抑制活性有明顯上升，這與王靖銥[24]等試驗結果相似。原因可能是隨著粉碎程度的增大，雜質被篩除，白蕓豆粉顆粒表面阻止α-AI溶出的物質被粉碎，α-AI的溶出度增加，從而酶抑制活性升高。因此，確定白蕓豆粉碎粒度為120目。

2.1.2 浸提pH對提取結果的影響 如圖2所示，pH值為2時，酶抑制活性極低接近于0；pH值為2～4時，酶抑制活性隨著pH值的增加呈急劇升高的趨勢，在pH值為6的弱酸性條件下，酶抑制活性最高，為（388.1±0.044）U·mL^-1；pH值為6～8時，隨著堿性的增強，酶抑制活性逐漸降低。原因可能是偏酸條件更接近α-淀粉酶抑制劑的等電點，多余的雜質蛋白被清除，使白蕓豆中糖蛋白溶出充分；而過酸或者過堿的環境破壞了α-AI的結構，導致其變性，從而使酶抑制活性降低[27]。

2.1.3 浸提溫度對提取結果的影響 由圖3可知，在40～55 ℃溫度區間內，隨著溫度的升高，白蕓豆α-AI的酶抑制活性隨之升高；在50～55 ℃溫度區間內，酶抑制活性變化尤其顯著，由（352.6±0.052）U·mL^-1升高至（403.3±0.036）U·mL^-1，在55 ℃時達到最高值；當溫度高于55℃時，酶抑制活性逐漸下降，最終降低至376.9 U·mL^-1。原因可能是溫度過高，導致α-AI被滅活，從而減弱了白蕓豆提取物活性[28]。

2.1.4 浸提時間對提取結果的影響 如圖4所示，隨著浸提時間由0.5 h增加到3 h，α-AI的酶抑制活性顯著升高，與浸提時間呈正相關關系；浸提時間2 h與3 h時酶抑制活性升高速度減慢，并且在3 h達到最高值，為（392.2±0.048）U·mL^-1；浸提時間超過3 h后，隨著浸提時間的增加，酶抑制活性逐漸下降。原因可能是提取時間的延長，溶出了一些非目標成分，溶液中雜質含量增多，從而導致白蕓豆提取物活性減弱[29]。

2.1.5 料液比對提取結果的影響 如圖5所示，隨著料液比由1∶4增加到1∶8時，α-AI的酶抑制活性逐漸升高，呈正相關關系；料液比由1∶6增加到1∶7時，酶抑制活性顯著升高，且在料液比1∶8時，白蕓豆α-AI的酶抑制活性達到最高，為（418.7±0.023）U·mL^-1；此后隨著料液比的增加，酶抑制活性逐步降至（383.6±0.037）U·mL^-1。原因可能是隨著料液比的提高，α-AI溶出量增大，而隨著料液比持續升高，溶出量達到峰值后被稀釋，白蕓豆提取物酶抑制活性隨之降低[30]。

2.2 Box-Behnken試驗結果與分析

2.2.1 試驗結果及方差分析 利用Design Expert 12 軟件，設計Box-Behnken中心組合試驗，以酶抑制活性為響應值，優化白蕓豆α-AI酶抑制劑提取工藝的參數，共設計17組試驗。響應面試驗組設計表與各試驗組檢測結果見表4，方差分析見表5。

本研究利用Design Expert 12對表4數據進行多元二次回歸擬合，得到Y對A、B、C的響應回歸方程：

Y=386.52+7.4A+6.23B-0.250 0C+6.35AB-2.75AC+33.25BC-15.96A²-44.16B²-54.36C²

由表5可知，Plt;0.000 1，表明響應面建模型可靠性較高，回歸方程的擬合度較好；模型的相關性系數R2值為0.930，說明響應面白蕓豆提取物酶抑制活性預測值與試驗值有較好的相關性[31]；模型的大部分二次項P值達到極顯著水平，說明試驗考察的3個因素對響應值的影響較大[32]。3個因素對白蕓豆α-AI酶抑制活性影響的顯著程度為Bgt;Agt;C，即浸提時間gt;浸提溫度gt;料液比。

2.2.2 響應面分析 本研究利用Box-Behnken試驗對響應面試驗結果進行優化，結果如圖6、圖7、圖8所示。最佳工藝參數如下：浸提溫度為52.96 ℃、浸提時間為3.32 h、料液比為1∶7.14，白蕓豆α-AI酶抑制活性預測值為407.7 U·mL^-1。為便于開展試驗研究， 調整最佳工藝條件如下：料液比為1∶7、水浴溫度為53 ℃、浸提時間為3.3 h。

2.2.3 結果驗證 根據試驗預測的最佳檢測條件進行驗證試驗， 結果見表6。3次重復試驗測得的白蕓豆α-AI酶抑制活性平均值為（411.3±0.013）U·mL^-1，與預測值接近、重復性良好。這表明本試驗應用響應面優化后的白蕓豆提取物提取工藝穩定、提取率高。2.3 白蕓豆提取物-左旋肉堿復配物大鼠急性經口毒性試驗

采用優化后的工藝提取白蕓豆α-AI，并以白蕓豆提取物：左旋肉堿酒石酸用量比為1∶2制備組合物。由表7可知，按限量法將11.00 g·kg^-1（相當于人體推薦用量的206倍）劑量的樣品進行大鼠灌胃后，動物生長良好，未見動物有明顯中毒癥狀，14 d后無動物死亡。解剖后，筆者觀察到大鼠心、肝、脾、腎、胃、肺、腸等主要臟器均未見明顯異常改變，見圖9。結果表明，該樣品對雌雄大鼠急性經口毒性LD50均大于11.0 g·kg^-1。根據GB15193.3—2014《食品安全國家標準 急性經口毒性試驗》急性毒性（LD50）劑量分級標準，白蕓豆提取物-左旋肉堿復配物大鼠急性經口毒性屬實際無毒級。

2.4 白蕓豆提取物-左旋肉堿復配物對大鼠體質量及體質量增質量的影響

由表8可知，造模篩選期結束，模型對照組大鼠體質量高于空白對照組（Plt;0.05），而與其他各劑量組之間差異不顯著（Pgt;0.05）。試驗期各劑量組大鼠體質量均低于模型對照組，且高劑量組第4、5、6周體質量與模型對照組比較，差異均有顯著性（Plt;0.05、Plt;0.01），高劑量組與模型對照組間差異極顯著（Plt;0.01）。

3 討論與結論

3.1 白蕓豆α-AI提取工藝優化

白蕓豆α-AI淀粉酶抑制劑有良好的抑制淀粉吸收和抑制血糖升高的作用，且天然、綠色、安全，故優化白蕓豆淀粉酶抑制提取工藝對食品領域研究和行業發展有著重要的意義[33-34]。本研究采用單因素響應面方法對白蕓豆α-AI淀粉酶抑制劑的提取工藝進行優化。單因素試驗表明，提取過程中對白蕓豆α-AI酶抑制活性影響最顯著的因素為浸提時間，其次是浸提溫度和料液比。

吳葉[35]研究證明，白蕓豆α-AI淀粉酶抑制劑在浸提2 h、50 ℃條件下具有最高的抑制率，且在80 ℃條件下作用2 h，抑制率僅下降20%，證明白蕓豆α-AI具有較強的熱穩定性。楊明琰[36]認為，白蕓豆α-AI是結構均一的糖蛋白，熱穩定性高于一般蛋白質，而且70 ℃為白蕓豆淀粉酶抑制劑的最適溫度。遲永楠等[28]研究表明，白蕓豆α-AI最適溫度為55 ℃，最佳提取時間為6 h，最佳物料比為1∶6（白蕓豆粉：水），這為本研究的結果提供了重要的支撐。本研究中，經過單因素驗證后得到的最適溫度同樣是55 ℃，最佳提取時間為3 h。趙蓉[37]研究發現，料液比為1∶6時，提取率達到最大值后趨于平穩，這是因為增加溶劑用量，濃度差提高，利于傳質，而當料液比逐漸增大提取得率反而降低，這與本研究單因素料液比的變化趨勢相同。根據單因素結果，選擇3個主要影響因素進行響應面試驗，依照優化后的工藝所制樣品酶抑制活性與預測值匹配，得到的提取物具有更強的酶抑制效果，且提取工藝穩定性明顯高于優化前。

3.2 白蕓豆提取物-左旋肉堿復配的急性毒性試驗與減質量功效

本研究中，以白蕓豆提取物-左旋肉堿復配的組合物為對象，探究其安全性和減質量功效。白蕓豆提取物-左旋肉堿復配物進行大鼠灌胃后，未見明顯中毒癥狀，無動物死亡，證明急性經口毒性屬實際無毒級。經過造模，模型對照組大鼠體質量大于空白對照組，試驗期各劑量組大鼠體質量均低于模型對照組，高劑量組第4、5、6周體質量與模型對照組比較，差異顯著，高劑量組大鼠體質量增質量與模型差異極顯著，證明組合物具有減質量效果。蘆宇婷等[38]研究表明，組合物具有良好的減肥功效，這與本研究結果一致。

3.3 結論

綜上所述，提取過程中對白蕓豆α-AI酶抑制活性影響的顯著程度為浸提時間gt;浸提溫度gt;料液比。白蕓豆提取物在浸提粉碎粒度為80目、浸提液pH值為6、溫度為53 ℃、浸提時間為3.3 h、料液比為1∶7條件下提取工藝最佳；白蕓豆提取物-左旋肉堿復配物天然、安全，具有良好的減質量效果。本研究為多物質復配綜合增強減質量功效的思路與研究方向做了初步探索并提供理論與數據支撐。

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